Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת נוקשות הכבד באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63974
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 1, 1
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

Summary

אנו מציגים פרוטוקול למדידת המודולי האלסטי של אזורים עשירים בקולגן בכבד רגיל וחולה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי. השימוש בו זמנית במיקרוסקופיית קיטוב מספק דיוק מרחבי גבוה ללוקליזציה של אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.

Abstract

התקשות מטריקס הוכרה כאחד המניעים העיקריים להתקדמות פיברוזיס בכבד. יש לו השפעות עמוקות על היבטים שונים של התנהגות התא, כגון תפקוד התא, התמיינות ותנועתיות. עם זאת, מכיוון שתהליכים אלה אינם הומוגניים בכל האיבר, חשוב יותר ויותר להבין את השינויים בתכונות המכניות של הרקמות ברמה התאית.

כדי להיות מסוגל לעקוב אחר התקשות של אזורים עשירים בקולגן בתוך אונות הכבד, מאמר זה מציג פרוטוקול למדידת מודולי אלסטיות של רקמת הכבד בדיוק מרחבי גבוה על ידי מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM). AFM היא שיטה רגישה בעלת פוטנציאל לאפיין תכונות מכניות מקומיות, המחושבת כמודולוס של יאנג (המכונה גם אלסטי). AFM בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב יכולים לשמש לאיתור ספציפי של אזורי התפתחות פיברוזיס בהתבסס על השבירה הדו-שבירה של סיבי קולגן ברקמות. באמצעות הפרוטוקול המוצג, אפיינו את הנוקשות של אזורים עשירים בקולגן מכבדי עכברים פיברוטיים ואזורים מקבילים בכבדים של עכברי בקרה.

עלייה בולטת בנוקשות של אזורים חיוביים לקולגן נצפתה עם התפתחות פיברוזיס. הפרוטוקול המוצג מאפשר שיטה ניתנת לשחזור של מדידת AFM, בשל השימוש ברקמת כבד קבועה קלות, שניתן להשתמש בה כדי לקדם את ההבנה של שינויים יזומים של מחלות בתכונות מכניות של רקמות מקומיות והשפעתם על גורלם של תאים שכנים.

Introduction

הכבד הוא איבר חיוני לשמירה על הומאוסטזיס באורגניזמים 1,2. מחלות כבד כרוניות אחראיות ל~2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולםמדי שנה 3. מקורם הנפוץ ביותר כזיהומים ויראליים, הפרעות אוטואימוניות, תסמונות מטבוליות או מחלות הקשורות לשימוש באלכוהול והם מלווים בפיברוזיס כבד מתקדם. פגיעה בכבד מעוררת תגובה דלקתית, מה שמוביל להפעלת תאים המפקידים מטריצה חוץ-תאית (ECM) בתגובה לריפוי פצעים. עם זאת, בנוכחות עלבון כרוני, עודף ECM יוצר רקמת צלקת לא פתורה בתוך הכבד, המוביל להתפתחות של פיברוזיס הכבד, שחמת הכבד, קרצינומה בכבד, ובסופו של דבר, לאי ספיקת כבד4.

פגיעה בהפטוציטים גורמת באופן מיידי לנוקשות מוגברת בכבד 5,6. זה משפיע ישירות על תפקוד הפטוציטים, מפעיל תאים סטלטים בכבד (HSCs) ופיברובלסטים פורטליים, וגורם לטרנס-דיפרנציאציה שלהם למיופיברובלסטים המכילים קולגן 7,8. התצהיר של ECM סיבי מגביר עוד יותר את נוקשות הכבד, ויוצר לולאת משוב המגבירה את עצמה של התקשות הכבד והפעלת תאים המייצרים מטריצה.

נוקשות הכבד הפכה, אם כן, לפרמטר חשוב בפרוגנוזה של מחלות כבד. את השינוי בתכונות הרקמה הביומכנית ניתן לזהות מוקדם יותר מאשר פיברוזיס ניתן לאבחן על ידי ניתוח היסטולוגי. לכן, טכניקות שונות למדידת נוקשות בכבד פותחו הן ביישומים מחקריים והן ביישומים קליניים. במסגרות קליניות, אלסטוגרפיה חולפת (TE)9,10,11,12,13 ואלסטוגרפיה של תהודה מגנטית (MRE)14,15,16,17,18 שימשו לאבחון לא פולשני של שלבים מוקדמים של נזק לכבד על ידי בדיקת נוקשות כבד גולמית 19.

ב- TE, גלי אולטרסאונד בעלי משרעת קלה ותדר נמוך (50 הרץ) מופצים דרך הכבד, ומהירותם נמדדת, המשמשת לאחר מכן לחישוב מודולוס אלסטי רקמה13. עם זאת, טכניקה זו אינה שימושית עבור חולים עם מיימת, השמנת יתר, או חללים intercostal נמוך יותר עקב שידור לא תקין של גלי אולטרסאונד דרך הרקמות המקיפות את הכבד9.

MRE מבוסס על שיטות הדמיה בתהודה מגנטית ומשתמש בגלי גזירה מכניים של 20-200 הרץ כדי לכוון לכבד. לאחר מכן נעשה שימוש ברצף הדמיה מסוים של תהודה מגנטית כדי לעקוב אחר הגלים בתוך הרקמה ולחשב את נוקשות הרקמה16. ערכי הנוקשות שדווחו בטכניקות TE ו-MRE מתואמים היטב עם מידת הפיברוזיס בכבד המתקבלת מביופסיות של דגימות כבד אנושיות המדורגות באמצעות ציוני METAVIR היסטולוגיים20 (טבלה 1). TE ו- MRE הותאמו גם למדידת נוקשות הכבד במודלים של מכרסמים למטרות מחקר21,22,23. עם זאת, מכיוון ששתי השיטות שואבות את ערכי הנוקשות מתגובת הרקמה לגלי הגזירה המתרבים, ייתכן שהערכים המתקבלים אינם משקפים את הנוקשות המכנית המוחלטת של הרקמה.

לצורך אפיון מכני ישיר של כבדי מכרסמים, פיתחו בארנס ואחרים בדיקת מודל-ג'ל-רקמה (בדיקת MGT) הכוללת הטבעה של רקמת כבד בג'ל פוליאקרילאמיד24. ג'ל זה נדחס על ידי כוח אחיד פועם שממנו ניתן לחשב את המודולוס של יאנג. בדיקת MGT מראה מתאם טוב עם בדיקת כניסה המותאמת לכבד רגיל ופיברוטי24 (טבלה 1).

