Summary
우리는 원자력 현미경을 사용하여 정상 및 병든 간에서 콜라겐이 풍부한 영역의 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 편광 현미경의 동시 사용은 간 절편에서 콜라겐이 풍부한 부위를 국소화하기 위한 높은 공간 정밀도를 제공합니다.
Abstract
매트릭스 경화는 간 섬유증 진행의 주요 동인 중 하나로 인식되었습니다. 그것은 세포 기능, 분화 및 운동성과 같은 세포 행동의 다양한 측면에 지대한 영향을 미칩니다. 그러나 이러한 과정이 전체 장기에서 균질하지 않기 때문에 세포 수준에서 조직의 기계적 특성 변화를 이해하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다.
간엽 내 콜라겐이 풍부한 영역의 경화를 모니터링 할 수 있도록이 논문은 원자력 현미경 (AFM)으로 높은 공간 정밀도로 간 조직 탄성 계수를 측정하는 프로토콜을 제시합니다. AFM은 영률(탄성이라고도 함)로 계산되는 국부적 기계적 특성을 특성화할 수 있는 민감한 방법입니다. 편광 현미경과 결합 된 AFM은 조직에서 콜라겐 섬유의 복굴절을 기반으로 섬유증 발생 영역을 구체적으로 찾는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 프로토콜을 사용하여, 우리는 섬유성 마우스 간으로부터의 콜라겐이 풍부한 영역과 대조군 마우스의 간에서 상응하는 영역의 강성을 특성화하였다.
콜라겐 양성 영역의 강성의 현저한 증가가 섬유증 발달과 함께 관찰되었습니다. 제시된 프로토콜은 약간 고정 된 간 조직의 사용으로 인해 국소 조직의 기계적 특성의 질병 유발 변화와 이웃 세포의 운명에 미치는 영향에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수있는 AFM 측정의 재현성이 높은 방법을 허용합니다.
Introduction
간은 유기체 1,2에서 항상성을 유지하는 데 중요한 기관입니다. 만성 간 질환은 전 세계적으로 매년 ~ 2 백만 명의 사망자를 차지합니다3. 그들은 바이러스 감염,자가 면역 질환, 대사 증후군 또는 알코올 남용 관련 질병으로 가장 일반적으로 발생하며 진행성 간 섬유증을 동반합니다. 간 손상은 염증 반응을 유도하여 상처 치유 반응에서 세포 외 기질 (ECM)을 침착시키는 세포의 활성화를 유도합니다. 그러나 만성 모욕이있는 경우 과도한 ECM은 간 내에 해결되지 않은 흉터 조직을 형성하여 간 섬유증, 간경변, 간암의 발병 및 궁극적으로 간부전으로 이어집니다4.
간세포 손상은 즉시 간 경직을 증가시킵니다 5,6. 이것은 간세포 기능에 직접적인 영향을 미치고 간 성상 세포 (HSC) 및 문맥 섬유 아세포를 활성화하며 콜라겐 침착 근섬유 아세포로 전이 분화합니다 7,8. 섬유질 ECM의 침착은 간 경직을 더욱 증가시켜 간 경화 및 매트릭스 생성 세포 활성화의 자가 증폭 피드백 루프를 생성합니다.
따라서 간 경직은 간 질환 예후에 중요한 매개 변수가되었습니다. 생체역학적 조직 특성의 변화는 섬유증이 조직학적 분석에 의해 진단될 수 있는 것보다 더 일찍 검출될 수 있다. 따라서 간 경화도 측정을위한 다양한 기술이 연구 및 임상 응용 모두에서 개발되었습니다. 임상 환경에서 일시적인 탄성 조영술 (TE) 9,10,11,12,13 및 자기 공명 탄성 검사 (MRE) 14,15,16,17,18은 총 간 경직 19을 검사하여 간 손상의 초기 단계를 비 침습적으로 진단하는 데 사용되었습니다.
TE에서는 약한 진폭과 저주파 (50Hz)의 초음파가 간을 통해 전파되고 속도가 측정되어 조직 탄성 계수13을 계산하는 데 사용됩니다. 그러나, 이 기술은 간 주변 조직을 통한 초음파의 부적절한 전달로 인해 복수, 비만 또는 하부 늑간 공간을 갖는 환자에게는 유용하지 않다9.
MRE는 자기 공명 영상 방식을 기반으로하며 20-200Hz 기계적 전단파를 사용하여 간을 표적으로 삼습니다. 이어서, 특정 자기 공명 영상 시퀀스가 조직 내부의 파동을 추적하고 조직 강성(16)을 계산하는데 사용된다. TE 및 MRE 기술 모두로보고 된 강성 값은 조직 학적 METAVIR 점수20을 사용하여 순위가 매겨진 인간 간 샘플의 생검에서 얻은 간 섬유증 정도와 잘 상관 관계가 있습니다 (표 1). TE와 MRE는 또한 연구 목적21,22,23을 위한 설치류 모델의 간 경직도 측정에 적용되었습니다. 그러나 두 방법 모두 전파 전단파에 대한 조직의 반응에서 강성 값을 도출하므로 얻은 값은 조직의 절대 기계적 강성을 반영하지 않을 수 있습니다.
설치류 간의 직접적인 기계적 특성화를 위해 Barnes 등은 폴리 아크릴 아미드 겔24에 간 조직을 매립하는 것을 포함하는 모델-겔-조직 분석 (MGT 분석)을 개발했습니다. 이 젤은 영률을 계산할 수있는 펄스 균일 한 힘에 의해 압축됩니다. MGT 분석은 정상 및 섬유성 간 모두에 적합한 압흔 분석과 양호한 상관관계를 나타낸다(표 1).
