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Biology

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यकृत कठोरता का मापन

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63974
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 1, 1
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

Summary

हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सामान्य और रोगग्रस्त यकृत में कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों के लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी का एक साथ उपयोग यकृत वर्गों में कोलेजन युक्त क्षेत्रों के स्थानीयकरण के लिए उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करता है।

Abstract

मैट्रिक्स कठोरता को यकृत फाइब्रोसिस की प्रगति के प्रमुख ड्राइवरों में से एक के रूप में मान्यता दी गई है। इसका सेल व्यवहार के विभिन्न पहलुओं जैसे सेल फ़ंक्शन, भेदभाव और गतिशीलता पर गहरा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, चूंकि ये प्रक्रियाएं पूरे अंग में सजातीय नहीं हैं, इसलिए सेलुलर स्तर पर ऊतकों के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन को समझना तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है।

यकृत लोब के भीतर कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए, यह पेपर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा उच्च स्थानिक परिशुद्धता के साथ यकृत ऊतक लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एएफएम स्थानीय यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने की क्षमता के साथ एक संवेदनशील विधि है, जिसकी गणना यंग (लोचदार के रूप में भी जाना जाता है) मापांक के रूप में की जाती है। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित एएफएम का उपयोग विशेष रूप से ऊतकों में कोलेजन फाइबर के विघटन के आधार पर फाइब्रोसिस विकास के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने फाइब्रोटिक माउस लिवर से कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता और नियंत्रण चूहों के यकृत में संबंधित क्षेत्रों की विशेषता बताई।

फाइब्रोसिस विकास के साथ कोलेजन-पॉजिटिव क्षेत्रों की कठोरता में एक प्रमुख वृद्धि देखी गई थी। प्रस्तुत प्रोटोकॉल हल्के रूप से निश्चित यकृत ऊतक के उपयोग के कारण एएफएम माप की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की अनुमति देता है, जिसका उपयोग स्थानीय ऊतक यांत्रिक गुणों में रोग-शुरू किए गए परिवर्तनों और पड़ोसी कोशिकाओं के भाग्य पर उनके प्रभाव की समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

जीवों में होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए यकृत एक महत्वपूर्ण अंग है 1,2. क्रोनिक लीवर रोग सालाना दुनिया भर में ~ 2 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदारहैं। वे आमतौर पर वायरल संक्रमण, ऑटोइम्यून विकार, चयापचय सिंड्रोम, या शराब के दुरुपयोग से संबंधित बीमारियों के रूप में उत्पन्न होते हैं और प्रगतिशील यकृत फाइब्रोसिस के साथ होते हैं। जिगर की चोट एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्राप्त करती है, जो घाव भरने की प्रतिक्रिया में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जमा करने वाली कोशिकाओं की सक्रियता की ओर जाता है। हालांकि, एक पुराने अपमान की उपस्थिति में, अतिरिक्त ईसीएम यकृत के भीतर अनसुलझे निशान ऊतक बनाता है, जिससे यकृत फाइब्रोसिस, सिरोसिस, यकृत कार्सिनोमा और अंततः, यकृत विफलताका विकास होता है।

हेपेटोसाइट की चोट के परिणामस्वरूप तुरंत यकृत कठोरता बढ़जाती है 5,6. यह सीधे हेपेटोसाइट फ़ंक्शन को प्रभावित करता है, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं (एचएससी) और पोर्टल फाइब्रोब्लास्ट को सक्रिय करता है, और इसके परिणामस्वरूप कोलेजन-जमा मायोफाइब्रोब्लास्ट 7,8 के लिए उनका ट्रांसडिफरेंटेशन होता है। रेशेदार ईसीएम का जमाव यकृत कठोरता को और बढ़ाता है, जिससे यकृत कठोरता और मैट्रिक्स-उत्पादक सेल सक्रियण का एक आत्म-प्रवर्धन प्रतिक्रिया लूप बनता है।

इस प्रकार, यकृत कठोरता यकृत रोग के पूर्वानुमान में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर बन गई है। बायोमेकेनिकल ऊतक गुणों में परिवर्तन का पता हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा फाइब्रोसिस से पहले लगाया जा सकता है। इसलिए, अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों में यकृत कठोरता माप के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है। नैदानिक सेटिंग्स में, क्षणिक इलास्टोग्राफी (टीई) 9,10,11,12,13 और चुंबकीय अनुनाद इलास्टोग्राफी (एमआरई) 14,15,16,17,18 को सकल यकृत कठोरता 19 की जांच करके यकृत क्षति के शुरुआती चरणों का गैर-आक्रामक रूप से निदान करने के लिए नियोजित किया गया है।

टीई में, हल्के आयाम और कम आवृत्ति (50 हर्ट्ज) की अल्ट्रासाउंड तरंगों को यकृत के माध्यम से प्रचारित किया जाता है, और उनके वेग को मापा जाता है, जिसका उपयोग तब ऊतक लोचदार मापांक13 की गणना करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह तकनीक यकृत के आसपास के ऊतकों के माध्यम से अल्ट्रासाउंड तरंगों के अनुचित संचरण के कारण जलोदर, मोटापा, या कम इंटरकोस्टल रिक्त स्थान वाले रोगियों के लिए उपयोगी नहींहै।

एमआरई चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग पद्धति पर आधारित है और यकृत को लक्षित करने के लिए 20-200 हर्ट्ज यांत्रिक कतरनी तरंगों का उपयोग करता है। एक विशिष्ट चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग अनुक्रम का उपयोग तब ऊतक के अंदर तरंगों का पता लगाने और ऊतक कठोरता 16 की गणना करने के लिए कियाजाता है। टीई और एमआरई दोनों तकनीकों के साथ रिपोर्ट किए गए कठोरता मूल्य हिस्टोलॉजिकल मेटावीर स्कोर20 (तालिका 1) का उपयोग करके रैंक किए गए मानव यकृत नमूनों की बायोप्सी से प्राप्त यकृत फाइब्रोसिस की डिग्री के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। टीई और एमआरई को अनुसंधान उद्देश्यों के लिए कृंतक मॉडल में यकृत कठोरता के माप के लिए भी अनुकूलित किया गया है 21,22,23। हालांकि, चूंकि दोनों विधियां प्रसार कतरनी तरंगों के लिए ऊतक की प्रतिक्रिया से कठोरता मूल्यों को प्राप्त करती हैं, इसलिए प्राप्त मूल्य ऊतक की पूर्ण यांत्रिक कठोरता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।

कृंतक यकृत के प्रत्यक्ष यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए, बार्न्स एट अल ने एक मॉडल-जेल-ऊतक परख (एमजीटी परख) विकसित किया जिसमें पॉलीक्रिलामाइड जेल24 में यकृत ऊतक का एम्बेडिंग शामिल है। यह जेल एक स्पंदित समान बल द्वारा संपीड़ित होता है जिससे यंग के मापांक की गणना की जा सकती है। एमजीटी परख सामान्य और फाइब्रोटिक लीवर24 (तालिका 1) दोनों के लिए अनुकूलित इंडेंटेशन परख के साथ एक अच्छा सहसंबंध दिखाती है।