טבלה 1: ערכי נוקשות הכבד ברמת התפזורת. TE ו- MRE בהשוואה למדידות מכניות ex vivo ישירות של מודולי אלסטי בכבד באמצעות הזחה ומבחני MGT עבור כבדים ממקורות שונים. היחס בין E ל-G נתון על ידי E = 2G (1 + v), כאשר v הוא היחס של פואסון למדגם; F0 עד F4 מייצגים את ניקוד הפיברוזיס במערכת הניקוד METAVIR, כאשר F0 מציין פיברוזיס נמוך או ללא כבד וכבד צ'ירוטי F4. קיצורים: TE = אלסטוגרפיה חולפת; MRE = אלסטוגרפיה של תהודה מגנטית; MGT = מודל-ג'ל-רקמה; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); G = מודולוס גזירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

אחד החסרונות העיקריים של מדידות נוקשות כבד גנריות הוא שהן אינן מספקות רזולוציה ברמת התא של הטרוגניות הנוקשות בכבד. במהלך התקדמות הפיברוזיס, אזורים עשירים בקולגן מראים קשיחות גבוהה יותר בהשוואה לפרנכימה25,26 שמסביב. שיפוע נוקשות זה משפיע באופן מקומי על התאים התושבים וממלא תפקיד חשוב בהנעת הטרוגניות HSC27. לפיכך, שינויים בתכונות המכניות המקומיות במהלך התפתחות מחלות כבד צריכים להיות מאופיינים ברמה מיקרוסקופית כדי להבין טוב יותר את התקדמות הפיברוזיס.

AFM מאפשר למדוד את התכונות המכניות של הרקמה ברזולוציה גבוהה וברגישות כוח גבוהה. AFM משתמש בקצה של קנטילבר כדי להסיט פנימה את פני השטח של דגימה עם כוחות נמוכים כמו כמה פיקונוויטונים, מה שגורם לעיוות ברמה מיקרוסקופית או ננוסקופית בהתבסס על הגיאומטריה והגודל של הקצה שבו נעשה שימוש. תגובת הכוח של הדגימה לזן המופעל נמדדת לאחר מכן כסטייה בקנטילבר28. עקומות תזוזה בכוח נאספות מהגישה והנסיגה של הקנטילבר, אשר ניתן להתאים מודלים מתאימים של מכניקת מגע כדי להעריך את הנוקשות המקומית של הדגימה29.

בנוסף למדידת הנוקשות של אזור נתון, AFM יכול גם לספק מידע טופוגרפי על תכונות ספציפיות בדגימה, כגון המבנה של סיבי קולגן30,31,32. מחקרים רבים תיארו את היישום של AFM למדידת הנוקשות של רקמות בריאות וחולות שונות, כגון עור 32,33, ריאה 34,35, מוח36, יונק37,38,39, סחוס 40, או לב41,42,43,44 מדגימות מודל של מטופלים ועכברים. יתר על כן, AFM שימש גם במבחנה כדי לקבוע את הנוקשות של תאים ופיגומי חלבון חוץ-תאיים45,46,47.

מדידת התכונות המכניות של דגימות ביולוגיות באמצעות AFM אינה טריוויאלית בשל רכותן ושבריריותן. לפיכך, מחקרים שונים תיקנו תנאים והגדרות שונות, אשר מניבים ערכים משתנים באופן נרחב של מודולי יאנג (שנסקרו על ידי Mckee et al.48). בדומה לרקמות רכות אחרות, גם ערכי המודולוס של הכבד יאנג בדרגות שונות של פיברוזיס בכבד מראים שונות רבה (טבלה 2). ההבדלים בערכי המודולוס של יאנג נובעים מהבדלים באופן פעולת AFM, קצה קנטילבר, שיטת הכנת הדגימה, עובי הדגימה, עומק וכוחות הכניסה, סביבת רקמת הכבד במהלך המדידה ושיטת הניתוח (טבלה 2).

טבלה 2: ערכי נוקשות הכבד ברמה התאית. ערכי קשיחות הכבד המתקבלים באמצעות AFM מתארים את התכונות המכניות של הכבד ברמה התאית. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; E = מודולוס אלסטי (של יאנג); PFA = פרפורמלדהיד; PBS = מלח חצוב פוספט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידה ניתנת לשחזור של מודולי יאנג של אזורים פיברוטיים עשירים בקולגן ברקמת הכבד על ידי AFM עם לוקליזציה מדויקת המסופקת על ידי שימוש במיקרוסקופיית קיטוב. נתנו פחמן טטרה-כלוריד (CCl 4) כדי לגרום לתצהיר קולגן באופן צנטרילובולרי49 במודל עכבר, תוך חיקוי אמין של היבטים חיוניים של פיברוזיס כבד אנושי50. תמונות מיקרוסקופיות מקוטבות מאפשרות הדמיה של קולגן בכבד עקב השבירה הדו-פרצופית של סיבי הקולגן51, המאפשרת מיקום מדויק של קצה הקנטילבר מעל אזור העניין הרצוי בתוך אונת הכבד52.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לגנטיקה מולקולרית ועל פי הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU לניסויים בבעלי חיים. דיאגרמה סכמטית כוללת של הפרוטוקול המוצג מוצגת באיור 1.

Figure 1
איור 1: סכמטיות כוללת של הערכת AFM של המודולוס של יאנג מכבדי עכברים. (A) בידוד הכבד מעכברי בקרה או עכברים מטופלים ולאחר מכן חתך ואחסון בטמפרטורה של 80°C- (אחסון מרבי, שבועיים). (B) הצמדת החרוז הכדורי לקנטילבר עם ריפוי הדבק לאחר מכן למשך הלילה (משמאל). כיול קנטילבר ואחריו הרכבה לדוגמה (מימין). (C) יישור המקטב והמנתח כדי להמחיש מבני קולגן בהירים ולאחר מכן שכבת-על של התמונה במצלמה עם שדה המדידה מתחת ל-AFM. (ד) רכישת מפות קשיחות וניתוחן. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; PBS = מלח חצוב פוספט; OCT = תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית; CCl4 = פחמן טטרה-כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. הכנה לדוגמה I

  1. כריתת הכבד מהבטן הפתוחה של עכבר שהומתה על ידי נקע צוואר הרחם בהרדמה. לבודד את האונה הצידית השמאלית ולהטמיע את החצי הצדדי של האונה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על ידי הקפאה מהירה על קרח יבש. אחסן את הרקמה המשובצת OCT בטמפרטורה של −80 °C.
    הערה: מחקרים קודמים הראו כי ערכי הנוקשות דומים בין רקמות קפואות וטריות25,26.
  2. מקטע 30 מיקרומטר מקטעי כבד עבה על שקופיות טעונות חיובית באמצעות cryotome ולאחסן את השקופיות ב -80 מעלות צלזיוס עד ליום מדידת AFM לא יותר מ 2 שבועות מכאן.