표 1 : 벌크 수준의 간 경화도 값. TE와 MRE는 다양한 출처의 간에 대한 압흔 및 MGT 분석을 사용한 간 탄성 계수의 직접적인 생체 외 기계적 측정과 비교했습니다. E와 G의 관계는 E = 2G (1 + v)로 주어지며, 여기서 v는 샘플의 푸 아송 비율입니다. F0 내지 F4는 METAVIR 채점 시스템에서 섬유증 점수를 나타내고, F0은 섬유증이 낮거나 전혀 없음, F4 간경변성 간을 나타낸다. 약어 : TE = 일시적인 탄성; MRE = 자기 공명 탄성; MGT = 모델-겔-조직; E = 탄성 (영) 계수; G = 전단 계수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
일반적인 간 경직 측정의 주요 단점 중 하나는 간에서 경직 이질성에 대한 세포 수준의 해상도를 제공하지 않는다는 것입니다. 섬유증이 진행되는 동안, 콜라겐이 풍부한 영역은 주변 실질25,26에 비해 더 높은 강성을 나타낸다. 이러한 강성 구배는 국부적으로 상주 세포에 영향을 미치며 HSC 이질성을 유도하는 데 중요한 역할을 합니다(27). 따라서 간 질환 발병 중 국소 기계적 특성의 변화는 섬유증 진행을 더 잘 이해하기 위해 현미경 수준에서 특성화되어야합니다.
AFM을 사용하면 조직의 기계적 특성을 고분해능 및 높은 힘 감도로 측정 할 수 있습니다. AFM은 캔틸레버의 팁을 사용하여 몇 피코네우톤만큼 낮은 힘으로 샘플 표면을 들여쓰기하여 사용된 팁의 형상과 크기에 따라 미세한 또는 나노적 수준에서 변형을 유도합니다. 적용된 변형률에 대한 샘플의 힘 응답은 캔틸레버(28)에서의 처짐으로서 측정된다. 힘-변위 곡선은 캔틸레버의 접근 및 후퇴로부터 수집되며, 이는 샘플(29)의 국부적 강성을 평가하기 위해 적절한 접촉 역학 모델을 장착할 수 있다.
주어진 영역의 강성을 측정하는 것 외에, AFM은 또한 콜라겐 섬유(30,31,32)의 구조와 같은 샘플의 특정 특징에 대한 지형 정보를 제공할 수 있다. 여러 연구에서는 환자 및 마우스 모델 샘플 모두에서 피부 32,33, 폐 34,35, 뇌36, 유방37,38,39, 연골 40 또는 심장41,42,43,44와 같은 다양한 건강하고 병든 조직의 강성을 측정하기 위해 AFM을 적용하는 방법을 설명했습니다. 또한, AFM은 또한 세포 및 세포외 단백질 스캐폴드45,46,47의 강성을 결정하기 위해 시험관내에서 사용되었다.
AFM을 사용한 생물학적 샘플의 기계적 특성 측정은 부드러움과 취약성으로 인해 중요하지 않습니다. 따라서 다양한 연구에서 다양한 조건과 설정을 표준화하여 영률의 변동이 심한 값을 산출했습니다 (Mckee et al.48에 의해 검토 됨). 다른 연조직과 유사하게, 다른 등급의 간 섬유증에서 간 영률 값도 광범위한 변화를 보여줍니다 (표 2). 영률 값의 차이는 AFM 작동 모드, 캔틸레버 팁, 샘플 준비 방법, 샘플 두께, 압입 깊이 및 힘, 측정 중 간 조직 환경 및 분석 방법의 차이로 인해 발생합니다 (표 2).
표 2 : 세포 수준에서의 간 경화도 값. AFM을 사용하여 얻은 간 경화 값은 세포 수준에서 간의 기계적 특성을 설명합니다. 약어 : AFM = 원자력 현미경; E = 탄성 (영) 계수; PFA = 파라포름알데히드; PBS = 인산염 완충 식염수. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
이 논문은 편광 현미경을 사용하여 제공되는 정확한 국소화를 통해 AFM에 의한 간 조직의 콜라겐이 풍부한 섬유성 영역의 Young's 계수의 재현 가능한 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 마우스 모델에서 중심엽 방식 (49)으로 콜라겐 침착을 유도하기 위해 사염화탄소 (CCl 4)를 투여하여 인간 간 섬유증50의 중요한 측면을 안정적으로 모방했습니다. 편광된 현미경 이미지는 콜라겐 섬유(51)의 복굴절로 인해 간에서 콜라겐의 시각화를 가능하게 하며, 이는 간소엽(52) 내의 원하는 관심 영역 위에 캔틸레버 팁의 정확한 위치를 가능하게 한다.
Protocol
모든 동물 실험은 분자 유전학 연구소의 동물 관리 위원회에서 승인한 동물 프로토콜과 동물 실험에 대한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 제시된 프로토콜의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1 : 마우스 간에서 영률의 AFM 평가의 전체 개략도. (A) 대조군 또는 처리된 마우스로부터 간을 분리한 후 절편화 및 -80°C에서 보관합니다(최대 보관, 2주). (B) 구형 비드를 캔틸레버에 부착하여 밤새 접착제를 경화시킵니다 (왼쪽). 캔틸레버 교정 후 시료 장착(오른쪽). (C) 밝은 콜라겐 구조를 시각화하기 위해 편광판과 분석기를 정렬 한 다음 AFM 캔틸레버 아래의 측정 필드와 카메라의 이미지를 오버레이합니다. (D) 강성 맵 획득 및 분석. 약어 : AFM = 원자력 현미경; PBS = 인산염-완충 식염수; OCT = 최적 절단 온도 화합물; CCl4 = 사염화탄소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 샘플 준비 I
- 마취하에 자궁 경부 탈구로 안락사 된 마우스의 열린 복부에서 간을 절제하십시오. 왼쪽 측엽을 분리하고 드라이 아이스에서 급속 동결하여 엽의 측면 절반을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입합니다. OCT 포매 조직을 -80 ° C에서 보관하십시오.
참고: 이전 연구에 따르면 강성 값은 냉동 조직과 신선한 조직 간에 유사합니다(25,26). - 30 μm 두께의 간 섹션을 저온 물질을 사용하여 양전하를 띤 슬라이드에 놓고 AFM 측정 날까지 -80 ° C에서 슬라이드를 보관합니다.