तालिका 1: थोक स्तर पर यकृत कठोरता मान। टीई और एमआरई की तुलना विभिन्न स्रोतों से लिवर के लिए इंडेंटेशन और एमजीटी परख का उपयोग करके यकृत लोचदार मोडुलिन के प्रत्यक्ष पूर्व विवो यांत्रिक मापों से की जाती है। E और G के बीच संबंध E = 2G (1 + v) द्वारा दिया गया है, जहां v नमूने का पॉइसन अनुपात है; एफ 0 से एफ 4 मेटावीर स्कोरिंग सिस्टम में फाइब्रोसिस स्कोर का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें एफ 0 कम या कोई फाइब्रोसिस और एफ 4 सिरोटिक लिवर को दर्शाता है। संक्षेप: टीई = क्षणिक इलास्टोग्राफी; एमआरई = चुंबकीय अनुनाद इलास्टोग्राफी; एमजीटी = मॉडल-जेल-ऊतक; ई = लोचदार (यंग) मापांक; जी = कतरनी मापांक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जेनेरिक यकृत कठोरता माप की प्रमुख कमियों में से एक यह है कि वे यकृत में कठोरता विषमता के सेलुलर-स्तरीय संकल्प प्रदान नहीं करते हैं। फाइब्रोसिस की प्रगति के दौरान, कोलेजन युक्त क्षेत्र आसपास के पैरेन्काइमा25,26 की तुलना में उच्च कठोरता दिखाते हैं। यह कठोरता ढाल स्थानीय रूप से निवासी कोशिकाओं को प्रभावित करती है और एचएससी विषमता 27 को चलाने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती है। इस प्रकार, फाइब्रोसिस प्रगति को बेहतर ढंग से समझने के लिए यकृत रोग के विकास के दौरान स्थानीय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन को सूक्ष्म स्तर पर विशेषता दी जानी चाहिए।

एएफएम ऊतक के यांत्रिक गुणों को उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च बल संवेदनशीलता के साथ मापा जाने की अनुमति देता है। एएफएम एक कैंटिलीवर की नोक का उपयोग एक नमूने की सतह को कई पिकोन्यूटन के रूप में कम बलों के साथ चिह्नित करने के लिए करता है, जो नियोजित नोक की ज्यामिति और आकार के आधार पर सूक्ष्म या नैनोस्कोपिक स्तर पर विरूपण को प्रेरित करता है। लागू तनाव के लिए नमूने की बल प्रतिक्रिया को तब कैंटिलीवर28 में विक्षेपण के रूप में मापा जाता है। फोर्स-विस्थापन वक्रों को कैंटिलीवर के दृष्टिकोण और वापसी से एकत्र किया जाता है, जिसे नमूना29 की स्थानीय कठोरता का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त संपर्क यांत्रिकी मॉडल के साथ फिट किया जा सकता है।

किसी दिए गए क्षेत्र की कठोरता को मापने के अलावा, एएफएम नमूने में विशिष्ट विशेषताओं के बारे में स्थलाकृतिक जानकारी भी प्रदान कर सकता है, जैसे कोलेजन फाइबर की संरचना 30,31,32। कई अध्ययनों ने रोगी और माउस मॉडल नमूनों दोनों से त्वचा32,33, फेफड़े 34,35, मस्तिष्क36, स्तन 37,38,39, उपास्थि 40, या हृदय 41,42,43,44 जैसे विभिन्न स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों की कठोरता को मापने के लिए एएफएम के आवेदन का वर्णन किया है। इसके अलावा, एएफएम का उपयोग कोशिकाओं की कठोरता और बाह्य प्रोटीन मचानों45,46,47 को निर्धारित करने के लिए विट्रो में भी किया गया है।

एएफएम का उपयोग करके जैविक नमूनों के यांत्रिक गुणों का माप उनकी कोमलता और नाजुकता के कारण महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, विभिन्न अध्ययनों ने विभिन्न स्थितियों और सेटिंग्स को मानकीकृत किया है, जो यंग के मोडुलिन (मैककी एट अल.48 द्वारा समीक्षा) के व्यापक रूप से उतार-चढ़ाव वाले मूल्यों को उत्पन्न करते हैं। अन्य नरम ऊतकों के समान, यकृत फाइब्रोसिस के विभिन्न ग्रेड में लिवर यंग के मापांक मान भी व्यापक भिन्नता दिखाते हैं (तालिका 2)। यंग के मापांक मूल्यों में अंतर एएफएम ऑपरेशन, कैंटिलीवर टिप, नमूना तैयारी विधि, नमूना मोटाई, इंडेंटेशन गहराई और बलों, माप के दौरान यकृत ऊतक वातावरण और विश्लेषण विधि (तालिका 2) के मोड में अंतर से उत्पन्न होता है।

तालिका 2: सेलुलर स्तर पर यकृत कठोरता मान। एएफएम का उपयोग करके प्राप्त यकृत कठोरता मूल्य सेलुलर स्तर पर यकृत के यांत्रिक गुणों का वर्णन करते हैं। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; ई = लोचदार (यंग) मापांक; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह पेपर ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के उपयोग द्वारा प्रदान किए गए सटीक स्थानीयकरण के साथ एएफएम द्वारा यकृत ऊतक में कोलेजन युक्त फाइब्रोटिक क्षेत्रों के यंग के मोडुलिन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। हमने कार्बन टेट्राक्लोराइड (सीसीएल4) को एक माउस मॉडल में सेंट्रीलोबुलर फैशन49 में कोलेजन जमाव को प्रेरित करने के लिए प्रशासित किया, जो मानव यकृत फाइब्रोसिस50 के महत्वपूर्ण पहलुओं की मज़बूती से नकल करता है। ध्रुवीकृत सूक्ष्म छवियां कोलेजन फाइबर51 के विघटन के कारण यकृत में कोलेजन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करती हैं, जो हेपेटिक लोब्यूल52 के भीतर रुचि के वांछित क्षेत्र पर कैंटिलीवर टिप की सटीक स्थिति की अनुमति देती है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को आणविक आनुवंशिकी संस्थान की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार और पशु प्रयोगों के लिए यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 / ईयू के अनुसार किया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक समग्र योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: माउस लिवर से यंग के मापांक के एएफएम मूल्यांकन का समग्र योजनाबद्ध। (ए) नियंत्रण या इलाज किए गए चूहों से यकृत का अलगाव, इसके बाद -80 डिग्री सेल्सियस (अधिकतम भंडारण, 2 सप्ताह) पर सेक्शनिंग और भंडारण होता है। (बी) गोलाकार मोती को कैंटिलीवर से जोड़ना और बाद में रात भर गोंद का इलाज (बाएं)। कैंटिलीवर अंशांकन के बाद नमूना माउंटिंग (दाएं)। (सी) एएफएम कैंटिलीवर के तहत माप क्षेत्र के साथ कैमरे में छवि के ओवरले के बाद उज्ज्वल कोलेजन संरचनाओं की कल्पना करने के लिए ध्रुवीकरण और विश्लेषक का संरेखण। (डी) कठोरता मानचित्र और विश्लेषण का अधिग्रहण। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; ओसीटी = इष्टतम काटने का तापमान यौगिक; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. नमूना तैयारी I

  1. एनेस्थीसिया के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु किए गए माउस के खुले पेट से यकृत का उत्पादन। बाएं पार्श्व लोब को अलग करें और सूखी बर्फ पर त्वरित ठंड द्वारा लोब के पार्श्व आधे हिस्से को इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में एम्बेड करें। ओसीटी-एम्बेडेड ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कठोरता मूल्य जमे हुए और ताजा ऊतकों25,26 के बीच समान हैं।
  2. अनुभाग 30 μm मोटी यकृत अनुभाग क्रायोटोम का उपयोग करके सकारात्मक रूप से चार्ज की गई स्लाइड्स पर और स्लाइड को -80 डिग्री सेल्सियस पर एएफएम माप के दिन तक स्टोर करें।

