Summary

FACS-isolering och odling av fibro-adipogena förfäder och muskelstamceller från ostörd och skadad musskelettmuskel

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

Den exakta identifieringen av fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och muskelstamceller (MuSC) är avgörande för att studera deras biologiska funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd. Detta protokoll ger riktlinjer för isolering, rening och odling av FAPs och MuSC från vuxna musmuskler.

Abstract

Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av skelettmuskelboende mesenkymala stromaceller (MSC) som kan differentieras längs fibrogen, adilogen, osteogen eller kondrogen härstamning. Tillsammans med muskelstamceller (MuSC) spelar FAPs en kritisk roll i muskelhomeostas, reparation och regenerering, samtidigt som de aktivt upprätthåller och omformar den extracellulära matrisen (ECM). Vid patologiska tillstånd, såsom kronisk skada och muskeldystrofier, genomgår FAPs avvikande aktivering och differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till fibros och intramuskulär fettinfiltration. Således spelar FAPs en dubbel roll i muskelregenerering, antingen genom att upprätthålla MuSC-omsättningen och främja vävnadsreparation eller bidra till fibrotisk ärrbildning och ektopiska fettinfiltrat, vilket äventyrar skelettmuskelvävnadens integritet och funktion. En korrekt rening av FAP och MuSC är en förutsättning för att förstå dessa cellers biologiska roll i fysiologiska såväl som i patologiska tillstånd. Här beskriver vi en standardiserad metod för samtidig isolering av FAPs och MuSC från lemmuskler hos vuxna möss med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Protokollet beskriver i detalj den mekaniska och enzymatiska dissociationen av mononukleerade celler från hela extremitetsmuskler och skadade tibialis främre (TA) muskler. FAPs och MuSC isoleras därefter med hjälp av en halvautomatisk cellsorterare för att erhålla rena cellpopulationer. Vi beskriver dessutom en optimerad metod för odling av vilande och aktiverade FAPs och MuSCs, antingen ensamma eller i samodlingsförhållanden.

Introduction

Skelettmuskeln är den största vävnaden i kroppen, som står för ~ 40% av vuxen mänsklig vikt och ansvarar för att upprätthålla hållning, generera rörelse, reglera basal energimetabolism och kroppstemperatur1. Skelettmuskeln är en mycket dynamisk vävnad och har en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig till en mängd olika stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliska förändringar och dagliga miljöfaktorer. Dessutom regenererar skelettmuskeln som svar på akut skada, vilket leder till fullständig återställning av dess morfologi och funktioner2. Skelettmuskelns plasticitet är huvudsakligen beroende av en population av bosatta muskelstamceller (MuSC), även kallade satellitceller, som ligger mellan myofiberplasmamembranet och basal lamina 2,3. Under normala förhållanden bor MuSC i muskelnischen i vilande tillstånd, med bara några få divisioner för att kompensera för cellulär omsättning och för att fylla på stamcellspoolen4. Som svar på skada går MuSC: er in i cellcykeln, sprider sig och bidrar antingen till bildandet av nya muskelfibrer eller återgår till nischen i en självförnyelseprocess 2,3. Förutom MuSC är homeostatiskt underhåll och regenerering av skelettmuskeln beroende av stöd från en population av muskelboende celler som heter fibro-adipogena förfäder (FAPs)5,6,7. FAPs är mesenkymala stromaceller inbäddade i muskelbindvävnaden och kan differentieras längs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen härstamning 5,8,9,10. FAPs ger strukturellt stöd för MuSC eftersom de är en källa till extracellulära matrisproteiner i muskelstamcellsnischen. FAPs främjar också långsiktigt underhåll av skelettmuskeln genom att utsöndra cytokiner och tillväxtfaktorer som ger trofiskt stöd för myogenes och muskeltillväxt 6,11. Vid akut muskelskada sprider sig FAPs snabbt för att producera en övergående nisch som stöder den regenererande muskelns strukturella integritet och ger en gynnsam miljö för att upprätthålla MuSCs spridning och differentiering på ett parakrint sätt5. När regenereringen fortskrider rensas FAPs från den regenerativa muskeln genom apoptos, och deras antal återgår gradvis till basalnivå12. Men under förhållanden som gynnar kronisk muskelskada åsidosätter FAPs pro-apoptotisk signalering och ackumuleras i muskelnischen, där de differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till ektopiska fettinfiltrat och fibrotisk ärrbildning12,13.

På grund av deras multipotens och deras regenerativa förmågor har FAPs och MuSCs identifierats som potentiella mål inom regenerativ medicin för behandling av skelettmuskelsjukdomar. För att undersöka deras funktion och terapeutiska potential är det därför viktigt att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för isolering och odling av FAPs och MuSC.

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan identifiera olika cellpopulationer baserat på morfologiska egenskaper såsom storlek och granularitet och tillåter cellspecifik isolering baserat på användning av antikroppar riktade mot cellytmarkörer. Hos vuxna möss uttrycker MuSC den vaskulära celladhesionsmolekylen 1 (VCAM-1, även känd som CD106) 14,15 och α7-Integrin 15, medan FAP uttrycker den trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptorn α (PDGFRα) och stamcellsantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollet som beskrivs här identifierades MuSC:er som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, medan FAPs identifierades som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt användes PDGFRαEGFP-möss för att isolera FAP som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- händelser18,19. Vidare jämförde vi överlappningen mellan den fluorescerande signalen från PDGFRα-GFP+-celler med celler som identifierats av ytmarkören Sca1. Vår analys visade att alla GFP-uttryckande celler också var positiva för Sca1, vilket indikerar att båda metoderna kan användas för identifiering och isolering av FAPs. Slutligen bekräftade färgning med specifika markörantikroppar renheten hos varje cellpopulation.

Protocol

Alla djurförsök som utfördes utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer som godkänts av djurvårds- och användningskommittén (ACUC) vid National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Utredare som utför detta protokoll måste följa sina lokala djuretiska riktlinjer. OBS: Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar FAPs och MuSC från bakbenet och skadade tibialis främre (TA) muskler hos vuxna manliga och kvinnliga möss (3-6 månader) och …

Representative Results

Detta protokoll tillåter isolering av cirka en miljon FAPs och upp till 350 000 MuSC från oskadade bakben hos vuxna möss av vild typ (3-6 månader), vilket motsvarar ett utbyte på 8% för FAPs och 3% för MuSCs av totala händelser. Vid sortering av celler från skadad TA 7 dagar efter skada samlas två till tre TA-muskler för att få upp till 300 000 FAP och 120 000 MuSC, vilket motsvarar ett utbyte på 11% respektive 4%. Renhetsvärden efter sortering är vanligtvis över 95% för FAP och MuSC. <p class="jove_…

Discussion

Att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för identifiering och isolering av rena vuxna stamcellspopulationer är det första och mest kritiska steget mot att förstå deras funktion. Isolerade FAP och MuSC kan användas för att genomföra multiomikanalys i transplantationsexperiment som en potentiell behandling för muskelsjukdomar eller kan modifieras genetiskt för sjukdomsmodellering i stamcellsterapi.

Protokollet som beskrivs här ger standardiserade riktlinjer för identifi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) för råd om MuSC-isolering. Detta arbete finansierades av NIAMS-IRP genom NIH-bidrag AR041126 och AR041164.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

References

  1. Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
  2. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  3. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  4. Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  6. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  7. Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
  8. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  9. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  10. Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
  11. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
  12. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  13. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
  14. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  15. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
  16. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
  17. Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
  18. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  19. Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
  20. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
  21. Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
  22. García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  23. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  24. Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  25. Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).

Play Video

Cite This Article
Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

View Video