2. 기기 설정
- AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착(보충 그림 S1, 단계 1-5)
참고: 캔틸레버에 비드를 부착하는 것도 이전에 Norman et al.46에 의해 설명되었습니다.- 직경 5.7 μm의 멜라민 수지 비드의 현탁액을 유리 슬라이드의 절반 면적에 고르게 펴고 자연 건조하여 용매를 증발시킨다(보충 그림 S1, 단계 1).
- 슬라이드의 다른 절반에서 10μL 팁을 사용하여 작업 시간이 긴 미리 혼합된 에폭시 수지의 얇은 선을 만듭니다(보충 그림 S1, 단계 1).
- 제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 프로브를 AFM 헤드에 로드합니다.
- 캔틸레버 프로브가 장착된 AFM 헤드로 슬라이드와 덮개를 장착합니다.
참고 : SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버가 연구에 사용되었습니다. - 미리 혼합된 에폭시 수지 접착제를 슬라이드 중앙으로 가져오고 낮은 힘으로 캔틸레버로 접착제에 접근합니다(이 프로토콜을 따르려면 설정값을 1V로 설정; 보충 그림 S1, 단계 2).
알림: 슬라이드 표면에 접근하기 전에 레이저가 캔틸레버 팁의 중앙에 정렬되어 있는지 확인하십시오.tage 섹션 6, 파트 8, AFM 캔틸레버의 스프링 상수 보정의 2-3단계에 따라 높은 합계 볼륨으로 표시됩니다. - 캔틸레버 프로브의 끝이 접착제와 접촉 한 후 슬라이드 바로 위로 이동하여 과도한 접착제를 제거하십시오.
- 이제 슬라이드에서 캔틸레버 팁을 집어넣고 슬라이드를 이동하여 중앙에 단일 비드를 가져옵니다(보충 그림 S1, 3단계). 더 높은 힘(설정점 2V)으로 AFM 캔틸레버 프로브로 비드에 다시 접근하여 캔틸레버 프로브의 중앙에 비드를 부착하고 최소 10초 동안 그대로 둡니다(보충 그림 S1, 4단계).
- 캔틸레버 프로브를 추출하고 실온에서 밤새 보관하여 접착제를 경화시키거나 에폭시 수지에 대한 지침을 따릅니다(보충 그림 S1, 단계 5).
- 편광판 및 분석기 설정
- 간 절개 내에서 관심 영역을 찾으려면 편광판과 분석기로 현미경을 설정하십시오. 진동 방위각을 0°에서 90° 사이의 각도로 정렬하여 둘 중 하나를 다른 하나에 대해 수동으로 또는 자동화된 방식으로 회전시켜 투과광을 최소화하고 대물렌즈를 통과하는 특수 광선을 최대화합니다. 콜라겐 섬유가 편광 이미지(그림 2)의 어두운 배경에 대해 밝게 나타나는지 확인하고, 이는 이미지 히스토그램의 피크가 밝은 픽셀로 이동하여 반영됩니다.
그림 2: 대표적인 현미경 이미지는 명시야 이미지와 비교하여 편광 현미경에서 콜라겐 섬유의 뚜렷한 시각화를 보여줍니다. 3주 동안 CCl4로 처리된 마우스의 간 절편을 (A) 명시야 및 (B) 편광 현미경 검사를 실시하였다. 복굴절 콜라겐 섬유는 명시야 이미지와 비교하여 편광 이미지에서 흰색으로 명확하게 보입니다. 빨간색 상자는 AFM 측정에 사용되는 콜라겐이 풍부한 영역을 나타냅니다. 삽입은 빨간색 상자에 영역의 확대된 보기를 표시합니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소; CV = 중심 정맥; PV = 문맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
알림: 이 프로토콜의 경우 AFM 헤드는 편광판과 분석기를 삽입할 수 있는 적절한 도립 현미경에 설치할 수 있습니다. 배경 소음을 줄이기 위해 시스템을 격리 장치에 배치해야 합니다.
- AFM 캔틸레버의 스프링 상수 교정
- 제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 프로브(섹션 1, 파트 2, 파트 8, AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착의 1-1단계에 따라 준비됨)를 AFM 헤드에 로드합니다.
- 측정 중 캔틸레버의 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 캔틸레버를 청소하십시오. 팁에서 잔류 에탄올을 제거하기 위해 증류수로 광범위하게 씻으십시오.
- 접촉 모드를 활성화하고 측정 방법으로 힘 매핑을 선택합니다.
- 해당 버튼을 클릭하여 소프트웨어 탭에서 모든 관련 창(Z 스테퍼 모터, 전동 스테이지 제어, 데이터 뷰어, 포스 스캔 맵 오실로스코프, 레이저 정렬 및 카메라 창)을 엽니다.
- 소수성 마커 펜으로 표시된 약 2cm x 4cm의 영역에 1.2mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 깨끗한 유리 슬라이드를 장착합니다. AFM 헤드를 현미경 스테이지에 장착하고 캔틸레버가 PBS에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.
- 대물렌즈를 캔틸레버 팁에 집중합니다. 현미경에서 투과되는 빛의 강도를 줄여 모니터에서 레이저 위치를 더 잘 볼 수 있습니다.
- 레이저를 캔틸레버의 반투명 끝 (구형 비드가 부착 된 부분)으로 향하게하고 AFM 헤드의 손잡이를 사용하여 미러를 정렬하여 검출기에서 레이저 빔의 총 강도를 최대화합니다 ( 레이저 정렬 창의 합계로 표시됨).
- AFM 헤드에 있는 손잡이를 사용하여 포토다이오드 검출기를 정렬하여 레이저를 중앙에 배치합니다.
- 보정을 진행하기 전에 캔틸레버를 15분 동안 안정화시키십시오.
- 교정 관리자를 열고 캔틸레버 유형, 캔틸레버 치수 및 환경 조건을 삽입합니다. Calibrate(보정)를 클릭하여 스프링 상수와 감도(역 광학 레버 감도, InvOLS라고도 함)를 보정합니다. 제조업체의 선언에 따라 교정 후 얻은 스프링 상수의 정확성을 확인하십시오. 비접촉 모드에서 캔틸레버를 보정합니다(보정은 Sader et al.58에서 파생된 열 정리를 사용하여 소프트웨어에서 수행됨).