2. उपकरण स्थापित करना

  1. एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए 5.7 μm मोती का अनुलग्नक (पूरक चित्रा S1, चरण 1-5)
    नोट: कैंटिलीवर के लिए मोती का लगाव पहले नॉर्मन एट अल .46 द्वारा भी वर्णित किया गया था।
    1. विलायक को वाष्पित करने के लिए ग्लास स्लाइड और हवा-शुष्क क्षेत्र के आधे हिस्से पर समान रूप से 5.7 μm व्यास मेलामाइन राल मोतियों के निलंबन को फैलाएं (पूरक चित्रा S1, चरण 1)।
    2. स्लाइड के दूसरे आधे हिस्से पर, 10 μL टिप का उपयोग करके, लंबे समय तक काम करने के समय के साथ प्रीमिक्स्ड एपॉक्सी राल की एक पतली रेखा बनाएं (पूरक चित्रा एस 1, चरण 1)।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एएफएम प्रमुख को कैंटिलीवर जांच लोड करें।
    4. स्लाइड को माउंट करें और कैंटिलीवर जांच के साथ फिट किए गए एएफएम सिर के साथ कवर करें।
      नोट: अध्ययन में एक एसडी-क्यूपी-बायोटी-टीएल -10 कैंटिलीवर का उपयोग किया गया था।
    5. प्रीमिक्स्ड एपॉक्सी राल गोंद को स्लाइड के केंद्र में लाएं और कम बल के साथ कैंटिलीवर के साथ गोंद तक पहुंचें (इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए 1 वी पर एक सेटपॉइंट सेट करें; पूरक चित्रा एस 1, चरण 2)।
      नोट: स्लाइड सतह तक पहुंचने से पहले, सुनिश्चित करें कि लेजर कैंटिलीवर टिप के केंद्र में संरेखित है, जो खंड 2, भाग 3 में चरण 6-8 का पालन करके उच्च योग वोल्टेज द्वारा इंगित किया गया है, एएफएम कैंटिलीवर के स्प्रिंग स्थिरांक का अंशांकन।
    6. कैंटिलीवर प्रोब की नोक गोंद के साथ संपर्क करने के बाद, अतिरिक्त गोंद को हटाने के लिए इसे स्लाइड के ठीक ऊपर ले जाएं।
    7. अब, स्लाइड से कैंटिलीवर टिप को वापस लें और केंद्र में एक एकल मोती लाने के लिए स्लाइड को स्थानांतरित करें (पूरक चित्रा एस 1, चरण 3)। कैंटिलीवर जांच के केंद्र में मोती को संलग्न करने के लिए एक उच्च बल (सेटपॉइंट 2 वी) के साथ एएफएम कैंटिलीवर जांच के साथ फिर से संपर्क करें और इसे कम से कम 10 सेकंड के लिए छोड़ दें (पूरक चित्रा एस 1, चरण 4)।
    8. कैंटिलीवर जांच निकालें और गोंद को सख्त करने के लिए इसे कमरे के तापमान पर रात भर रखें या एपॉक्सी राल (पूरक चित्रा एस 1, चरण 5) के निर्देशों का पालन करें।
  2. पोलराइज़र और विश्लेषक स्थापित करना
    1. यकृत वर्गों के भीतर रुचि के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए, ध्रुवीकरण और विश्लेषक के साथ माइक्रोस्कोप स्थापित करें। संचारित प्रकाश को कम करने और उद्देश्य से गुजरने वाली असाधारण किरणों को अधिकतम करने के लिए उनमें से एक को मैन्युअल रूप से या स्वचालित तरीके से घुमाकर एक दूसरे के लिए 0 ° और 90 ° के बीच के कोण पर उनके कंपन अज़ीमुथ को संरेखित करें। सुनिश्चित करें कि कोलेजन फाइबर ध्रुवीकृत छवि (चित्रा 2) में एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ उज्ज्वल दिखाई देते हैं, जो उज्ज्वल पिक्सेल की ओर छवि हिस्टोग्राम के शिखर में बदलाव से परिलक्षित होता है।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां उज्ज्वल क्षेत्र छवियों की तुलना में ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी में कोलेजन फाइबर का स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन दिखाती हैं। 3 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों के यकृत वर्गों को (ए) ब्राइटफील्ड और (बी) ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी के अधीन किया गया था। ब्राइटफील्ड छवियों की तुलना में ध्रुवीकृत छवियों में सफेद रंग में बिरेफ्रिंजेंट कोलेजन फाइबर स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। लाल बॉक्स एएफएम माप के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलेजन समृद्ध क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इनसेट लाल बॉक्स में क्षेत्र के ज़ूम-इन दृश्य दिखाते हैं। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड; सीवी = केंद्रीय नस; पीवी = पोर्टल नस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, एएफएम हेड को किसी भी उपयुक्त उल्टे माइक्रोस्कोप पर एक ध्रुवीकरण और एक विश्लेषक डालने की संभावना के साथ स्थापित किया जा सकता है। पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए सिस्टम को एक अलगाव इकाई में रखा जाना चाहिए।

  1. एएफएम कैंटिलीवर के वसंत स्थिरांक का अंशांकन
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एएफएम प्रमुख को कैंटिलीवर जांच लोड करें (धारा 2, भाग 1 में चरण 1-8 के अनुसार तैयार किया गया है, एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए 5.7 μm मोती का अनुलग्नक)।
    2. माप के दौरान कैंटिलीवर के संदूषण को रोकने के लिए कैंटिलीवर को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें। सिरे से अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए आसुत जल के साथ बड़े पैमाने पर धोएं।
    3. संपर्क मोड सक्षम करें और माप की विधि के रूप में बल मैपिंग का चयन करें।
    4. संबंधित बटन पर क्लिक करके सॉफ्टवेयर टैब में सभी प्रासंगिक विंडो (जेड स्टेपर मोटर्स, मोटराइज्ड स्टेज कंट्रोल, डेटा व्यूअर, फोर्स स्कैन मैप ऑसिलोस्कोप, लेजर संरेखण और कैमरा विंडो) खोलें।
    5. हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन के साथ चित्रित लगभग 2 सेमी x 4 सेमी के क्षेत्र में 1.2 एमएल 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) युक्त एक साफ ग्लास स्लाइड माउंट करें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर एएफएम सिर माउंट करें और सुनिश्चित करें कि कैंटिलीवर पूरी तरह से पीबीएस में डूबा हुआ है।
    6. कैंटिलीवर टिप पर उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करें। मॉनिटर पर लेजर स्थिति का बेहतर दृश्य प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप पर प्रेषित प्रकाश की तीव्रता को कम करें।
    7. लेजर को कैंटिलीवर के पारभासी छोर पर लक्षित करें (जिसके नीचे गोलाकार मोती जुड़ा हुआ है) और डिटेक्टर पर लेजर बीम की कुल तीव्रता को अधिकतम करने के लिए एएफएम सिर पर नॉब्स का उपयोग करके दर्पण को संरेखित करें ( लेजर संरेखण विंडो में योग द्वारा चित्रित)।
    8. लेजर को अपने केंद्र में रखने के लिए एएफएम सिर पर मौजूद नॉब्स का उपयोग करके फोटोडायोड डिटेक्टर को संरेखित करें।
    9. अंशांकन के साथ आगे बढ़ने से पहले कैंटिलीवर को 15 मिनट के लिए स्थिर होने दें।
    10. अंशांकन प्रबंधक खोलें और कैंटिलीवर, कैंटिलीवर आयाम और पर्यावरणीय स्थितियों के प्रकार डालें। कैलिब्रेट पर क्लिक करके स्प्रिंग स्थिरांक और संवेदनशीलता (जिसे व्युत्क्रम ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता, इनवोएलएस के रूप में भी जाना जाता है) को कैलिब्रेट करें। निर्माता की घोषणा के साथ अंशांकन के बाद प्राप्त स्प्रिंग स्थिरांक की सटीकता की पुष्टि करें। संपर्क-मुक्त मोड में कैंटिलीवर को कैलिब्रेट करें (कैलिब्रेशन सॉफ्टवेयर द्वारा सैडर एट अल.58 द्वारा प्राप्त थर्मल प्रमेय का उपयोग करके किया जाता है)।
      नोट: कैंटिलीवर का स्प्रिंग स्थिरांक कैंटिलीवर की कठोरता का प्रतिनिधित्व करता है और कैंटिलीवर के प्रतिरोध बल द्वारा दिया जाता है क्योंकि यह एन / एम के संदर्भ में विरूपण लंबाई के अनुसार विकृत हो जाता है। कैंटिलीवर की संवेदनशीलता कैंटिलीवर (नैनोमीटर में) के विक्षेपण के जवाब में फोटोडायोड प्रतिक्रिया (वोल्ट में) के मूल्य को दर्शाती है और आमतौर पर एनएम / वी59 के संदर्भ में प्रस्तुत की जाती है। संपर्क-मुक्त मोड में, थर्मल शोर स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड किया जाता है और अंशांकन के बाद स्वचालित रूप से एएफएम नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा हाइड्रोडायनामिक फ़ंक्शन60 के साथ फिट किया जाता है। फिटिंग अंशांकन पैरामीटर प्रदान करती है, अर्थात् स्प्रिंग स्थिरांक और इनवोल्स। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एसडी-क्यूपी-बायोटी-टीएल -10 कैंटिलीवर का स्प्रिंग स्थिरांक 0.09 एन / एम था, जैसा कि निर्माता द्वारा घोषित किया गया था।