2. הגדרת המכשיר

  1. חיבור של חרוז בגודל 5.7 מיקרומטר לקצה הכנף של AFM (איור משלים S1, שלבים 1-5)
    הערה: ההצמדה של החרוז לקנטילבר תוארה בעבר גם על ידי נורמן ואחרים 46.
    1. פזרו את התרחיף של חרוזי שרף מלמין בקוטר 5.7 מיקרומטר באופן שווה על מחצית השטח של מגלשת זכוכית וייבוש באוויר כדי לאדות את הממס (איור משלים S1, שלב 1).
    2. בחצי השני של השקופית, באמצעות קצה של 10 μL, צור קו דק של שרף אפוקסי מעורבב מראש עם זמן עבודה ארוך (איור משלים S1, שלב 1).
    3. טען את הגשושית על ראש ה- AFM בהתאם להוראות היצרן.
    4. הרכיבו את המגלשה וכסו אותה בראש ה-AFM המצויד בבדיקת ה-cantilever.
      הערה: במחקר נעשה שימוש בקנטילבר SD-qp-BioT-TL-10.
    5. מביאים את דבק שרף האפוקסי המעורבב מראש למרכז המגלשה ומתקרבים לדבק עם הקנטילבר בכוח נמוך (קבעו את ה-setpoint ל-1 V כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה; איור משלים S1, שלב 2).
      הערה: לפני ההתקרבות למשטח ההחלקה, ודא שהלייזר מיושר במרכז קצה הקנטילבר, המסומן על-ידי מתח סכום גבוה על-ידי ביצוע שלבים 6-8 בסעיף 2, חלק 3, כיול קבוע הקפיץ של תותח ה-AFM.
    6. לאחר שקצה הבדיקה יוצר מגע עם הדבק, הזיזו אותו בדיוק מעל המגלשה כדי להסיר את עודפי הדבק.
    7. כעת, החזירו את קצה השקופית מהשקופית והזיזו את השקופית כדי להביא חרוז בודד למרכז (איור משלים S1, שלב 3). התקרב שוב לחרוז עם גשושית הקנטילבר AFM בכוח גבוה יותר (setpoint 2 V) כדי לחבר את החרוז במרכז הגשושית ולהשאיר אותו לפחות 10 שניות (איור משלים S1, שלב 4).
    8. חלצו את הבדיקה ושמרו אותה למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי להקשיח את הדבק או עקבו אחר ההוראות עבור שרף האפוקסי (איור משלים S1, שלב 5).
  2. הגדרת המקטב והמנתח
    1. כדי לאתר את תחומי העניין בתוך מקטעי הכבד, הגדר את המיקרוסקופ עם המקטב והמנתח. יישר את אזימוטי הרטט שלהם בזווית שבין 0° ל-90° זה לזה על ידי סיבוב אחד מהם ביחס לשני באופן ידני או באופן אוטומטי כדי למזער את האור המועבר ולמקסם את הקרניים יוצאות הדופן העוברות דרך המטרה. ודאו שסיבי הקולגן נראים בהירים על רקע כהה בתמונה המקוטבת (איור 2), מה שמשתקף על-ידי תזוזה בשיא ההיסטוגרמה של התמונה לכיוון פיקסלים בהירים.

Figure 2
איור 2: תמונות מיקרוסקופיה מייצגות מראות הדמיה בולטת של סיבי קולגן במיקרוסקופיה מקוטבת, בהשוואה לתמונות שדה בהיר. מקטעי כבד מעכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות עברו (A) מיקרוסקופיה מקוטבת ו-(B) מקוטבת. סיבי קולגן דו-צדדיים נראים בבירור בלבן בתמונות מקוטבות בהשוואה לתמונות שדה בהיר. הקופסה האדומה מייצגת אזור עשיר בקולגן המשמש למדידת AFM. כניסות מציגות תצוגות מוגדלות של האזור בתיבה האדומה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; CCl 4 = פחמן טטרה-כלוריד; CV = וריד מרכזי; PV = וריד פורטל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערה: עבור פרוטוקול זה, ניתן להתקין את ראש ה- AFM על כל מיקרוסקופ הפוך מתאים עם אפשרות להכניס מקטב ואנלייזר. יש למקם את המערכת ביחידת בידוד כדי להפחית את רעשי הרקע.

  1. כיול קבוע הקפיץ של קנטילבר AFM
    1. טען את הבדיקה (שהוכנה לפי שלבים 1-8 בסעיף 2, חלק 1, חיבור של חרוז 5.7 מיקרומטר לקצה קנטילבר AFM) לראש ה- AFM בהתאם להוראות היצרן.
    2. נקו את הקנטילבר עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום של הקנטילבר במהלך המדידה. יש לשטוף היטב במים מזוקקים כדי להסיר שאריות אתנול מהקצה.
    3. הפעל מצב יצירת קשר ובחר מיפוי כוח כשיטת המדידה.
    4. פתח את כל החלונות הרלוונטיים (מנועי Z Stepper, בקרת במה ממונעת, מציג נתונים, אוסצילוסקופ מפת סריקת כוח, יישור לייזר וחלון מצלמה ) בכרטיסיות התוכנה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים.
    5. הרכיבו מגלשת זכוכית נקייה המכילה 1.2 מ"ל של 1x תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) בשטח של כ-2 ס"מ על 4 ס"מ המתוחם בעט טוש הידרופובי. הרכיבו את ראש ה-AFM על במת המיקרוסקופ וודאו שהקנטילבר שקוע במלואו ב-PBS.
    6. מקד את המטרה על קצה הקנטילבר. הפחת את עוצמת האור המועבר במיקרוסקופ כדי לקבל תצוגה טובה יותר של מיקום הלייזר על הצג.
    7. כוון את הלייזר לקצה השקוף של הקנטילבר (שמתחתיו מחובר החרוז הכדורי) ויישר את המראה באמצעות הידיות בראש ה-AFM כדי למקסם את העוצמה הכוללת של קרן הלייזר על הגלאי (המתוארת על ידי הסכום בחלון יישור לייזר ).
    8. יישר את גלאי הפוטודיודה באמצעות הידיות הקיימות בראש ה-AFM כדי למקם את הלייזר במרכזו.
    9. תנו לקנטילבר להתייצב למשך 15 דקות לפני שתמשיכו עם הכיול.
    10. פתח את מנהל הכיול והכנס את סוג הקנטילבר, מידות הכנף ותנאי הסביבה. כייל את קבוע הקפיץ ואת הרגישות (הידוע גם בשם רגישות מנוף אופטי הפוך, InvOLS) על ידי לחיצה על כיול. אשר את הדיוק של קבוע הקפיץ המתקבל לאחר כיול עם הצהרת היצרן. לכייל את הקנטילבר במצב ללא מגע (הכיול מבוצע על ידי התוכנה באמצעות המשפט התרמי שנגזר על ידי Sader et al.58).
      הערה: קבוע הקפיץ של הקנטילבר מייצג את הנוקשות של הקנטילבר וניתן על ידי כוח ההתנגדות של הקנטילבר כשהוא מתעוות לפי אורך העיוות במונחים של N/m. הרגישות של הקנטילבר מתארת את הערך של תגובת פוטודיודה (בוולטים) בתגובה להסטת הקנטילבר (בננומטרים) ומוצגת בדרך כלל במונחים של nm/V59. במצב ללא מגע, ספקטרום הרעשים התרמיים מוקלט ומצויד בפונקציה ההידרודינמית60 על ידי תוכנת הבקרה AFM באופן אוטומטי לאחר הכיול. ההתאמה מספקת את פרמטרי הכיול, כלומר קבוע הקפיץ וה- InvOLS. קבוע הקפיץ של ה- SD-qp-BioT-TL-10 ששימש במחקר זה היה 0.09 N/m, כפי שהוכרז על ידי היצרן.