알림: 캔틸레버의 스프링 상수는 캔틸레버의 강성을 나타내며 N/m 측면에서 변형 길이에 따라 변형될 때 캔틸레버의 저항력에 의해 주어집니다. 캔틸레버의 감도는 캔틸레버의 편향(나노미터)에 대한 응답으로 광 다이오드 응답 값(볼트 단위)을 나타내며 일반적으로 nm/V59로 표시됩니다. 비접촉 모드에서, 열 잡음 스펙트럼은 기록되고 교정 후에 AFM 제어 소프트웨어에 의해 유체역학 기능(60 )이 자동으로 장착된다. 피팅은 교정 매개 변수, 즉 스프링 상수 및 InvOLS를 제공합니다. 이 연구에 사용 된 SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버의 스프링 상수는 제조업체가 선언 한대로 0.09 N / m였습니다.
3. 샘플 준비 II
- 동결된 절편을 실온에서 2분 동안 해동(섹션 1, 샘플 준비 I에 설명된 대로 -80°C에서 보관)합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 1x PBS의 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 섹션을 고정한 다음 1x PBS로 광범위한 세척 (5x)합니다. 조직 주위의 잔류 PBS를 닦고 간 부분 주위에 약 2cm x 4cm의 경계를 소수성 마커 펜으로 표시합니다. 샘플을 1x PBS로 덮습니다(경계 영역에 ~1.2mL의 1x PBS가 포함되어 있는지 확인). AFM 측정에 샘플을 사용하십시오.
알림: PFA는 유해 화학 물질이므로 피부 나 눈에 닿지 않도록주의해서 취급해야합니다. 독성 흄을 방지하려면 PFA와 관련된 모든 절차를 인증 된 화학 흄 후드 또는 기타 승인 된 환기 구역에서 수행해야합니다.
4. 측정
- 설정 탭으로 이동하여 자동 저장을 선택하여 자동 저장을 활성화합니다. 측정 파일을 저장할 파일 이름과 디렉토리를 설정하려면 설정 탭으로 이동한 다음 설정 저장을 클릭합니다.
- 샘플을 로드합니다(섹션 3, 샘플 준비 II에 따라 준비됨). 레이저 를 켜고 접근 키를 클릭하여 AFM 캔틸레버로 조직 표면에 접근 합니다. 팁이 조직 표면과 접촉한 후 팁이 대물렌즈의 초점에 유지되도록 캔틸레버 팁을 후퇴시킵니다(캔틸레버를 피에조 범위의 상단 끝으로 후퇴시키는 Retract 키를 클릭하여). 레이저 위치가 레이저 정렬 창의 중심에서 멀어지면 감지기를 다시 정렬하십시오.
- 레이저를 끄고 액세서리 탭을 클릭한 다음 직접 오버레이 광학 교정을 선택하여 현미경의 광학 필드를 AFM 측정 맵으로 오버레이합니다. 다음 창에서 다음을 클릭하여 특정 영역을 스캔하는 캔틸레버의 일련의 이미지를 찍습니다. 다음을 다시 클릭하여 다음 창으로 이동합니다.
- 첫 번째 이미지에서 캔틸레버 끝의 중심을 수동으로 클릭하여 소프트웨어에서 팁 위치를 나타냅니다. 팁 위치를 나타내는 원은 정확도를 높이기 위해 반경 을 표시하여 크기를 조작할 수 있습니다. 보정을 클릭하여 모든 이미지에서 캔틸레버 팁 위치를 자동으로 감지합니다. 이미지를 통해 팁 감지의 정확성을 확인하십시오.
- Next(다음)를 클릭한 다음 Finish(마침)를 클릭하여 광학 오버레이를 완료하고 광학 보정 중에 캡처된 일련의 이미지를 저장합니다.
- 슬라이드의 더 높은 표면과의 충돌을 피하기 위해 캔틸레버를 더 집어넣으십시오. 스테이지를 이동하여 편광 이미지를 사용하여 데이터 뷰어 탭에 표시되는 녹색 상자 안에 콜라겐이 풍부한 영역을 배치합니다. 지정된 녹색 상자 안에 마우스 왼쪽 버튼을 길게 눌러 주위에 사각형을 만들어 콜라겐이 풍부한 영역을 선택합니다. 왼쪽의 그리드 탭에서 선택한 영역의 치수, 방향 및 해상도를 정의합니다. 새 스캔 영역 확인을 클릭하여 선택한 영역을 측정 영역으로 설정합니다.
- 피드백 루프의 IGain 및 PGain-파라미터를 기본값으로 유지하되, 주요 불안정성이 시스템 과민성의 형태로 제시되지 않는 경우. 이 프로토콜을 따르려면 IGain을 50Hz로, PGain을 0.001로 설정하십시오.
- 설정값을 1nN으로 설정합니다.
알림: 설정점은 정지 상태 동안 팁-표면 상호 작용의 힘입니다. 대부분의 소프트 샘플(세포, 젤 및 조직)의 경우 0.5-2.0nN 범위의 설정값 값이 적합합니다. - 연구 된 재료의 기계적 특성과 캔틸레버의 강성에 따라 상대 설정 값을 선택하십시오. 이 프로토콜의 경우 값을 5nN으로 설정합니다.
알림: 상대 설정점은 힘-거리 곡선의 정점에 도달하고 팁 이동이 기준선으로 돌아갈 때 상호 작용의 최대 힘을 나타냅니다. 연질 재료 (1-50 kPa)의 경우이 매개 변수는 나노 뉴턴 (nN) 단위로 설정됩니다. 또한 소프트 캔틸레버(스프링 상수가 0.05N/m에서 0.35N/m인 경우)의 경우 적용할 수 있는 최대 힘은 약 50nN입니다. 그에 따라 설정값과 상대 설정값을 조정합니다.- 주어진 설정값 값이 구형 압자의 반경보다 큰 압입 깊이로 이어지지 않는지 확인하고, 그렇지 않으면 압입 표면을 영률 계산에서 적절하게 정의할 수 없습니다. 들여쓰기의 첫 번째 실행 후 들여쓰기 깊이의 평균값을 계산합니다. 기록된 데이터를 처리하는 방법을 알아보려면 섹션 5, 데이터 분석을 참조하십시오. 필요한 경우 설정값 조정.