3. नमूना तैयारी II

  1. जमे हुए खंडों (-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, जैसा कि खंड 1, नमूना तैयारी I में वर्णित है) को 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पिघलाएं।
  2. 1x PBS में 4 °C पर 10 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) के साथ अनुभागों को ठीक करें, इसके बाद 1x PBS के साथ व्यापक धुलाई (5x) करें। अवशिष्ट पीबीएस को एक ऊतक के साथ अनुभाग के चारों ओर पोंछें और हाइड्रोफोबिक मार्कर पेन के साथ यकृत अनुभाग के चारों ओर लगभग 2 सेमी x 4 सेमी की सीमा चिह्नित करें। नमूने को 1x PBS के साथ कवर करें (सुनिश्चित करें कि सीमांकित क्षेत्र में ~ 1.2 mL 1x PBS है)। AFM माप के लिए नमूने का उपयोग करें।
    नोट: चूंकि पीएफए एक खतरनाक रसायन है, इसलिए इसे त्वचा या आंखों के संपर्क को रोकने के लिए देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। इसके जहरीले धुएं से बचने के लिए, पीएफए से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को प्रमाणित रासायनिक फ्यूम हुड या अन्य अनुमोदित हवादार क्षेत्र में किया जाना चाहिए।

4. मापन

  1. सेटअप टैब पर जाकर ऑटोसेव को सक्षम करें और ऑटोसेव पर टिक बनाएं। सेटअप टैब पर जाकर और फिर सेटिंग्स सहेजने पर क्लिक करके माप फ़ाइलों को सहेजने के लिए फ़ाइल नाम और निर्देशिका निर्दिष्ट करें।
  2. नमूना लोड करें (अनुभाग 3, नमूना तैयारी II के अनुसार तैयार)। लेजर चालू करके और दृष्टिकोण कुंजी पर क्लिक करके एएफएम कैंटिलीवर के साथ ऊतक की सतह से संपर्क करें । टिप ऊतक की सतह के संपर्क में होने के बाद, कैंटिलीवर टिप को इस तरह से वापस लें कि टिप उद्देश्य के फोकस में रहे ( वापसी कुंजी पर क्लिक करके, जो कैंटिलीवर को पीजो रेंज के शीर्ष छोर पर वापस ले लेता है)। डिटेक्टर को फिर से संरेखित करें यदि लेजर स्थिति लेजर संरेखण विंडो पर अपने केंद्र से दूर ले जाया जाता है।
  3. लेजर को बंद करें और सहायक उपकरण टैब पर क्लिक करके और फिर डायरेक्ट ओवरले ऑप्टिकल कैलिब्रेशन का चयन करके एएफएम माप मानचित्रों के साथ माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल क्षेत्र को ओवरले करें। सफल विंडो में, एक विशिष्ट क्षेत्र को स्कैन करने वाले कैंटिलीवर की छवियों की एक श्रृंखला लेने के लिए अगला पर क्लिक करें। अगली विंडो पर जाने के लिए फिर से अगला क्लिक करें।
  4. पहली छवि में, सॉफ्टवेयर में टिप स्थिति को चित्रित करने के लिए मैन्युअल रूप से कैंटिलीवर के सिरे के केंद्र पर क्लिक करें। टिप स्थिति को दर्शाने वाले सर्कल को सटीकता बढ़ाने के लिए इसकी त्रिज्या को इंगित करके आकार में हेरफेर किया जा सकता है। सभी छवियों में कैंटिलीवर टिप स्थिति का स्वचालित रूप से पता लगाने के लिए कैलिब्रेट क्लिक करें। छवियों के माध्यम से जाकर टिप डिटेक्शन की सटीकता की पुष्टि करें।
  5. ऑप्टिकल ओवरले को पूरा करने के लिए अगला क्लिक करें और फिर समाप्त करें और ऑप्टिकल अंशांकन के दौरान कैप्चर की गई छवियों की श्रृंखला को सहेजें।
  6. स्लाइड पर उच्च सतहों के साथ टकराव से बचने के लिए कैंटिलीवर को और मोड़ें। ध्रुवीकृत छवि का उपयोग करके डेटा व्यूअर टैब में दिखाई देने वाले हरे बॉक्स के अंदर कोलेजन युक्त क्षेत्र को स्थान देने के लिए मंच को स्थानांतरित करें। निर्दिष्ट हरे बॉक्स के अंदर बाएं माउस बटन पर एक लंबे प्रेस का उपयोग करके इसके चारों ओर एक आयत बनाकर कोलेजन युक्त क्षेत्र का चयन करें। बाईं ओर ग्रिड टैब के तहत चयनित क्षेत्र के आयाम, अभिविन्यास और रिज़ॉल्यूशन को परिभाषित करें। चयनित क्षेत्र को माप के क्षेत्र के रूप में सेट करने के लिए नए स्कैन क्षेत्र की पुष्टि करें पर क्लिक करें।
  7. फीडबैक लूप के IGain और PGain-पैरामीटर को डिफ़ॉल्ट मानों पर रखें, अगर सिस्टम ओवरसेंसिटिविटी के रूप में कोई बड़ी अस्थिरता प्रस्तुत नहीं की जाती है। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, IGain को 50 Hz और PGain को 0.001 पर सेट करें।
  8. सेटपॉइंट को 1 nN पर सेट करें।
    नोट: सेटपॉइंट स्थिर अवस्था के दौरान टिप-सतह इंटरैक्शन का बल है। अधिकांश नरम नमूनों (कोशिकाओं, जैल और ऊतकों) के लिए, 0.5-2.0 nN की सीमा में सेटपॉइंट मान उपयुक्त हैं।
  9. अध्ययन की गई सामग्री के यांत्रिक गुणों और कैंटिलीवर की कठोरता के अनुसार सापेक्ष सेटपॉइंट मान का चयन करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, मान को 5 nN पर सेट करें।
    नोट: सापेक्ष सेटपॉइंट इंटरैक्शन के अधिकतम बल का प्रतिनिधित्व करता है, जब बल-दूरी वक्र के शिखर तक पहुंच जाता है और टिप आंदोलन बेसलाइन पर लौटता है। नरम सामग्री (1-50 केपीए) के लिए, यह पैरामीटर नैनोन्यूटन (एनएन) की इकाइयों में सेट है। इसके अलावा, एक नरम कैंटिलीवर के लिए (0.05 एन / मीटर से 0.35 एन / एम तक स्प्रिंग स्थिरांक के साथ), अधिकतम बल जो लागू किया जा सकता है वह लगभग 50 एनएम है। तदनुसार SetPoint और सापेक्ष SetPoint मान समायोजित करें.
    1. सुनिश्चित करें कि दिए गए सेटपॉइंट मान से गोलाकार इंडेंटर की त्रिज्या से बड़ी इंडेंटेशन गहराई नहीं होती है, अन्यथा यंग के मापांक की गणना में इंडेंटिंग सतह को ठीक से परिभाषित नहीं किया जा सकता है। इंडेंटेशन के पहले रन के बाद इंडेंटेशन गहराई के औसत मूल्य की गणना करें; रिकॉर्ड किए गए डेटा को संसाधित करने का तरीका जानने के लिए अनुभाग 5, डेटा विश्लेषण देखें। यदि आवश्यक हो तो Setpoint मान समायोजित करें।
  10. बेसलाइन को 5 के रूप में समायोजित करें सेट करें।
    नोट: यहां, बेसलाइन दृष्टिकोण को फिट करने और वक्रों को वापस लेने के लिए उपयोग किए जाने वाले बहुपद की डिग्री को संदर्भित करता है। बेसलाइन को 5 पर सेट करना वक्रों को उच्च रिज़ॉल्यूशन में फिट करता है और इस प्रकार माप के दौरान पृष्ठभूमि शोर को कैप्चर करना सुनिश्चित करता है।
  11. नमूने की सतह स्थलाकृति के अनुसार जेड-अक्ष (जेड-लंबाई) में कैंटिलीवर आंदोलन की लंबाई का चयन करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, Z-लंबाई को 15 μm पर सेट करें।
    नोट: एक उच्च मान (जैसे 15 μm) माप संवेदनशीलता को कम करता है लेकिन आमतौर पर फाइब्रोटिक यकृत ऊतक जैसे अत्यधिक अनियमित सतह वाले नमूनों के लिए आवश्यक होता है।
  12. Z आंदोलन को निरंतर अवधि पर सेट करें।
    नोट: जेड आंदोलन को एक अलग मोड में जेड आंदोलन (एक्सटेंड स्पीड और एक्सटेंड टाइम) का उल्लेख करने वाले डेटा को देखने के लिए निरंतर गति पर भी सेट किया जा सकता है।
  13. विस्तार समय को 1 सेकंड तक सेट करें। विस्तार विलंब और वापसी विलंब को 0 के रूप में सेट करें.
    नोट: बहुत नरम सामग्री61 के लिए >5.0 μm / s की विस्तारित गति का उपयोग करें, क्योंकि कम इंडेंटेशन गति के परिणामस्वरूप नरम सतहों से अधिक चिपचिपा और कम लोचदार प्रतिक्रिया होगी। एक्सटेंशन देरी और वापसी देरी ऐसे पैरामीटर हैं जिनका उपयोग कैंटिलीवर टिप और सब्सट्रेट के बीच विशिष्ट बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए स्लाइड सतह पर स्थिर प्रोटीन के साथ कैंटिलीवर की सतह पर स्थिर प्रोटीन की बातचीत)।
  14. नमूना दर 5000 हर्ट्ज के रूप में सेट करें।
    नोट: नमूना दर उन बिंदुओं की आवृत्ति को संदर्भित करती है जो एक पूर्ण दृष्टिकोण-वापस वक्र पर दर्ज किए जाते हैं। इसे उच्च मान (जैसे 5000 हर्ट्ज) पर सेट करें ताकि उनके बेहद तेज संक्रमण के कारण वक्रों के कुछ क्षेत्रों को गायब होने से बचाया जा सके।
  15. फीडबैक लूप सिस्टम को सक्षम करने के लिए टिक के साथ जेड क्लोज्ड लूप को चिह्नित करें, जो नमूना सतह और कैंटिलीवर टिप के बीच दूषित दूरी सुनिश्चित करता है।
  16. संलग्न करके मोटर चालित चरण को अलग करें और कैंटिलीवर के साथ नमूने तक पहुंचने के लिए दृष्टिकोण पर क्लिक करें। चरण 6 में सेट किए गए क्षेत्र में बल-दूरी मोड़ एकत्र करना शुरू करने के लिए स्कैनिंग शुरू करें पर क्लिक करें; धारा 4, मापन।