3. הכנת מדגם II

  1. הפשירו את החלקים הקפואים (מאוחסנים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס, כמתואר בסעיף 1, הכנת מדגם I) בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  2. תקן את החלקים עם פרפורמלדהיד 4% קר כקרח (PFA) ב-PBS אחד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שטיפה נרחבת (5x) עם PBS אחד. נגבו PBS שיורי סביב החלק עם טישו וסמנו גבול של כ-2 ס"מ על 4 ס"מ סביב חלק הכבד בעזרת עט טוש הידרופובי. כסה את הדגימה עם 1x PBS (ודא שהשטח התחום מכיל ~ 1.2 מ"ל של PBS אחד). השתמש בדגימה למדידות AFM.
    הערה: מכיוון ש-PFA הוא כימיקל מסוכן, יש לטפל בו בזהירות כדי למנוע מגע עם העור או העיניים. כדי להימנע מהאדים הרעילים שלו, כל ההליכים המערבים PFA חייבים להתבצע במכסה אדים כימי מאושר או באזור מאוורר מאושר אחר.

4. מדידה

  1. הפעל שמירה אוטומטית על-ידי מעבר לכרטיסייה הגדרה וסימון על שמירה אוטומטית. ציין את שם הקובץ והספרייה לשמירת קובצי המדידה על-ידי מעבר לכרטיסייה הגדרות ולאחר מכן לחיצה על שמירת הגדרות.
  2. טען את המדגם (מוכן לפי סעיף 3, הכנת מדגם II). התקרב למשטח הרקמה באמצעות משטח ה- AFM על-ידי הפעלת הלייזר ולחיצה על מקש הגישה . לאחר שהקצה נמצא במגע עם משטח הרקמה, נסוגו מקצה הקנטילבר כך שהקצה יישאר במוקד המטרה (על ידי לחיצה על מקש Retraction , אשר מחזיר את הקנטילבר לקצה העליון של טווח הפייזו). יישר מחדש את הגלאי אם מיקום הלייזר מתרחק ממרכזו בחלון יישור לייזר .
  3. כבה את הלייזר ושכב את השדה האופטי של המיקרוסקופ באמצעות מפות מדידה של AFM על-ידי לחיצה על הכרטיסיה אביזרים ולאחר מכן בחירה באפשרות כיול אופטי של שכבת-על ישירה. בחלון המצליח, לחץ על הבא כדי לצלם סדרה של תמונות של הקנטילבר סורק אזור מסוים. לחץ שוב על הבא כדי לעבור לחלון הבא .
  4. בתמונה הראשונה, לחץ על מרכז קצה הקנטילבר באופן ידני כדי לתאר את מיקום הקצה בתוכנה. ניתן לתפעל את העיגול המתאר את מיקום הקצה בגודלו על ידי ציון הרדיוס שלו כדי להגביר את הדיוק. לחצו על 'כיול' כדי לזהות באופן אוטומטי את מיקום קצה הכנף בכל התמונות. אשר את הדיוק של זיהוי עצות על-ידי מעבר על התמונות.
  5. לחץ על הבא ולאחר מכן על סיום כדי לסיים את הכיסוי האופטי ולשמור את סדרת התמונות שצולמו במהלך כיול אופטי.
  6. החזירו את השקע לאחור כדי למנוע התנגשות עם משטחים גבוהים יותר במגלשה. הזיזו את הבמה כדי למקם אזור עשיר בקולגן בתוך התיבה הירוקה הגלויה בכרטיסייה ' מציג הנתונים' באמצעות התמונה המקוטבת. בחר את האזור העשיר בקולגן על ידי יצירת מלבן סביבו באמצעות לחיצה ארוכה על לחצן העכבר השמאלי בתוך הקופסה הירוקה שצוינה. הגדר את הממדים, הכיוון והרזולוציה של האזור שנבחר תחת הכרטיסיה רשת בצד שמאל. לחצו על ' אשר אזור סריקה חדש' כדי להגדיר את האזור שנבחר כאזור המדידה.
  7. שמור על הפרמטרים IGain ו- PGain של לולאת המשוב בערכי ברירת המחדל, אם לא מוצגים אי-יציבות עיקריים בצורה של רגישות יתר של המערכת. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הגדר את IGain ב- 50 הרץ ואת PGain ב- 0.001.
  8. הגדר את ה- Setpoint ב- 1 nN.
    הערה: Setpoint הוא הכוח של האינטראקציה בין הקצה למשטח במהלך המצב הנייח. עבור רוב הדגימות הרכות (תאים, ג'לים ורקמות), ערכי Setpoint בטווח של 0.5-2.0 nN מתאימים.
  9. בחר את הערך Relative Setpoint בהתאם לתכונות המכניות של החומר הנלמד ולנוקשות הקנטילבר. עבור פרוטוקול זה, הגדר את הערך ב- 5 nN.
    הערה: נקודת ההתחלה היחסית מייצגת את הכוח המרבי של האינטראקציה, כאשר מגיעים לשיא עקומת הכוח-מרחק ותנועת הקצה חוזרת לקו הבסיס. עבור חומרים רכים (1-50 kPa), פרמטר זה מוגדר ביחידות של ננו-ניוטון (nN). יתר על כן, עבור קנטילבר רך (עם קבוע קפיץ מ-0.05 N/m עד 0.35 N/m), הכוח המרבי שניתן להפעיל הוא כ-50 nN. התאם את ערכי ה- Setpoint ו- Setpoint היחסי בהתאם.
    1. ודא שערך ה- setpoint הנתון אינו מוביל לעומק כניסה גדול יותר מרדיוס ה- indenter הכדורי, אחרת לא ניתן להגדיר כראוי את משטח הכניסה בחישוב המודולוס של יאנג. חישוב הערך הממוצע של עומק ההזחה לאחר ההפעלה הראשונה של הכניסות; ראה סעיף 5, ניתוח נתונים, כדי ללמוד כיצד לעבד את הנתונים המוקלטים. התאם את ערך ה- Setpoint במידת הצורך.
  10. הגדר את התאם קו בסיס כ - 5.
    הערה: כאן, קו הבסיס מתייחס למידת הפולינום המשמשת להתאמת הגישה ולסגת עקומות. הגדרת קו הבסיס ל-5 מתאימה את העקומות לרזולוציה גבוהה ובכך מבטיחה לכידת רעשי רקע במהלך המדידות.
  11. בחר את אורך תנועת הקנטילבר בציר Z (אורך Z) בהתאם לטופוגרפיית פני השטח של הדגימה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הגדר את אורך Z ל- 15 מיקרומטר.
    הערה: ערך גבוה (למשל 15 מיקרומטר) מפחית את רגישות המדידה, אך בדרך כלל נדרש עבור דגימות עם משטח מאוד לא סדיר כגון רקמת כבד פיברוטית.
  12. הגדר את תנועת Z למשך זמן קבוע.
    הערה: ניתן גם להגדיר את תנועת Z למהירות קבועה כדי להציג נתונים המתייחסים לתנועת Z (הארכת מהירות והארכת זמן) במצב אחר.
  13. הגדר את זמן ההארכה ל - 1 s. הגדר השהיית הארכה והשהיית נסיגה כ - 0.
    הערה: השתמש במהירויות הארכה של >5.0 מיקרומטר לשנייה עבור חומרים רכים מאוד61, מכיוון שמהירויות כניסה נמוכות יותר יביאו לתגובה צמיגה יותר ופחות אלסטית ממשטחים רכים. עיכוב הארכה ועיכוב נסיגה הם פרמטרים שניתן להשתמש בהם לחקר אינטראקציה ספציפית בין קצה הקנטילבר למצע (לדוגמה, אינטראקציות של חלבונים משותקים על פני השטח של הקנטילבר עם חלבונים משותקים על משטח השקופית).
  14. הגדר את קצב הדגימה כ- 5000 הרץ.
    הערה: קצב הדגימה מתייחס לתדירות הנקודות הנרשמות בעקומת התקרבות-נסיגה מלאה. הגדר זאת לערך גבוה (למשל 5000 הרץ) כדי למנוע החמצה של אזורים מסוימים בעקומות עקב המעבר המהיר ביותר שלהן.
  15. סמן את הלולאה הסגורה Z עם סימן ביקורת כדי להפעיל מערכת לולאת משוב, המבטיחה מרחק רציף בין משטח הדגימה לקצה הקנטילבר.
  16. נתק את השלב הממונע על-ידי ביטול הבחירה באפשרות Engage ולחץ על גישה כדי לגשת לדוגמה עם ה-cantilever. לחץ על התחל סריקה כדי להתחיל לאסוף עקומות מרחק כוח באזור שנקבע בשלב 6; סעיף 4, מדידה.