- 기준선 조정을 5로 설정합니다.
참고: 여기서 기준선은 접근 곡선 및 수축 곡선을 피팅하는 데 사용되는 다항식의 정도를 나타냅니다. 기준선을 5로 설정하면 곡선이 고해상도에 적합하므로 측정 중에 배경 노이즈를 캡처할 수 있습니다. - 샘플의 표면 지형에 따라 Z축에서 캔틸레버 이동 길이(Z-길이)를 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 Z 길이를 15μm로 설정하십시오.
참고: 높은 값(예: 15μm)은 측정 감도를 감소시키지만 일반적으로 섬유성 간 조직과 같이 표면이 매우 불규칙한 샘플에 필요합니다. - Z 이동을 일정한 지속 시간으로 설정합니다.
알림: Z 이동을 일정 속도로 설정하여 다른 모드에서 Z 이동(속도 연장 및 시간 연장)을 참조하는 데이터를 볼 수도 있습니다. - 연장 시간을 1초로 설정합니다. 연장 지연 및 철회 지연을 0으로 설정합니다.
참고: 매우 부드러운 재료61의 경우 >5.0μm/s의 확장 속도를 사용하십시오. 압입 속도가 낮을수록 부드러운 표면에서 더 점성이 높아지고 탄성이 떨어집니다. 확장 지연 및 수축 지연 은 캔틸레버 팁과 기질 간의 특정 상호 작용(예: 캔틸레버 표면에 고정된 단백질과 슬라이드 표면에 고정된 단백질의 상호 작용)을 연구하는 데 사용할 수 있는 매개변수입니다. - 샘플 속도를 5000Hz로 설정합니다.
참고: 샘플 속도는 완전한 접근-수축 곡선에 기록된 점의 빈도를 나타냅니다. 이 값을 높은 값(예: 5000Hz)으로 설정하여 매우 빠른 전환으로 인해 곡선의 특정 영역이 누락되지 않도록 합니다. - Z 폐쇄 루프를 Tick으로 표시하여 피드백 루프 시스템을 활성화하여 샘플 표면과 캔틸레버 팁 사이의 연속 거리를 보장합니다.
- Engage(참여)를 선택 해제하고 접근 클릭을 선택하여 전동 스테이지를 분리하여 캔틸레버로 샘플에 접근합니다. 스캔 시작을 클릭하여 6단계에서 설정한 영역에서 힘-거리 곡선 수집을 시작합니다. 섹션 4, 측정.
5. 데이터 분석
- 오픈 소스 소프트웨어 "AtomicJ"(https://sourceforge.net/projects/jrobust/ 에서 다운로드 가능)를 사용하여 수집 된 데이터를 분석하십시오.
참고: 애질런트 테크놀로지스, JPK 인스트루먼트 또는 브루커 원자력 현미경에서 수집한 파일을 지원합니다. - AtomicJ에서 프로세스 힘 곡선 및 맵 아이콘을 클릭하여 힘 곡선 을 프로그램에 로드합니다(보충 그림 S2A, x). 처리 도우미에서 추가 버튼을 클릭하여 분석할 맵을 추가합니다(보충 그림 S2A, y). 지도가 로드된 후 다음을 클릭합니다(보충 그림 S2A, z).
- 아래 설명된 단계에 따라 다음 창에서 처리 설정을 지정합니다( 보충 그림 S2B, 단계 1-11의 단계에 해당).
- 표본과 캔틸레버 사이의 접촉점을 수동으로 계산하거나 피팅 곡선 매개변수 세트를 사용하여 자동으로 추정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 접점의 자동 추정을 사용하십시오.
- 캔틸레버와 샘플 사이의 접촉점을 클래식 포커싱 그리드 방법으로 결정합니다.
- 데이터 분석 최적화 중에 경험적으로 결정해야 하는 측정된 힘 곡선의 품질을 기반으로 접촉점을 가장 잘 결정할 수 있는 추정 방법을 선택합니다. 이 프로토콜을 따르려면 모델 독립적 메서드를 사용합니다.
- 클래식 모델을 사용하여 힘 압입 곡선을 피팅합니다(이 프로토콜을 따르려면 모델 피팅에 클래식 L2 사용).
참고: 모형 적합치와 접촉 추정기는 각각 소프트웨어에 의해 곡선이 피팅되는 방법과 적합된 곡선에서 접촉점이 설정되는 방식을 제어하는 모수입니다. 이러한 측정에는 최소 제곱 회귀를 사용하는 클래식 옵션이 사용되었습니다. 이렇게 하면 곡선의 각 저하중 점을 시행 접촉점으로 처리하고 시행 접촉점 앞의 영역에 다항식을 피팅합니다. 그런 다음 수집된 힘 압입 데이터에 적절한 접촉 모델을 피팅합니다. 가장 낮은 제곱합을 제공하는 점이 접촉점으로 가정합니다. 얻어진 힘 곡선의 품질(62,63)에 기초하여 다른 방법들이 사용될 수 있다. - 모형의 피팅 을 철회 곡선으로 설정합니다.
- 푸아송 비율을 0.45로 설정하고 간24와 같은 연조직에 권장됩니다.
- 기준선 차수 3과 접촉 차수 1을 사용하여 곡선의 피팅을 설정합니다. 모델에서 곡선의 편차 척도를 기반으로 다항식 피팅 정도를 변경합니다.
- 인출 곡선을 피팅하는 데 사용되는 모델을 선택합니다. 방정식 (1)과 방정식 (2)를 기반으로 영률을 계산하는 Sneddon 모델을 사용하십시오.