5. डेटा विश्लेषण

  1. ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर "एटॉमिकजे" (जिसे https://sourceforge.net/projects/jrobust/ से डाउनलोड किया जा सकता है) का उपयोग करके अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करें।
    नोट: यह एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, जेपीके इंस्ट्रूमेंट्स या ब्रुकर परमाणु बल माइक्रोस्कोप से एकत्र की गई फ़ाइलों का समर्थन करता है।
  2. परमाणु जे (पूरक चित्रा एस 2 ए, एक्स) में प्रक्रिया बल वक्रों और मानचित्र आइकन पर क्लिक करके कार्यक्रम में बल वक्रों को लोड करें। प्रसंस्करण सहायक में, ऐड बटन (पूरक चित्रा एस 2 ए, वाई) पर क्लिक करके विश्लेषण किए जाने वाले मानचित्र जोड़ें। नक्शे लोड होने के बाद अगला पर क्लिक करें (पूरक चित्रा एस 2 ए, जेड)।
  3. नीचे वर्णित चरणों के अनुसार अगली विंडो में प्रसंस्करण सेटिंग्स निर्दिष्ट करें ( पूरक चित्रा एस 2 बी, चरण 1-11 में चरणों के अनुरूप):
    1. नमूना और कैंटिलीवर के बीच संपर्क बिंदु का अनुमान गणना द्वारा मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से फिटिंग वक्र मापदंडों के एक सेट का उपयोग करके करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, संपर्क बिंदु के स्वचालित अनुमान का उपयोग करें।
    2. शास्त्रीय केंद्रित ग्रिड विधि द्वारा कैंटिलीवर और नमूने के बीच संपर्क बिंदु निर्धारित करें।
    3. मापा बल वक्रों की गुणवत्ता के आधार पर संपर्क बिंदु का सर्वोत्तम निर्धारण प्राप्त करने के लिए आकलन विधि का चयन करें, जिसे डेटा विश्लेषण के अनुकूलन के दौरान अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, मॉडल स्वतंत्र विधि का उपयोग करें।
    4. शास्त्रीय मॉडल का उपयोग करके बल इंडेंटेशन वक्र फिट करें (इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए मॉडल फिट के लिए शास्त्रीय एल 2 का उपयोग करें)।
      नोट: मॉडल फिट और संपर्क अनुमानक पैरामीटर हैं जो नियंत्रित करते हैं कि सॉफ्टवेयर द्वारा वक्रों को कैसे फिट किया जाता है और क्रमशः फिट किए गए वक्र में संपर्क बिंदु कैसे स्थापित किया जाता है। इन मापों के लिए, शास्त्रीय विकल्प का उपयोग किया गया था, जो कम से कम वर्ग प्रतिगमन का उपयोग करता है। यह वक्र पर प्रत्येक निम्न-बल बिंदु को परीक्षण संपर्क बिंदु के रूप में संसाधित करता है और परीक्षण संपर्क बिंदु से पहले क्षेत्र में एक बहुपद फिट बैठता है। यह तब एकत्रित बल इंडेंटेशन डेटा के लिए उपयुक्त संपर्क मॉडल फिट बैठता है। वह बिंदु जो वर्गों का सबसे कम योग देता है, उसे संपर्क बिंदु के रूप में माना जाता है। 62,63 प्राप्त बल वक्रों की गुणवत्ता के आधार पर अन्य विधियों का उपयोग किया जा सकता है।
    5. मॉडल के फिट को निकास वक्र पर सेट करें।
    6. पोइसन के अनुपात को 0.45 के रूप में सेट करें, जैसा कि यकृत24 जैसे नरम ऊतकों के लिए अनुशंसित है।
    7. 3 की बेसलाइन डिग्री और 1 की इन-कॉन्टैक्ट डिग्री का उपयोग करके वक्र का फिट सेट करें। मॉडल से वक्रों के विचलन के पैमाने के आधार पर बहुपद फिट की डिग्री बदलें।
    8. वापसी वक्रों को फिट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मॉडल का चयन करें। स्नेडन मॉडल का उपयोग करें, जो समीकरण (1) और समीकरण (2) के आधार पर यंग के मापांक की गणना करता है:
      Equation 1(1)
      δ = Equation 2 (2)
      जहां F बल है, E यंग का मापांक है, v नमूने का पॉइसन अनुपात है, δ इंडेंटेशन की गहराई है, a संपर्क त्रिज्या है, और R गोले की त्रिज्या62,63 है।
    9. गोलाकार नोक की त्रिज्या को माइक्रोमीटर (इस प्रोटोकॉल में 2.9 μm ) में भरें।
    10. रीड-इन सक्षम करके डेटा फ़ाइलों से स्प्रिंग स्थिरांक और InvOLS लोड करें (बक्से चेक करें)।
    11. फिनिश पर क्लिक करें।
      नोट: विश्लेषण किए गए डेटा को ऊर्ध्वाधर विक्षेपण, ऊंचाई, आसंजन, संपर्क बल, विरूपण, आसंजन बल, आर2 मान, ढलान, यंग के मापांक, संक्रमण इंडेंटेशन, संक्रमण बल और प्रत्येक बल वक्र के लिए गणना की गई संपर्क स्थिति के नक्शे के रूप में प्रस्तुत किया जाता है (पूरक चित्रा एस 3, ऊपरी बाएं)। दो अतिरिक्त खिड़कियां बल वक्र और कच्चे मान प्रदर्शित करती हैं (पूरक चित्रा एस 3, ऊपरी दाएं और निचले पैनल, क्रमशः)।
  4. बल वक्रों को बाहर करें जहां कैंटिलीवर गलत तरीके से यकृत अनुभाग की सतह के करीब पहुंचता है। इनकी पहचान करने के लिए, उच्च शोर, असामान्य आकार और / या अपूर्ण दृष्टिकोण वाले वक्रों की तलाश करें, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है और कहीं और विस्तार से चर्चा की गईहै।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि बल-विस्थापन वक्रों के उदाहरण। (A, B) कठोर के लिए प्रतिनिधि व्याख्यात्मक बल वक्र (A; E = 10.5 kPa) और नरम (B; ई = 1.78 केपीए) क्षेत्र जो विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। (C-F) प्रतिनिधि अव्याख्याय ग्राफ़ जिन्हें (सी-ई) गलत दृष्टिकोण या (एफ) उच्च शोर के कारण विश्लेषण से बाहर रखने की आवश्यकता है। जैसा कि (ए) में प्रदान की गई किंवदंती में दर्शाया गया है, लाल वक्र कैंटिलीवर के दृष्टिकोण को दर्शाते हैं, और हरे वक्र कैंटिलीवर के वापसी को दर्शाते हैं। काली रेखाएं कैंटिलीवर के वापसी वक्र की फिटिंग दिखाती हैं। काली रेखाओं का ढलान यंग के मापांक से मेल खाता है। लाल और नीले बिंदु क्रमशः संपर्क बिंदु और संक्रमण बिंदु के अनुरूप हैं। संपर्क बिंदु वापसी के दौरान कैंटिलीवर और सब्सट्रेट के बीच संपर्क का अंतिम बिंदु है, जबकि संक्रमण बिंदु कैंटिलीवर के दृष्टिकोण से वापसी तक संक्रमण का वर्णन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