5. ניתוח נתונים

  1. לנתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנת קוד פתוח "AtomicJ" (אשר ניתן להוריד מ https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
    הערה: הוא תומך בקבצים שנאספו מטכנולוגיות אג'ילנט, מכשירי JPK או מיקרוסקופים של כוח אטומי של Bruker.
  2. טען את עקומות הכוח לתוכנית על ידי לחיצה על עקומות כוח התהליך וסמל המפות ב- AtomicJ (איור משלים S2A, x). במסייע העיבוד, הוסף את המפות לניתוח על ידי לחיצה על לחצן הוסף (איור משלים S2A, y). לחץ על הבא לאחר טעינת המפות (איור משלים S2A, z).
  3. ציין את הגדרות העיבוד בחלון הבא בהתאם לשלבים המתוארים להלן (בהתאם לשלבים באיור המשלים S2B, שלבים 1-11):
    1. הערך את נקודת המגע בין הדגימה לבין המעטפת באופן ידני על-ידי חישוב או באופן אוטומטי באמצעות קבוצה של פרמטרים מתאימים של עקומה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בהערכה האוטומטית של נקודת הקשר.
    2. קבע את נקודת המגע בין הקנטילבר לדגימה בשיטת הרשת הממוקדת הקלאסית.
    3. בחר את שיטת ההערכה כדי להניב את הקביעה הטובה ביותר של נקודת המגע בהתבסס על איכות עקומי הכוח הנמדדים, אשר צריכה להיקבע באופן אמפירי במהלך אופטימיזציה של ניתוח נתונים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בשיטה הבלתי תלויה במודל.
    4. התאם את עקומת כניסת הכוח באמצעות מודל קלאסי (השתמש ב- L2 קלאסי להתאמת המודל כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה).
      הערה: התאמת מודל ומעריך מגע הם פרמטרים הקובעים כיצד העקומות מותאמות על-ידי התוכנה וכיצד נקודת המגע נקבעת בעקומה המותאמת, בהתאמה. עבור מדידות אלה, נעשה שימוש באפשרות קלאסית, המשתמשת ברגרסיה של ריבועים לפחות. פעולה זו מעבדת כל נקודה בעלת כוח נמוך בעקומה כנקודת מגע ניסיונית ומתאימה פולינום לאזור שלפני נקודת המגע של הניסוי. לאחר מכן הוא מתאים את מודל הקשר המתאים לנתוני כניסת הכוח שנאספו. הנקודה שנותנת את הסכום הנמוך ביותר של ריבועים מתקבלת כנקודת המגע. ניתן להשתמש בשיטות אחרות על סמך איכות עקומות הכוח המתקבלות62,63.
    5. הגדר את ההתאמה של המודל לעקומת המשיכה .
    6. הגדר את היחס של פואסון כ - 0.45, לפי המומלץ לרקמות רכות כגון כבד24.
    7. הגדר את ההתאמה של העקומה באמצעות דרגת בסיס של 3 ודרגה במגע של 1. שנה את מידת ההתאמה הפולינומית בהתבסס על סולם הסטיות של העקומות מהמודל.
    8. בחר את הדגם המשמש להתאמת עקומות המשיכה. השתמש במודל סנדון , המחשב את המודולוס של יאנג בהתבסס על משוואה (1) ומשוואה (2):
      Equation 1(1)
      δ = Equation 2 (2)
      כאשר F הוא כוח, E הוא המודולוס של יאנג, v הוא יחס פואסון של הדגימה, δ הוא עומק הכניסה, a הוא רדיוס המגע, ו-R הוא רדיוס הכדור62,63.
    9. מלא את רדיוס הקצה הכדורי במיקרומטרים (2.9 מיקרומטר בפרוטוקול זה).
    10. טען את קבוע הקפיץ ואת InvOLS מקבצי הנתונים על-ידי הפעלת קריאה ( סמן את התיבות).
    11. לחץ על סיום.
      הערה: הנתונים שנותחו מוצגים בצורה של מפות של סטייה אנכית, גובה, הידבקות, כוח מגע, דפורמציה, כוח הידבקות, ערכי R2 , שיפוע, מודולוס יאנג, כניסת מעבר, כוח מעבר ומיקום מגע המחושבים עבור כל עקומת כוח (איור משלים S3, למעלה משמאל). שני חלונות נוספים מציגים עקומות כוח וערכי גלם (איור S3 משלים, לוח ימני עליון ותחתון, בהתאמה).
  4. אל תכלול עקומות כוח שבהן הכנף התקרבה באופן שגוי לפני השטח של קטע הכבד. כדי לזהות אותם, חפשו עקומות עם רעש גבוה, צורות חריגות ו/או גישה לא שלמה, כפי שמודגם באיור 3 ונדון בפירוט במקום אחר46.