(1)
δ =
(2)
여기서 F는 힘, E는 영률, v는 샘플의 포아송 비율, δ는 압입 깊이, a는 접촉 반경, R은 구 반경62,63입니다. - 구형 팁의 반경 을 마이크로미터 단위로 입력합니다(이 프로토콜에서는 2.9μm ).
- 읽기를 활성화하여 데이터 파일에서 Spring 상수 및 InvOLS를 로드합니다(확인란 선택).
- 마침을 클릭합니다.
참고: 분석된 데이터는 각 힘 곡선에 대해 계산된 수직 처짐, 높이, 접착력, 접촉력, 변형, 접착력,R2 값, 기울기, 영률, 전이 압입, 전이력 및 접촉 위치의 맵 형태로 제공됩니다(보충 그림 S3, 왼쪽 상단). 두 개의 추가 창에는 힘 곡선과 원시 값이 표시됩니다(보충 그림 S3, 각각 오른쪽 상단 및 하단 패널).
- 캔틸레버가 간 섹션의 표면에 잘못 접근한 힘 곡선을 제외합니다. 이를 식별하기 위해, 도 3 에 시연되고 다른 곳(46)에서 상세히 논의된 바와 같이, 높은 잡음, 비정상적인 형상, 및/또는 불완전한 접근법을 갖는 곡선을 찾는다.
(1)
(2)
그림 3: 대표적인 힘-변위 곡선의 예. (A,B) 더 단단한에 대한 대표적인 해석 가능한 힘 곡선 (A; E = 10.5 kPa) 및 더 부드러운 (B; E = 1.78 kPa) 분석에 적합한 영역. (C-F) (C-E) 잘못된 접근 방식 또는 (F) 더 높은 잡음으로 인해 분석에서 제외해야 하는 해석할 수 없는 대표적인 그래프. (A)에 제공된 범례에 표시된 것처럼 빨간색 곡선은 캔틸레버의 접근 방식을 나타내고 녹색 곡선은 캔틸레버의 수축을 나타냅니다. 검은 선은 캔틸레버의 철수 곡선의 피팅을 보여줍니다. 검은 선의 기울기는 영률에 해당합니다. 빨간색과 파란색 점은 각각 접점과 전환점에 해당합니다. 접촉점은 수축 중 캔틸레버와 기판 사이의 마지막 접촉점이며, 전이 점은 캔틸레버가 접근에서 후퇴로의 전환을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
대조군 마우스 및 경증 또는 진행성 섬유증(각각 3주 또는 6주 동안 CCl4 의 주사에 의해 유도됨,49)으로부터 수득된 경미하게 고정된 30μm 두께의 간 절편을 본 프로토콜에 기재된 바와 같이 AFM으로 프로핑하였다. 중심 정맥에 가까운 콜라겐 섬유는 강성 맵의 측정을 위해 선택되었습니다. CCl4 처리 동물의 콜라겐 섬유가 일반적으로 형성되는 영역에 해당하는 중앙 정맥에 가까운 영역을 대조군 간에서 분석했습니다 (그림 4A). 영률의 분포는 단일 간 섹션 내에서 다양한 대조군 간과 콜라겐이 풍부한 영역에서 재현 가능했습니다(그림 4B: 왼쪽 바이올린 플롯).
CCl 4 처리 동물에서, 콜라겐 침착물의 주변 영역에 해당하는 강성 맵은 대조군 마우스의 동등한 영역에 비해 영률의 유의하게 더 높은 값을 나타냈다 (그림 4B : 1.9 kPa 대 2.6 kPa 대조군에 대한 중앙값 대 3 주 CCl 4 처리 마우스; p = 0.07; 1.9 kPa 대 5.1 kPa 중앙값 대조군에 대한 영 계수 값 대 6 주 CCl4 -처리 된 마우스; p = 0.02). 더욱이, 더 긴 CCl4 처리에서 영률의 값이 유의하게 증가하였다(도 4B; 2.6 kPa 대 5.1 kPa 중앙값 3주 대 6주 CCl4 처리된 마우스; p = 0.04). 이것은 섬유증 진행과 함께 콜라겐 침착 물의 점진적인 경화를 보여주고 AFM 측정은 섬유 형성을 반영합니다.
OCT 포매 간 절편의 장기간 보관이 콜라겐 섬유의 기계적 특성에 미치는 영향을 평가하기 위해 CCl4 처리 마우스 절편에서 콜라겐 섬유의 강성을 측정했으며, 절단 후 슬라이드에서 -80 ° C에서 2 주 또는 3 개월 동안 보관했습니다 (그림 5). AFM 측정은 샘플 절편 후 2주 이내에 측정된 절편에서 얻은 절편에 비해 3개월 동안 보관된 절편에 대해 콜라겐이 풍부한 영역에서 영률의 값이 유의하게 낮은 것으로 나타났습니다(그림 5; 4.7kPa 대 3.6kPa 중앙값 영률 값 2주 대 3개월 보관; p < 0.001). 따라서 OCT 포매 간엽으로부터 절편을 준비한 직후 간 조직의 기계적 특성을 측정하는 것이 중요합니다.