हल्के रूप से तय, नियंत्रण चूहों से प्राप्त 30 μm मोटी यकृत खंडों और हल्के या उन्नत फाइब्रोसिस वाले चूहों से (क्रमशः 3 सप्ताह या 6 सप्ताह के लिए CCl4 के इंजेक्शन से प्रेरित) को AFM के साथ जांच की गई थी जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। कठोरता मानचित्रों के माप के लिए केंद्रीय नसों के करीब कोलेजन फाइबर का चयन किया गया था। केंद्रीय नसों के करीब के क्षेत्र, जो उन क्षेत्रों के अनुरूप हैं जहां सीसीएल4-उपचारित जानवरों में कोलेजन फाइबर आमतौर पर बनते हैं, नियंत्रण यकृत (चित्रा 4 ए) में विश्लेषण किया गया था। यंग के मोडुलिन का वितरण एक एकल यकृत खंड (चित्रा 4 बी: बाएं वायलिन प्लॉट) के भीतर विभिन्न नियंत्रण यकृत और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था।

सीसीएल4-उपचारित जानवरों में, कोलेजन जमा के पेरीसेंट्रल क्षेत्रों के अनुरूप कठोरता मानचित्रों ने नियंत्रण चूहों में समकक्ष क्षेत्रों की तुलना में यंग के मापांक के काफी अधिक मूल्य दिखाए (चित्रा 4 बी: 1.9 केपीए बनाम 2.6 केपीए औसत यंग के नियंत्रण के लिए मापांक मान बनाम 3 सप्ताह सीसीएल4-उपचारित माउस; पी = 0.07; 1.9 केपीए बनाम 5.1 केपीए औसत यंग का मापांक मान बनाम 6 सप्ताह सीसीएल4 -इलाज माउस; पी = 0.02)। इसके अलावा, लंबे सीसीएल4 उपचार के साथ यंग के मापांक के मूल्यों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी (चित्रा 4 बी; 2.6 केपीए बनाम 5.1 केपीए औसत यंग के मापांक मान 3 सप्ताह बनाम 6 सप्ताह सीसीएल4-उपचारित माउस; पी = 0.04)। यह फाइब्रोसिस प्रगति के साथ कोलेजन जमा की क्रमिक कठोरता को दर्शाता है और एएफएम माप फाइब्रोजेनेसिस को दर्शाता है।

कोलेजन फाइबर के यांत्रिक गुणों पर ओसीटी-एम्बेडेड यकृत वर्गों के लंबे समय तक भंडारण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने सीसीएल4-उपचारित चूहों के वर्गों में कोलेजन फाइबर की कठोरता को मापा, जिन्हें काटने के बाद स्लाइड पर 2 सप्ताह या 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था (चित्रा 5)। एएफएम माप ने नमूना सेक्शनिंग के 2 सप्ताह के भीतर मापे गए वर्गों से प्राप्त वर्गों की तुलना में 3 महीने के लिए संग्रहीत वर्गों के लिए कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में यंग के मापांक के काफी कम मूल्य दिखाए (चित्रा 5; 4.7 केपीए बनाम 3.6 केपीए औसत यंग के मापांक मान 2 सप्ताह बनाम 3 महीने के भंडारण; पी < 0.001)। इस प्रकार, ओसीटी-एम्बेडेड लिवर लोब से अनुभाग तैयार होने के तुरंत बाद यकृत ऊतक के यांत्रिक गुणों को मापना महत्वपूर्ण है।

