Whole-Kidney Driedimensionale Kleuring met CUBIC
Summary
Het huidige protocol beschrijft een weefselzuiveringsmethode en immunofluorescente kleuring met volledige mount voor driedimensionale (3D) nierbeeldvorming. Deze techniek kan macroscopische perspectieven bieden in de nierpathologie, wat leidt tot nieuwe biologische ontdekkingen.
Abstract
Hoewel conventionele pathologie veel informatie over de niermicrostructuur opleverde, was het moeilijk om de precieze structuur van bloedvaten, proximale tubuli, verzamelkanalen, glomeruli en sympathische zenuwen in de nier te kennen vanwege het gebrek aan driedimensionale (3D) informatie. Optische clearing is een goede strategie om deze grote hindernis te overwinnen. Meerdere cellen in een heel orgaan kunnen worden geanalyseerd met eencellige resolutie door weefselzuivering en 3D-beeldvormingstechniek te combineren. Celetiketteringsmethoden voor beeldvorming van hele organen blijven echter onderontwikkeld. In het bijzonder is het kleuren van organen in de hele montage een uitdaging vanwege de moeilijkheid bij de penetratie van antilichamen. Het huidige protocol ontwikkelde een nierkleuring van de hele muis voor 3D-beeldvorming met de CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails and Computational analysis) weefselzuiveringsmethode. Het protocol heeft het mogelijk gemaakt om renale sympathische denervatie na ischemie-reperfusieletsel en glomerulomegalie in het vroege stadium van diabetische nierziekte vanuit een uitgebreid oogpunt te visualiseren. Deze techniek kan dus leiden tot nieuwe ontdekkingen in nieronderzoek door een macroscopisch perspectief te bieden.
Introduction
De nier bestaat uit verschillende celpopulaties. Hoewel conventionele pathologie ons veel informatie geeft over de micro-omgeving van de nieren, is driedimensionale (3D) beeldvorming nodig om de intercellulaire overspraak tijdens de progressie van de nierziekte nauwkeurig te begrijpen. In het verleden moest een groot aantal seriële secties en beeldreconstructies worden uitgevoerd voor de 3D-beeldvorming van het hele orgaan1. Deze methode vergde echter te veel inspanning en had problemen op het gebied van reproduceerbaarheid.
Optische clearing is een goede strategie om deze horde te nemen 2,3. Weefselopaciteit is voornamelijk te wijten aan lichtverstrooiing en absorptie omdat elk orgaan bestaat uit verschillende stoffen, waaronder water, eiwitten en lipiden. De basisstrategie van weefselzuivering is dus het vervangen van water en lipiden in weefsels door refractieve index (RI) overeenkomende reagentia die dezelfde optische eigenschappen hebben als eiwitten4. Om een transparant monster te observeren, is een lichtblad fluorescerende microscopie nuttig5. Lichtplaten verlichten het transparante monster vanaf de zijkant en excitatiesignalen worden verkregen door de objectieflens in een verticale positie6. Deze microscopie verkrijgt in één beweging dwarsdoorsnede-informatie, die verschilt van de confocale of multifoton fluorescerende microscopie. Zo kan het snel z-stack-afbeeldingen verkrijgen met een laag niveau van fotobleaching.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) is een van de weefselzuiveringsmethoden die beeldvorming van hele organen mogelijk maakt door fluorescentiemicroscopie 2,7,8. CUBIC en whole-mount immunofluorescente kleuring zijn in deze studie geoptimaliseerd om 3D-structuren van muizennieren te visualiseren 9,10,11. Met behulp van deze whole-mount kleuringsmethode wordt de verandering in renale sympathische zenuwen gevisualiseerd na ischemie-reperfusieletsel 9,10 en glomerulomegallie in het vroege stadium van diabetische nierziekte11, evenals bloedvaten, proximale tubuli en verzamelkanalen in een hele nier9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol maakte 3D-beeldvorming van de hele nier mogelijk van verschillende structuren zoals sympathische zenuwen, verzamelkanalen, slagaders, proximale tubuli en glomeruli 9,10,11. Deze kleuringsmethode bood macroscopische observatie en leidde tot nieuwe biologische ontdekkingen, door de verandering in renale sympathische zenuwen na ischemie-reperfusieletsel 9,10<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een deel van dit werk werd uitgevoerd door samenwerking met Prof. Hiroki R. Ueda (Universiteit van Tokio), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada en Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