Figure 3
איור 3: דוגמאות לעקומות כוח מייצגות. (A,B) עקומות כוח ייצוגיות הניתנות לפענוח עבור נוקשות יותר (A; E = 10.5 kPa) ורך יותר (B; E = 1.78 kPa) אזורים המתאימים לניתוח. (ג-ו) גרפים מייצגים שאינם ניתנים לפרשנות שיש להוציא מהניתוח עקב גישה שגויה (C-E) או (F) רעש גבוה יותר. כפי שמצוין במקרא המופיע ב-(A), עקומות אדומות מראות את הגישה של ה-cantilever, ועקומות ירוקות מראות את נסיגת ה-cantilever. קווים שחורים מראים את התאמת עקומת הנסיגה של הקנטילבר. שיפוע הקווים השחורים מתאים למודולוס של יאנג. הנקודות האדומות והכחולות מתאימות לנקודת המגע ולנקודת המעבר, בהתאמה. נקודת המגע היא נקודת המגע האחרונה בין הקנטילבר למצע במהלך הנסיגה, בעוד שנקודת המעבר מתארת את המעבר של הקנטילבר מהתקרבות לנסיגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Representative Results

מקטעי כבד בעובי 30 מיקרומטר קבועים קלות, שהתקבלו מעכברי בקרה ומעכברים עם פיברוזיס קל או מתקדם (המושרה על ידי הזרקה של CCl4 במשך 3 שבועות או 6 שבועות,בהתאמה 49) נבדקו עם AFM כמתואר בפרוטוקול זה. סיבי קולגן הקרובים לוורידים מרכזיים נבחרו למדידת מפות קשיחות. אזורים קרובים לוורידים המרכזיים, שמתאימים לאזורים שבהם נוצרים בדרך כלל סיבי קולגן בחיות שטופלו ב-CCl4, נותחו בכבדי בקרה (איור 4A). התפלגות המודולי של יאנג הייתה ניתנת לשחזור על פני כבדי בקרה שונים ואזורים עשירים בקולגן בתוך מקטע כבד יחיד (איור 4B: עלילת כינור שמאלי).

בבעלי חיים שטופלו ב-CCl 4, מפות נוקשות המתאימות לאזורים הפריצנטריים של מרבצי קולגן הראו ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי של מודולי יאנג בהשוואה לאזורים מקבילים בעכברי בקרה (איור 4B: 1.9 kPa לעומת 2.6 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג לבקרה לעומת 3 שבועות CCl 4 שטופלו בעכבר 4; p = 0.07; 1.9 kPa לעומת 5.1 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג לבקרה לעומת 6 שבועות CCl4 -עכבר מטופל; p = 0.02). יתר על כן, חלה עלייה משמעותית בערכי המודולי של יאנג עם טיפול CCl 4 ארוך יותר (איור 4B; 2.6 kPa לעומת 5.1 kPa ערכי המודולוס החציוניים של יאנג למשך 3 שבועות לעומת 6 שבועות CCl4 שטופלו בעכבר 4; p = 0.04). זה מראה התקשות הדרגתית של משקעי קולגן עם התקדמות פיברוזיס וכי מדידות AFM משקפות את הפיברוגנזה.

כדי להעריך את ההשפעה של אחסון ממושך של מקטעי כבד משובצים ב-OCT על התכונות המכניות של סיבי קולגן, מדדנו את הנוקשות של סיבי קולגן במקטעים של עכברים שטופלו ב-CCl4, שאוחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס במשך שבועיים או שלושה חודשים במגלשה לאחר החיתוך (איור 5). מדידות AFM הראו ערכים נמוכים משמעותית של מודולי יאנג באזורים עשירים בקולגן עבור מקטעים שאוחסנו במשך 3 חודשים בהשוואה לאלה שהתקבלו ממקטעים שנמדדו תוך שבועיים מחיתוך הדגימה (איור 5; 4.7 kPa לעומת ערכי מודולוס חציוניים של יאנג למשך 3.6 kPa במשך שבועיים לעומת 3 חודשי אחסון; p < 0.001). לכן, חשוב למדוד את התכונות המכניות של רקמת הכבד זמן קצר לאחר שהקטעים מוכנים מאונות הכבד המשובצות ב- OCT.