Figure 4
चित्रा 4: एएफएम माप लंबे समय तक सीसीएल4 उपचार के साथ सहसंबंधित कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों की प्रगतिशील कठोरता को प्रकट करते हैं। (ए) 3 सप्ताह या 6 सप्ताह के लिए सीसीएल 4 के साथ इलाज किए गएचूहों और चूहों से यकृत वर्गों का उपयोग कोलेजन युक्त क्षेत्रों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए किया गया था। ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी छवियों (बाएं) में दिखाए गए यकृत वर्गों के बॉक्स किए गए क्षेत्र कोलेजन युक्त स्कैन क्षेत्र (या नियंत्रण यकृत में संबंधित क्षेत्र) हैं जो एएफएम माप (30 μm x 100 μm, 10 पिक्सेल x 36 पिक्सेल) के लिए चुने गए हैं। इन बॉक्स किए गए क्षेत्रों के अनुरूप रंग तराजू के साथ यंग के मापांक मानचित्र दाईं ओर दिखाए गए हैं, जिसमें इन मानचित्रों से यंग के मापांक मूल्यों के हिस्टोग्राम शामिल हैं; इनसेट स्कैटर प्लॉट प्रत्येक स्थिति के लिए >10 kPa मान दिखाते हैं। जिगर की कठोरता को हिस्टोग्राम वितरण में क्रमिक दाईं ओर बदलाव और इनसेट स्कैटर प्लॉट में बिंदुओं की उच्च आवृत्ति के रूप में देखा जाता है। (बी) वायलिन प्लॉट प्रत्येक स्थिति (बाएं) के लिए मापे गए तीन क्षेत्रों से लोचदार मोडुलिन के वितरण को दर्शाते हैं और सभी तीन मानचित्रों (दाएं) से लोचदार मोडुलिन मूल्यों को संक्षेप में दिखाते हैं। वायलिन प्लॉट औसत (लाल रेखा), 25वें प्रतिशत और 75 वें प्रतिशत (काली रेखाएं) दिखाते हैं; डॉट्स क्षेत्र 1-3 से अलग-अलग मानचित्रों के औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रस्तुत पी-मानों की गणना साधनों पर किए गए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: यकृत वर्गों के विस्तारित भंडारण से कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता में कमी आती है। 2 सप्ताह या 3 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत यकृत अनुभागों (2 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों से तैयार) का उपयोग यंग के मापांक को मापने के लिए किया गया था। ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी छवियां (बाएं) एएफएम माप के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों को इंगित करने वाले बक्से के साथ (30 μm x 100 μm, 10 पिक्सेल x 36 पिक्सेल)। संबंधित यंग के मापांक रंग तराजू (दाएं) के साथ मानचित्र। हिस्टोग्राम प्रत्येक नमूने में 4-6 क्षेत्रों से एकत्र किए गए यंग के मापांक मान दिखाते हैं; इनसेट स्कैटर ग्राफ़ प्रत्येक स्थिति के लिए >10 kPa मान दिखाते हैं। स्केल बार = 20 μm। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; सीसीएल4 = कार्बन टेट्राक्लोराइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: मेलामाइन राल माइक्रो बीड के साथ कैंटिलीवर को संशोधित करने की विधि। (ए) तैयार योजनाबद्ध कैंटिलीवर के सिरे पर एक गोलाकार मोती के लगाव को दर्शाता है। चरण-वार विवरण के लिए, अनुभाग 2, भाग 1, एएफएम कैंटिलीवर टिप के लिए 5.7 μm मोती का अनुलग्नक देखें। (बी) शीर्ष (बाएं) और पार्श्व दृश्य (दाएं) से दिखाए गए कैंटिलीवर सिरे से जुड़े गोलाकार 5.7 μm मोती की माइक्रोस्कोपी छवि। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; आरटी = कमरे का तापमान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: परमाणु जे में डेटा विश्लेषण। (ए) परमाणुजे में कठोरता मानचित्र खोलने के लिए पालन किए जाने वाले चरणों का अनुक्रम। प्रक्रिया बल वक्रों और मानचित्रों (x) पर एक एकल बाएं-क्लिक प्रसंस्करण सहायक को खोलता है। ऐड (वाई) पर क्लिक करके और आवश्यक फ़ाइलों का चयन करके फ़ाइलों को प्रसंस्करण सहायक में लोड किया जा सकता है। अगले चरण पर जाने के लिए अगले (जेड) पर क्लिक करें। (बी) माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले वक्र फिटिंग, उपयुक्त संपर्क यांत्रिकी मॉडल और एएफएम सेटिंग्स के लिए पैरामीटर। चरण 1-11 प्रोटोकॉल चरण 3, धारा 5, डेटा विश्लेषण में विस्तृत संबंधित उप-बिंदुओं को संदर्भित करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: परमाणुजे में विश्लेषण किए गए डेटा की रूपरेखा। विश्लेषण किए गए डेटा का पूर्वावलोकन कठोरता मानचित्र (ऊपरी बाईं खिड़की), बल वक्र (ऊपरी दाईं खिड़की), और कच्चे डेटा (निचली खिड़की) को दर्शाता है। संक्षिप्त नाम: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सामान्य और फाइब्रोटिक माउस यकृत ऊतक के एएफएम माप के लिए एक चरण-दर-चरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करता है। युग्मित ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करती है और कोलेजन फाइबर के विज़ुअलाइज़ेशन को उनके विघटन के कारण सक्षम बनाती है। इसके अलावा, प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है। एएफएम कठोरता माप सेलुलर स्तर पर किया जा सकता है, जो फाइब्रोटिक रोग के विकास के कारण यकृत ऊतक यांत्रिक गुणों में स्थानीय परिवर्तनों की निगरानी करने की अनुमति देता है। लिवर फाइब्रोसिस पूरे अंग को प्रभावित करने वाली एक सजातीय प्रक्रिया नहीं है। इसके विपरीत, कोलेजन युक्त फाइब्रोटिक सेप्टा के क्षेत्रों को कम या बिना कोलेजन जमा वाले क्षेत्रों के साथ जोड़ा जाता है। इस प्रकार, कठोरता परिवर्तन स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए विशिष्ट हैं और केवल चोट से क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के संपर्क में स्थानीय रूप से कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं। कठोरता विषमता का यह माइक्रोस्केल एएफएम यंग के मापांक मानचित्रों के विवरण में भी स्पष्ट है, जहां उच्च कठोरता के बिंदु लगभग सामान्य कठोरता के क्षेत्रों की सीमा बनाते हैं। इस भिन्नता से पता चलता है कि यहां तक कि कोलेजन निशान ऊतक क्षेत्र यांत्रिक रूप से सजातीय नहीं है और सेलुलर स्तर पर एएफएम माप की विशेषता की आवश्यकता होती है (चित्रा 4)।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत संग्रह से स्वतंत्र रूप से एएफएम द्वारा यकृत कठोरता के माप की अनुमति देता है, क्योंकि ओसीटी में एम्बेडेड पूरे यकृत लोब को -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एक बार ऊतक को विभाजित करने के बाद, हम ~ 2 सप्ताह के भीतर नमूनों को मापने की सलाह देते हैं क्योंकि हमने लंबे समय तक संग्रहीत ऊतक वर्गों के क्रमिक नरम होने को देखा है (चित्रा 5)।

ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी से लैस एएफएम यकृत लोब्यूल संरचना के भीतर रुचि के क्षेत्र का सटीक पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, इसकी कुछ सीमाएं भी हैं जिन्हें परिणामों की व्याख्या करते समय विचार करने की आवश्यकता है। यहां प्राप्त कठोरता मूल्यों को कमरे के तापमान पर मापा गया था। हम मानते हैं कि नरम ऊतक के यांत्रिक गुणों पर तापमान का प्रभाव छोटा होगा; हालांकि, यह यकृत ऊतकों के यांत्रिक गुणों के विवो मूल्यों और इस अध्ययन में मूल्यों के बीच अंतर के कारणों में से एक हो सकता है।

इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल 3 घंटे तक यकृत ऊतक के एएफएम विश्लेषण की अनुमति देता है, जिसके लिए ऊतक के हल्के निर्धारण की आवश्यकता होती है। ऊतक वर्गों के हल्के निर्धारण, साथ ही फ्रीज-पिघलना चक्र, यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों को प्रभावित करेगा। इस प्रकार, यंग के मोडुलिन के रिपोर्ट किए गए मूल्य विवो मूल्यों से भिन्न हो सकते हैं। यकृत वर्गों से यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों के माप के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, जिसे यकृत ऊतक64 के निर्धारण के लिए एक अलग विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

बहरहाल, हमने 6 सप्ताह की तुलना में 3 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों के यकृत में कोलेजन युक्त क्षेत्रों की बढ़ती कठोरता देखी। इस तरह के परिवर्तन लंबे समय तक चोट के दौरान फाइब्रोसिस प्रगति के अनुरूप होते हैं (चित्रा 4) और दिखाते हैं कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभिन्न उपचारों के बीच सापेक्ष अंतर की जांच की जा सकती है। यह कैलो एट अल के अवलोकनों के साथ सहमति में है, जिन्होंने दिखाया कि हल्के से निश्चित यकृत खंड कोलेजन युक्त और कोलेजन की कमी वाले क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान अंतर दिखाते हैं जैसा कि ताजा ऊतक25 में होता है।