그림 4: AFM 측정은 장기간의 CCl4 치료와 상관관계가 있는 콜라겐이 풍부한 영역의 점진적인 경화를 보여줍니다. (a) 대조군 마우스와CCl4로 처리된 마우스로부터의 간 절편을 3주 또는 6주 동안 콜라겐이 풍부한 영역의 기계적 특성을 측정하기 위해 사용하였다. 편광 현미경 이미지(왼쪽)에 표시된 간 섹션의 박스형 영역은 AFM 측정을 위해 선택된 콜라겐이 풍부한 스캔 영역(또는 대조군 간의 해당 영역)입니다(30μm x 100μm, 10픽셀 x 36픽셀). 이러한 박스형 영역에 해당하는 컬러 스케일을 가진 영률 맵이 오른쪽에 표시되며, 이 맵의 영률 값의 히스토그램이 포함됩니다. 삽입 산점도는 각 조건에 대해 >10kPa의 값을 표시합니다. 간의 경화는 히스토그램 분포의 점진적인 오른쪽 이동과 삽입 산점도에서 점의 빈도가 높은 것으로 시각화됩니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 바이올린 플롯은 각 조건에 대해 측정된 세 영역(왼쪽)의 탄성 계수 분포와 세 맵 모두(오른쪽)의 요약된 탄성 계수 값을 보여줍니다. 바이올린 플롯은 중앙값 (빨간색 선), 25 번째 백분위 수 및 75번째 백분위 수 (검은 선)를 보여줍니다. 점은 영역 1-3의 개별 맵의 평균값을 나타냅니다. 제시된 p-값은 평균에 대해 수행된 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었습니다. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 간 절편을 장기간 보관하면 콜라겐이 풍부한 부위의 경직이 감소합니다. 2주 또는 3개월 동안 -80°C에서 보관된 간 절편(2주 동안 CCl4로 처리된 마우스로부터 제조됨)을 영률을 측정하기 위해 사용하였다. AFM 측정에 사용된 콜라겐이 풍부한 영역을 나타내는 상자가 있는 편광 현미경 이미지(왼쪽). 컬러 스케일이 있는 해당 영률 맵(오른쪽). 히스토그램은 각 샘플의 4-6 영역에서 수집 된 영률 값을 보여줍니다. 삽입 산점도 그래프는 각 조건에 대해 >10kPa의 값을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; CCl4 = 사염화탄소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 멜라민 수지 마이크로 비드로 캔틸레버를 개질하는 방법. (A) 그려진 개략도는 캔틸레버의 팁에 구형 비드의 부착을 보여줍니다. 단계별 설명은 섹션 2, 파트 1, AFM 캔틸레버 팁에 5.7μm 비드 부착을 참조하십시오. (B) 캔틸레버 팁에 부착된 구형 5.7μm 비드의 현미경 이미지는 상단(왼쪽) 및 측면도(오른쪽)에서 표시됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : AFM = 원자력 현미경; RT = 실온. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2 : AtomicJ의 데이터 분석. (A) AtomicJ에서 강성 맵을 열기 위해 따라야 할 일련의 단계. 프로세스 힘 곡선과 맵(x)을 한 번 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 처리 도우미가 열립니다. 추가(y)를 클릭하고 필요한 파일을 선택하여 처리 도우미에 파일을 로드할 수 있습니다. 다음(z)을 클릭하여 다음 단계로 진행합니다. (B) 측정 중에 사용되는 곡선 피팅, 적절한 접촉 역학 모델 및 AFM 설정에 대한 매개 변수. 1-11단계는 프로토콜 단계 3, 섹션 5, 데이터 분석에 자세히 설명된 해당 하위 지점을 참조합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: AtomicJ에서 분석된 데이터의 개요. 분석된 데이터의 미리 보기에는 강성 맵(왼쪽 위 창), 힘 곡선(오른쪽 위 창) 및 원시 데이터(아래 창)가 표시됩니다. 약어: AFM = 원자력 현미경. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
제시된 프로토콜은 정상 및 섬유성 마우스 간 조직의 AFM 측정을 위한 단계별 재현 가능한 방법을 제공한다. 결합 편광 현미경은 높은 공간 정밀도를 제공하고 복굴절로 인해 콜라겐 섬유의 시각화를 가능하게 합니다. 또한, 얻어진 힘 곡선의 분석에 대한 상세한 설명이 제공된다. AFM 강성 측정은 세포 수준에서 수행 할 수 있으므로 섬유 성 질환 발생으로 인한 간 조직의 기계적 특성의 국소 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 간 섬유증은 전체 장기에 영향을 미치는 균질 한 과정이 아닙니다. 반대로, 콜라겐이 풍부한 섬유성 격막 영역에는 콜라겐 침착물이 적거나 없는 영역이 산재되어 있습니다. 따라서 강성 변화는 국소 미세 환경에 따라 다르며 손상으로 손상된 영역과 국소적으로 접촉하는 세포에만 영향을 미칩니다. 이러한 미세한 강성 이질성은 AFM Young의 계수 맵의 세부 사항에서도 분명하며, 여기서 고강성 지점은 거의 정상적인 강성 영역과 접해 있습니다. 이 변화는 콜라겐 흉터 조직 영역조차도 기계적으로 균질하지 않으며 세포 수준에서 특성화하기 위해 AFM 측정이 필요하다는 것을 보여줍니다 (그림 4).
제시된 프로토콜은 OCT에 내장 된 전체 간 엽이 -80 ° C에서 장기간 저장 될 수 있기 때문에 간 수집과 독립적으로 AFM에 의한 간 경화 측정을 허용합니다. 그러나 조직이 절편화되면 더 오랜 기간 동안 보관된 조직 절편의 점진적인 연화를 관찰했으므로 ~5주 이내에 샘플을 측정하는 것이 좋습니다(그림 5).
편광 현미경이 장착 된 AFM을 사용하면 간 소엽 구조 내에서 관심 영역을 정확하게 찾을 수 있습니다. 그러나 결과를 해석할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 여기서 얻어진 강성 값은 실온에서 측정하였다. 우리는 연조직의 기계적 특성에 대한 온도의 영향이 작을 것이라고 가정합니다. 그러나 이것은 간 조직의 기계적 특성의 보고된 생체 내 값과 본 연구의 값 사이의 차이에 대한 이유 중 하나일 수 있습니다.
또한이 프로토콜을 사용하면 최대 3 시간 동안 간 조직의 AFM 분석을 수행 할 수 있으므로 조직의 가벼운 고정이 필요합니다. 조직 절편의 가벼운 고정과 동결-해동 주기는 영률의 절대값에 영향을 미칠 가능성이 큽니다. 따라서, 보고된 영률 값은 생체내 값과 다를 수 있다. 간 절편으로부터 영률의 절대 값을 측정하기위한 프로토콜을 최적화하기 위해서는 추가의 연구가 필요하며, 이는 간 조직(64)의 고정을위한 다른 방법에 의해 달성 될 수있다.