Figure 4
איור 4: מדידות AFM חושפות התקשות הדרגתית של אזורים עשירים בקולגן בקורלציה עם טיפול ממושך ב-CCl4. (A) מקטעי כבד מעכברי בקרה ועכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות או 6 שבועות שימשו למדידת התכונות המכניות של אזורים עשירים בקולגן. האזורים הדחוסים של מקטעי הכבד המוצגים בתמונות המיקרוסקופיה המקוטבת (משמאל) הם אזורי סריקה עשירים בקולגן (או אזורים מקבילים בכבד הבקרה) שנבחרו למדידות AFM (30 מיקרומטר x 100 מיקרומטר, 10 פיקסלים x 36 פיקסלים). מפות המודולוס של יאנג עם קני מידה צבעוניים המתאימים לאזורים אלה מוצגות מימין, כולל היסטוגרמות של ערכי המודולוס של יאנג ממפות אלה; תרשימי פיזור משובצים מציגים ערכים >10 kPa עבור כל תנאי. התקשות הכבד מתוארת כתזוזה הדרגתית ימינה בהתפלגות ההיסטוגרמה ותדירות גבוהה יותר של נקודות בעלילת הפיזור המשובצת. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) עלילות כינור מציגות את התפלגות המודולים האלסטיים משלושה אזורים שנמדדו עבור כל תנאי (משמאל) וסיכמו ערכי מודולי אלסטיים מכל שלוש המפות (מימין). עלילות כינור מציגות את החציון (קו אדום), אחוזון25 ואחוזון 75 (קווים שחורים); נקודות מייצגות את הערכים הממוצעים של מפות בודדות מאזורים 1-3. ערכי ה-p המוצגים חושבו באמצעות מבחן t של סטודנט שבוצע באמצעים. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; CCl4 = פחמן טטרה-כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: אחסון מורחב של מקטעי כבד מוביל לירידה בנוקשות של אזורים עשירים בקולגן. מקטעי כבד (שהוכנו מעכברים שטופלו ב-CCl 4 במשך שבועיים) שאוחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס במשך שבועיים או 3 חודשים שימשו למדידת המודולוס של יאנג. תמונות מיקרוסקופיה מקוטבות (משמאל) עם תיבות המציינות את האזורים העשירים בקולגן המשמשים למדידת AFM (30 μm x 100 μm, 10 פיקסלים x 36 פיקסלים). מפות מודולוס תואמות של יאנג עם סולמות צבעים (מימין). היסטוגרמות מראות את ערכי המודולוס של יאנג שנאספו מ-4-6 אזורים בכל דגימה; תרשימי פיזור משובצים מציגים ערכים >10 kPa עבור כל תנאי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; CCl4 = פחמן טטרה-כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: שיטה לשינוי הקנטילבר עם מיקרו חרוז שרף מלמין. (A) שרטוט סכמטי ממחיש את החיבור של חרוז כדורי לקצה הקנטילבר. לקבלת תיאור חכם, ראה סעיף 2, חלק 1, צירוף חרוז בגודל 5.7 מיקרומטר לקצה המעטפת של AFM. (B) תמונת מיקרוסקופיה של חרוז כדורי בקוטר 5.7 מיקרומטר המחובר לקצה הקנטילבר המוצג מלמעלה (משמאל) וממבט לרוחב (מימין). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי; RT = טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: ניתוח נתונים ב- AtomicJ. (A) רצף הצעדים שיש לעקוב אחריהם לפתיחת מפות קשיחות ב- AtomicJ. לחיצה ימנית אחת על עקומות כוח התהליך והמפות (x) פותחת את עוזר העיבוד. ניתן לטעון קבצים לעוזר העיבוד על ידי לחיצה על הוסף (y) ובחירת הקבצים הנדרשים. לחץ על הבא (z) כדי להמשיך לשלב הבא. (B) פרמטרים להתאמת עקומות, דגם מכניקת מגע מתאים והגדרות AFM המשמשות במהלך המדידה. שלבים 1-11 מתייחסים לנקודות משנה מתאימות המפורטות בשלב 3 של הפרוטוקול, סעיף 5, ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: מתווה של נתונים מנותחים ב- AtomicJ. התצוגה המקדימה של הנתונים שנותחו מציגה מפות קשיחות (חלון שמאלי עליון), עקומות כוח (חלון ימני עליון) ונתונים גולמיים (חלון תחתון). קיצור: AFM = מיקרוסקופיה של כוח אטומי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הפרוטוקול המוצג מספק שיטה הניתנת לשחזור שלב אחר שלב למדידת AFM של רקמת כבד עכבר רגילה ופיברוטית. מיקרוסקופיית קיטוב מצומדת מספקת דיוק מרחבי גבוה ומאפשרת הדמיה של סיבי קולגן בשל השבירה הדו-צדדית שלהם. יתר על כן, תיאור מפורט של ניתוח עקומות הכוח המתקבל מסופק. מדידת נוקשות AFM יכולה להתבצע ברמה התאית, מה שמאפשר לעקוב אחר שינויים מקומיים בתכונות המכניות של רקמת הכבד עקב התפתחות מחלה פיברוטית. פיברוזיס בכבד אינו תהליך הומוגני המשפיע על האיבר כולו. להיפך, אזורים של ספטה פיברוטית עשירה בקולגן משולבים עם אזורים של משקעי קולגן נמוכים או ללא קולגן כלל. לפיכך, שינויים בנוקשות הם ספציפיים למיקרו-סביבה המקומית ומשפיעים רק על תאים הנמצאים במגע מקומי עם אזורים שנפגעו מפציעה. ההטרוגניות הזעירה הזו ניכרת גם בפרטים של מפות המודולוס של AFM Young, שבהן נקודות של קשיחות גבוהה גובלות באזורים של קשיחות כמעט נורמלית. השונות הזו מראה שאפילו אזור רקמת צלקת הקולגן אינו הומוגני מבחינה מכנית ודורש מדידת AFM כדי לאפיין אותה ברמה התאית (איור 4).

הפרוטוקול המוצג מאפשר מדידות של נוקשות הכבד על ידי AFM ללא תלות באוסף הכבד, שכן ניתן לאחסן את כל אונות הכבד המוטבעות ב- OCT לתקופה ממושכת ב- −80 מעלות צלזיוס. עם זאת, לאחר ניתוח הרקמה, אנו ממליצים למדוד את הדגימות תוך ~2 שבועות, שכן ראינו ריכוך הדרגתי של מקטעי רקמה המאוחסנים לפרקי זמן ארוכים יותר (איור 5).

ה-AFM המצויד במיקרוסקופיית קיטוב מאפשר איתור מדויק של אזור העניין בתוך מבנה אונות הכבד. עם זאת, יש לו גם כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת פירוש התוצאות. ערכי הנוקשות שהתקבלו כאן נמדדו בטמפרטורת החדר. אנו מניחים כי ההשפעות של הטמפרטורה על התכונות המכניות של רקמות רכות יהיה קטן; עם זאת, זו עשויה להיות אחת הסיבות להבדלים בין ערכי in vivo המדווחים של תכונות מכניות של רקמות כבד לבין הערכים במחקר זה.

יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח AFM של רקמת הכבד עד 3 שעות, אשר דורש קיבוע קל של הרקמה. הקיבוע המתון של מקטעי הרקמות, כמו גם מחזור ההפשרה, ישפיעו ככל הנראה על הערכים המוחלטים של המודולוס של יאנג. לפיכך, הערכים המדווחים של המודולי של יאנג עשויים להיות שונים מערכי in vivo . מחקרים נוספים נדרשים כדי לייעל את הפרוטוקול למדידת ערכים מוחלטים של מודולוס יאנג מקטעי כבד, אשר עשוי להיות מושגת על ידי שיטה אחרת לקיבוע של רקמת הכבד64.

עם זאת, ראינו נוקשות גוברת של אזורים עשירים בקולגן בכבדים של עכברים שטופלו ב-CCl4 במשך 3 שבועות, בהשוואה ל-6 שבועות. שינויים כאלה תואמים את התקדמות הפיברוזיס במהלך פציעה ממושכת (איור 4) ומראים שניתן לחקור הבדלים יחסיים בין טיפולים שונים באמצעות הפרוטוקול המוצג. זה עולה בקנה אחד עם התצפיות של Calò et al., שהראו כי מקטעי כבד קבועים קלות מראים הבדלים דומים בערכי הנוקשות בין אזורים עשירים בקולגן וחסרי קולגן כמו ברקמה טרייה25.