हमने माप के दौरान यकृत ऊतक के यांत्रिक व्यवधान को कम करने के लिए 5.7 μm व्यास गोलाकार टिप के साथ संशोधित एसडी-क्यूपी-बायोटी-टीएल -10 कैंटिलीवर (सैद्धांतिक स्प्रिंग स्थिरांक ~ 0.09 एन / एम) का उपयोग किया। एक 5.7 μm मोती ने इसकी अखंडता को संरक्षित करते हुए इसकी कठोरता की जांच करने के लिए नमूने के पर्याप्त इंडेंटेशन को सक्षम किया। कठोरता मानचित्रों में उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए कई अनुकूलनों के बाद, एक छोटे व्यास वाले मोती का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यंग के मापांक मूल्यों की और अधिक अतिवृद्धि हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए, देखें क्रिचटन एट अल.65)। निर्दिष्ट कैंटिलीवर-बीड पहनावा का उपयोग करके, हम पीए की दसियों इकाइयों से ~ 100 केपीए तक, एक विस्तृत श्रृंखला में नमूना कठोरता को चिह्नित करने में सक्षम थे।

स्नेडन के मॉडल का उपयोग बल वक्रों से यंग के मापांक को प्राप्त करने के लिए किया गया था, क्योंकि यह कोलाइडल जांच62 के साथ गहरे इंडेंटेशन के विश्लेषण की अनुमति देता है। हर्ट्ज के मॉडल के विपरीत स्नेडन का मॉडल, इस बाधा से ग्रस्त नहीं है कि संपर्क त्रिज्या गोले त्रिज्या की तुलना में बहुत छोटी होनी चाहिए। यह आगे मानता है कि नमूना मोटाई इंडेंटेशन गहराई30,66 से कई गुना अधिक है। वर्तमान अध्ययन में, इंडेंटेशन ~ 2 μm था जिसमें 5.7 μm के मोती का आकार और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में 30 μm की नमूना मोटाई थी; इस प्रकार, स्नेडन का मॉडल उपयुक्त था। टिप और सब्सट्रेट के बीच आसंजन बल पर विचार करने वाले अन्य मॉडल63 का उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों के लिए किया जा सकता है।

एटॉमिकजे में विश्लेषण यंग के मापांक62,67 को प्राप्त करते हुए सब्सट्रेट के योगदान को कम करने के लिए नमूनों की परिमित मोटाई के लिए सुधार लागू करता है। प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण में, हमने 0.45 के एकल पोइसन अनुपात का उपयोग किया, जिसे पहले नरम ऊतकअंगों 24 के लिए अनुशंसित किया गया था। इस सन्निकटन का यंग के मापांक के परिकलित मूल्यों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है, क्योंकि पोइसन के अनुपात के मान में 0.4 से 0.5 तक परिवर्तन के परिणामस्वरूप स्नेडन के समीकरण के अनुसार गणना किए गए यंग के मापांक मानों में केवल 0.893x की कमी होती है। सीसीएल 4 उपचारों की विभिन्न अवधियों के बीच यंग के मापांक में कई गुना अंतरको देखते हुए, पोइसन के अनुपात को अनुमानित करके उत्पन्न त्रुटियां केवल मामूली हैं।

हमने कठोरता मूल्यों की गणना करने के लिए वापस वक्रों का उपयोग किया, क्योंकि हम इंडेंटेशन68 के लिए प्लास्टिक प्रतिक्रिया के बजाय कैंटिलीवर द्वारा प्रदान किए गए भार के लिए ऊतक की लोचदार प्रतिक्रिया में रुचि रखते थे। नरम ऊतक की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया के कारण, वापसी वक्रों को फिट करना यंग के मापांक को अधिक महत्व दे सकता है, जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, हमने देखा है कि दृष्टिकोण वक्रों के साथ डेटा विश्लेषण फाइब्रोटिक और नियंत्रण क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान रुझान पैदा करता है, हालांकि पूर्ण मान तदनुसार कम हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, हमने माप की प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण कई चरणों की पहचान की। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कैंटिलीवर से संलग्न करते समय मोती लगभग पारभासी नोक के केंद्र में है। यह इंडेंटेशन के दौरान संभावित यांत्रिक असंतुलन को रोकता है। दूसरा, पीएफए के साथ यकृत निर्धारण के दौरान, पिघलने और निर्धारण के लिए समय सीमा का सख्ती से पालन करना आवश्यक है। इस चरण के समय को बदलना ऊतक वर्गों के यांत्रिक गुणों को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकता है। तीसरा, तापमान में उतार-चढ़ाव के कारण कठोरता मूल्यों में होने वाली किसी भी कलाकृतियों से बचने के लिए कैंटिलीवर को समवर्ती तापमान मूल्यों की निरंतर निगरानी और इनपुट के साथ बार-बार कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। अंत में, एक एकल यकृत अनुभाग को तैयारी से 3 घंटे से अधिक समय तक नहीं मापा जाना चाहिए, क्योंकि ओवरलेड पीबीएस लंबी अवधि में वाष्पित हो सकता है। पाठक एएफएम माप के दौरान आने वाली समस्याओं को हल करने के लिए समस्या निवारण तालिका (तालिका 3) का उल्लेख कर सकते हैं, जिसकी चर्चा नॉर्मन एट अल.46 में भी की गई है।

तालिका 3: समस्या निवारण मार्गदर्शिका. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत ऊतक की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एएफएम जांच की अनुमति देता है। इसमें सूक्ष्म स्तर पर फाइब्रोटिक यकृत रोग के विकास और अंतिम प्रतिगमन पर जानकारी प्रकट करने की क्षमता है और पुरानी यकृत रोग की प्रगति के दौरान गठित फाइब्रोटिक निशान क्षेत्रों को लक्षित करने वाले उपचारों के विकास में योगदान कर सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चेक गणराज्य की अनुदान एजेंसी (18-02699 एस), चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आरवीओ 68378050) की संस्थागत अनुसंधान परियोजना और एमईवाईएस सीआर परियोजना एनआईसीआर एक्सेलेस (एलएक्स 22 एनपीओ 05102) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआईआईएसबी, इंस्ट्रक्ट-सीजेड सेंटर ऑफ इंस्ट्रक्ट-एरिक ईयू कंसोर्टियम, एमईवाईएस सीआर इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोजेक्ट एलएम 2018127 और यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि-परियोजना "यूपी सीआईआईएसबी" द्वारा वित्त पोषित है। CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) ने सीएफ नैनोबायोटेक्नोलॉजी, CEITEC MU में माप का वित्तीय रूप से समर्थन किया। हम लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, आईएमजी सीएएस, प्राग, चेक गणराज्य को भी स्वीकार करते हैं, जो एमईवाईएस (एलएम 2018129, सीजेड.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) और आरवीओ: 68378050-केएवी-एनपीयूआई द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM head Bruker JPK nanowizard 3
Cameras Andor Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
The Imagingsource  S/N:12310015
Cantilever SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors S/N:73750F05
Cryotome Leica  CM1950
Epoxy resin glue (Long working time ) Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um Microparticles, GmbH MF-R-5.7
Microscope Olympus  IX81
Hydrophobic  slide marker SuperHT PAP PEN
Software JPK nanowizard  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides Thermoscientific ref no. J1800AMNZ
System Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit Tablestable AVI-200-S

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जीव विज्ञान अंक 185 यकृत फाइब्रोसिस कोलेजन जमा यकृत कठोरता लोचदार मापांक परमाणु बल माइक्रोस्कोपी
ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यकृत कठोरता का मापन
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Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S.,… More

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S., Hadraba, D., Jirouskova, M., Gregor, M. Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63974, doi:10.3791/63974 (2022).

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