그럼에도 불구하고, 우리는 CCl4로 치료 한 마우스의 간에서 콜라겐이 풍부한 부위의 경직성이 6 주에 비해 3 주 동안 증가하는 것을 관찰했다. 이러한 변화는 장기간의 손상 동안 섬유증 진행에 해당하며(그림 4), 제시된 프로토콜을 사용하여 서로 다른 치료 간에 상대적 차이를 조사할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 Calò et al.의 관찰과 일치하며, 그는 약간 고정 된 간 섹션이 신선한 조직25에서와 같이 콜라겐이 풍부한 영역과 콜라겐이 부족한 영역 사이의 강성 값에서 유사한 차이를 보인다는 것을 보여주었습니다.
측정 중 간 조직의 기계적 파괴를 최소화하기 위해 직경 0.09μm 구형 팁으로 수정 된 SD-qp-BioT-TL-10 캔틸레버 (이론적 스프링 상수 ~ 0.7 N / m)를 사용했습니다. 5.7μm 비드는 무결성을 유지하면서 강성을 조사하기 위해 샘플의 충분한 압흔을 가능하게 했습니다. 강성 맵에서 더 높은 해상도를 얻기 위해 여러 최적화 후에 더 작은 직경의 비드를 사용할 수 있지만 영률 값을 더 과대 평가할 수 있습니다 (자세한 내용은 Crichton et al.65 참조). 지정된 캔틸레버-비드 앙상블을 사용하여 수십 Pa 단위에서 ~100kPa까지 광범위한 범위의 시료 강성을 특성화할 수 있었습니다.
Sneddon의 모델은 콜로이드 프로브62로 깊은 압흔을 분석 할 수 있기 때문에 힘 곡선에서 영률을 유도하는 데 사용되었습니다. Sneddon의 모델은 Hertz의 모델과 달리 접촉 반경이 구 반경보다 훨씬 작아야 한다는 제약 조건을 겪지 않습니다. 또한 샘플 두께가 압입 깊이30,66보다 몇 배 더 크다고 가정합니다. 본 연구에서 압흔은 콜라겐이 풍부한 영역에서 비드 크기가 5.7μm이고 샘플 두께가 30μm인 ~2μm였습니다. 따라서 Sneddon의 모델이 적절했습니다. 팁과 기재 사이의 접착력을 고려한 다른 모델(63)은 상이한 유형의 조직에 사용될 수 있다.
AtomicJ의 분석은 샘플의 유한 두께에 대한 보정을 구현하여 영률62,67을 도출하면서 기판의 기여를 최소화합니다. 얻어진 힘 곡선의 분석에서, 우리는 연조직 기관24에 대해 이전에 권장되었던 0.45의 단일 푸 아송 비를 사용했다. 푸아송 비율 값이 0.4에서 0.5로 변경되면 Sneddon 방정식에 따라 계산된 영률 값이 0.893배 감소하기 때문에 이 근사는 영률의 계산된 값에 큰 영향을 미치지 않습니다. CCl4 치료의 서로 다른 기간 간의 영률의 여러 배 차이를 감안할 때 푸아송 비를 근사화하여 발생하는 오류는 미미합니다.
우리는 압입68에 대한 소성 반응보다는 캔틸레버가 제공하는 하중에 대한 조직의 탄성 반응에 관심이 있었기 때문에 강성 값을 계산하기 위해 철수 곡선을 사용했습니다. 연조직의 점탄성 반응으로 인해 피팅 철회 곡선은 영률 과대 평가 될 수 있으므로 명심해야합니다. 또한, 접근 곡선을 사용한 데이터 분석은 섬유성 영역과 대조군 영역 간의 강성 값에서 유사한 추세를 산출하지만 절대값은 그에 따라 더 낮습니다(데이터는 표시되지 않음).
프로토콜을 최적화하는 동안 측정의 재현성에 중요한 몇 가지 단계를 확인했습니다. 첫째, 비드가 캔틸레버에 부착되는 동안 반투명 팁의 대략 중앙에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 압입 중에 발생할 수있는 기계적 불균형을 방지합니다. 둘째, PFA로 간 고정하는 동안 해동 및 고정에 대한 시간 제한을 엄격히 준수해야합니다. 이 단계의 타이밍을 변경하면 조직 절편의 기계적 특성에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다. 셋째, 캔틸레버는 온도 변동으로 인한 강성 값에서 발생하는 아티팩트를 방지하기 위해 지속적인 모니터링 및 동시 온도 값 입력으로 반복적으로 보정되어야 합니다. 마지막으로, 겹쳐진 PBS가 더 오랜 기간 동안 증발 할 수 있으므로 단일 간 절편을 준비 후 3 시간 이상 측정해서는 안됩니다. 독자는 AFM 측정 중에 발생하는 문제를 해결하기 위해 문제 해결 표(표 3)를 참조할 수 있으며, Norman et al.46에서도 자세히 논의됩니다.
표 3: 문제 해결 가이드. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
제시된 프로토콜은 간 조직의 재현 가능한 AFM 프로빙을 허용합니다. 미시적 수준에서 섬유성 간 질환의 발달 및 최종 퇴행에 대한 정보를 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 만성 간 질환의 진행 중에 형성된 섬유성 흉터 영역을 표적으로 하는 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 체코 공화국 보조금 기관 (18-02699S), 체코 과학 아카데미 기관 연구 프로젝트 (RVO 68378050) 및 MEYS CR 프로젝트 NICR EXCELES (LX22NPO05102)의 지원을 받았습니다. CIISB, Instruct-CZ Center of Instruct-ERIC EU 컨소시엄, MEYS CR 인프라 프로젝트 LM2018127 및 유럽 지역 개발 기금 프로젝트 "UP CIISB"(No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974)은 CF 나노생명공학인 CEITEC MU에서 측정을 재정적으로 지원했습니다. 또한 MEYS(LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) 및 RVO: 68378050-KAV-NPUI가 지원하는 체코 프라하의 광학 현미경 핵심 시설(IMG CAS)이 여기에 제시된 현미경 이미징을 지원해 준 것을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
| Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
| The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
| Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
| Cryotome | Leica | CM1950 | |
| Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
| Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
| Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
| AtomicJ v2.3.1 | |||
| Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
| System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
| Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |
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