השתמשנו ב-SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (קבוע קפיץ תיאורטי ~0.09 N/m) ששונה עם קצה כדורי בקוטר 5.7 מיקרומטר כדי למזער את ההפרעה המכנית של רקמת הכבד במהלך המדידות. חרוז של 5.7 מיקרומטר איפשר כניסה מספקת של הדגימה כדי לבדוק את קשיחותה תוך שמירה על שלמותה. חרוז בקוטר קטן יותר יכול לשמש, לאחר מספר אופטימיזציות, לקבלת רזולוציה גבוהה יותר במפות הנוקשות, אך עלול להוביל להערכת יתר נוספת של ערכי המודולוס של יאנג (לפרטים נוספים, ראו Crichton et al.65). באמצעות אנסמבל החרוזים שצוין, הצלחנו לאפיין את קשיחות הדגימה בטווח רחב, מעשרות יחידות של Pa ועד ~ 100 kPa.

המודל של סנדון שימש לגזירת המודולוס של יאנג מעקומות כוח, שכן הוא מאפשר ניתוח של כניסות עמוקות עם גשושיות קולואידיות62. המודל של סנדון, בניגוד למודל של הרץ, אינו סובל מהאילוץ שרדיוס המגע חייב להיות קטן בהרבה מרדיוס הכדור. עוד הוא מניח כי עובי הדגימה גדול פי כמה מעומק הכניסה30,66. במחקר הנוכחי, הכניסה הייתה ~2 מיקרומטר עם גודל חרוז של 5.7 מיקרומטר ועובי דגימה של 30 מיקרומטר באזורים עשירים בקולגן; לפיכך, המודל של סנדון היה מתאים. מודלים אחרים63 בהתחשב בכוח ההידבקות בין קצה למצע יכולים לשמש לסוגים שונים של רקמות.

אנליזה ב-AtomicJ מיישמת תיקונים לעובי הסופי של הדגימות כדי למזער את תרומתו של מצע תוך הפקת מודולוס62,67 של יאנג. בניתוח עקומות הכוח המתקבלות, השתמשנו ביחס פואסון יחיד של 0.45, אשר הומלץ בעבר לאיברי רקמות רכות24. לקירוב זה אין השפעה משמעותית על הערכים המחושבים של המודולוס של יאנג, שכן השינוי בערך היחס של פואסון מ-0.4 ל-0.5 גורם רק לירידה של פי 0.893 בערכי המודולוס של יאנג המחושבים על פי משוואת סנדון. בהתחשב בהבדלים הרבים במודולוס של יאנג בין משכי הזמן השונים של טיפולי CCl4, השגיאות הנוצרות על ידי קירוב היחס של פואסון הן שוליות בלבד.

השתמשנו בעקומות משיכה כדי לחשב ערכי קשיחות, מכיוון שהתעניינו בתגובה האלסטית של הרקמה לעומס שמספק הקנטילבר ולא בתגובה הפלסטית לכניסה68. בשל התגובה הוויסקואלסטית של הרקמה הרכה, עקומות נסיגה מתאימות עשויות להעריך יתר על המידה את המודולוס של יאנג, שיש לזכור זאת. יתר על כן, ראינו שניתוח נתונים עם עקומי גישה מניב מגמות דומות בערכי הנוקשות בין אזורים פיברוטיים לאזורי בקרה, אם כי הערכים האבסולוטיים נמוכים יותר בהתאמה (הנתונים לא מוצגים).

תוך כדי אופטימיזציה של הפרוטוקול, זיהינו מספר שלבים קריטיים לשחזור המדידות. ראשית, חשוב לוודא שהחרוז נמצא בערך במרכז הקצה השקוף בזמן ההצמדה לקנטילבר. זה מונע חוסר איזון מכני אפשרי במהלך הכניסה. שנית, במהלך קיבוע הכבד עם PFA, יש צורך להקפיד על מגבלות הזמן להפשרה וקיבוע. שינוי התזמון של שלב זה עלול להשפיע קשות על התכונות המכניות של מקטעי רקמות. שלישית, יש לכייל את הקנטיליבר שוב ושוב עם ניטור רציף וקלט של ערכי טמפרטורה בו-זמניים כדי למנוע ממצאים המתרחשים בערכי קשיחות עקב תנודות טמפרטורה. לבסוף, אין למדוד חתך כבד יחיד במשך יותר מ-3 שעות מההכנה, שכן PBS שכבת-על עלולה להתאדות על פני תקופות ארוכות יותר. הקוראים יכולים לעיין בטבלת פתרון הבעיות (טבלה 3) לפתרון בעיות שנתקלו בהן במהלך מדידת AFM, שגם היא נדונה בהרחבה ב- Norman et al.46.

טבלה 3: מדריך לפתרון בעיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

הפרוטוקול המוצג מאפשר בדיקת AFM ניתנת לשחזור של רקמת הכבד. יש לו פוטנציאל לחשוף מידע על התפתחות ורגרסיה בסופו של דבר של מחלת כבד פיברוטית ברמה מיקרוסקופית והוא יכול לתרום לפיתוח טיפולים המכוונים לאזורי צלקת פיברוטיים שנוצרו במהלך התקדמות מחלת כבד כרונית.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות המענקים של הרפובליקה הצ'כית (18-02699S), פרויקט המחקר המוסדי של האקדמיה הצ'כית למדעים (RVO 68378050), ופרויקט MEYS CR NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, מרכז הדרכה-CZ של קונסורציום הוראה-ERIC האיחוד האירופי, במימון פרויקט התשתית MEYS CR LM2018127 והקרן האירופית לפיתוח אזורי-פרויקט "UP CIISB" (לא. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) תמך כספית במדידות בננו-ביוטכנולוגיה של CF, CEITEC MU. אנו מכירים גם במתקן הליבה של מיקרוסקופיית אור, IMG CAS, פראג, צ'כיה, הנתמך על ידי MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) ו- RVO: 68378050-KAV-NPUI, על תמיכתם בהדמיית המיקרוסקופיה המוצגת כאן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM head Bruker JPK nanowizard 3
Cameras Andor Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
The Imagingsource  S/N:12310015
Cantilever SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors S/N:73750F05
Cryotome Leica  CM1950
Epoxy resin glue (Long working time ) Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um Microparticles, GmbH MF-R-5.7
Microscope Olympus  IX81
Hydrophobic  slide marker SuperHT PAP PEN
Software JPK nanowizard  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides Thermoscientific ref no. J1800AMNZ
System Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit Tablestable AVI-200-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
  37. del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
  63. Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 185 פיברוזיס של הכבד משקעי קולגן נוקשות בכבד מודולוס אלסטי מיקרוסקופיה של כוח אטומי
מדידת נוקשות הכבד באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם מיקרוסקופיית קיטוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S.,… More

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S., Hadraba, D., Jirouskova, M., Gregor, M. Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63974, doi:10.3791/63974 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter