Traditionelt udføres cellekultur på plane substrater, der dårligt efterligner cellernes naturlige miljø in vivo. Her beskriver vi en metode til at producere cellekultursubstrater med fysiologisk relevante buede geometrier og mikropatternede ekstracellulære proteiner, hvilket muliggør systematiske undersøgelser af cellulær sensing af disse ekstracellulære signaler.
Den ekstracellulære matrix er en vigtig regulator af cellefunktionen. Miljømæssige signaler, der findes i det cellulære mikromiljø, såsom ligandfordeling og vævsgeometri, har i stigende grad vist sig at spille kritiske roller i styring af cellefænotype og adfærd. Imidlertid studeres disse miljømæssige signaler og deres virkninger på celler ofte separat ved hjælp af in vitro-platforme , der isolerer individuelle signaler, en strategi, der stærkt forenkler den komplekse in vivo-situation med flere signaler. Tekniske tilgange kan være særligt nyttige til at bygge bro over dette hul ved at udvikle eksperimentelle opsætninger, der fanger kompleksiteten af in vivo-mikromiljøet , men alligevel bevarer graden af præcision og manipulerbarhed af in vitro-systemer .
Denne undersøgelse fremhæver en tilgang, der kombinerer ultraviolet (UV) -baseret proteinmønstre og litografibaseret substratmikrofabrikation, som sammen muliggør undersøgelse af celleadfærd med høj kapacitet i multicue-miljøer. Ved hjælp af maskeløs UV-fotopatterning er det muligt at skabe komplekse, klæbende proteinfordelinger på tredimensionelle (3D) cellekultursubstrater på chips, der indeholder en række veldefinerede geometriske signaler. Den foreslåede teknik kan anvendes til kultursubstrater fremstillet af forskellige polymere materialer og kombineret med klæbende mønstrede områder af en bred vifte af proteiner. Med denne tilgang kan enkeltceller såvel som monolag udsættes for kombinationer af geometriske signaler og kontaktvejledningssignaler præsenteret af de mønstrede substrater. Systematisk forskning ved hjælp af kombinationer af chipmaterialer, proteinmønstre og celletyper kan således give grundlæggende indsigt i cellulære reaktioner på multicue-miljøer.
In vivo udsættes celler for en lang række miljømæssige signaler, der kan være af mekanisk, fysisk og biokemisk karakter, der stammer fra den ekstracellulære matrix (ECM). Talrige miljømæssige signaler er blevet identificeret til at spille afgørende roller i reguleringen af celleadfærd, såsom spredning, differentiering og migration 1,2,3,4,5. Et af de mest undersøgte fænomener er kontaktvejledning, der beskriver adhæsionsmedieret cellejustering langs anisotrope biokemiske eller topografiske mønstre, der findes på det ekstracellulære substrat 6,7,8,9,10,11. Ud over at styre justeringen af celler har kontaktvejledningssignaler også vist sig at påvirke andre celleegenskaber såsom cellemigration, organisering af intracellulære proteiner, celleform og celleskæbne 12,13,14,15. Derudover er den geometriske arkitektur i det 3D-cellulære miljø også blevet anerkendt for dets regulatoriske indflydelse på celleadfærd 16,17. I menneskekroppen udsættes celler for en række buede geometrier, der spænder fra mikroskala kollagenfibre, kapillærer og glomeruli, op til mesoskala alveoler og arterier18,19. Interessant nok har nylige in vitro-undersøgelser vist, at celler kan fornemme og reagere på sådanne fysiske signaler, fra nano- til mesoskala 20,21,22,23.
Til dato er de fleste undersøgelser, der undersøger cellerespons på miljøsignaler, stort set blevet udført ved hjælp af eksperimentelle opsætninger, der isolerer enkelte signaler. Mens denne tilgang har muliggjort enorme fremskridt i forståelsen af de grundlæggende mekanismer bag cellulær sensing af miljøsignaler, rekapitulerer den dårligt in vivo-miljøet, der samtidig præsenterer flere signaler. For at bygge bro over denne kløft er det nyttigt at udvikle kulturplatforme, hvor flere miljøsignaler kan kontrolleres uafhængigt og samtidigt. Dette koncept har fået stigende trækkraft på det seneste24,25, med undersøgelser, der kombinerer matrixstivhed og ligandtæthed 26,27,28,29, substratstivhed og porøsitet 30, substratstivhed og 3D mikronichevolumen31, overfladetopografi og kontaktstyringssignaler 32,33,34 og nanoskala kontaktvejledningssignaler med mesoskala krumningsvejledningssignaler23. Det er dog stadig udfordrende at kombinere kontaktstyringssignaler med en række 3D-geometrier på en kontrolleret og høj gennemstrømnings måde.
Denne forskningsprotokol adresserer denne udfordring og introducerer en metode til at skabe cellekultursubstrater med en kontrolleret kombination af mønstrede klæbende områder af ECM-proteiner (kontaktstyringssignaler) og substratkrumning (geometriske signaler). Denne tilgang muliggør dissektion af cellerespons i et biomimetisk multicue-miljø på en systematisk og høj gennemstrømningsmåde. Den erhvervede viden kan hjælpe med yderligere forståelse af celleadfærd i komplekse miljøer og kan bruges til at designe lærerige materialer med egenskaber, der styrer celleresponser til et ønsket resultat.
Fotopatlering af 3D-protein
Oprettelse af klæbende områder af ECM-proteiner (kontaktstyringssignaler) på cellekulturmaterialer kan opnås ved hjælp af en række forskellige teknikker, for eksempel ved dyb-ultraviolet (dyb-UV) mønster eller mikrokontaktudskrivning35,36. Dyb UV-mønster gør brug af UV-lys, der projiceres gennem en maske på et polymert materiale for at nedbryde passiveringspolymerer på bestemte steder på cellekultursubstratet. Det mønstrede substrat inkuberes derefter med en ligand af interesse, hvilket resulterer i klæbende områder, der understøtter cellefastgørelse og kultur på foruddefinerede steder 12,37,38. En alternativ måde at introducere proteinmønstre på er ved hjælp af mikrokontakttryk, hvor elastomere frimærker indeholdende en ønsket form er belagt med et protein efter eget valg og presses på et cellekultursubstrat og derved overfører proteinbelægningen, som cellerne kan klæbe til 35,37,39,40 . Desværre, da begge teknikker er afhængige af maskeforberedelse og bløde litografimetoder, er eksperimenterne tidskrævende og arbejdskrævende såvel som begrænsede med hensyn til mønsterfleksibilitet. Derudover er både dyb-UV-mønster og mikrokontaktprint mest velegnede til plane materialer og er teknisk vanskelige, hvis ikke umulige, til at mønstre ligander i et 3D-miljø.
For at forbedre disse konventionelle metoder kombinerede Waterkotte et al. maskeløs litografi, kemisk dampaflejring og termoformning for at generere mikropatternede 3D polymere substrater41. Denne teknik er imidlertid afhængig af brugen af termoformbare polymerfilm og tilbyder lav proteinmønsteropløsning (7,5 μm), mens celler er rapporteret at reagere på geometriske proteinmønstre så små som 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. beskrev en anden lovende metode til nanopattern ECM ligander på substrater indeholdende nano- og mikrometer topografier43. Ved hjælp af mikrokontakttryk blev ECM-proteiner overført fra polydimethylsiloxan (PDMS) stempler til et termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Derefter tillod den termoresponsive egenskab af pNIPAM-netværket dem at overføre det todimensionale (2D) proteinmønster til et topografisk PDMS-substrat (10-100 μm dybe riller) og derved kontrollere lokaliseringen af vedhæftningssteder på topografiske egenskaber. Imidlertid kan ikke alle mulige mikrotopografier mønstres, da nedsatte befugtningsproblemer gør det vanskeligere at mønstre dybere topografiske substrater. Grøfter med et dybde-til-bredde-billedformat på 2,4 er blevet rapporteret at være den ultimative grænse for vellykket overførsel af mønsteret til det topografiske substrat43. Derudover er fleksibiliteten i forskellige mønstre og opløsningen af de genererede mønstre dårlig på grund af kravet om mikrokontaktudskrivning.
Dette papir beskriver en metode, der overvinder ovennævnte flaskehalse og tilbyder en fleksibel metode med høj kapacitet til at skabe multicue-substrater, der kan bruges til cellekultur (se figur 1). Fysiologisk relevante geometrier (cylindre, kupler, ellipser og sadeloverflader) med krumninger fra ĸ = 1/2500 til ĸ = 1/125 μm-1 er prædesignet og mikrofabrikeret i PDMS-chips . Efterfølgende oprettes kontaktvejledningssignaler oven på 3D-geometrierne ved hjælp af en række digitale mønsterdesign ved at anvende en fotopattering-teknik med en opløsning så lille som 1,5 μm44. Til dette formål passiveres PDMS-chipsene oprindeligt for at forhindre celler og proteiner i at klæbe; dette passiveringslag kan derefter fjernes ved kombination af fotoinitiatoren 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP) og UV-lyseksponering45. En digital maske er designet til at specificere placeringen af UV-eksponering og dermed det område, hvor passiveringslaget fjernes. Proteiner kan efterfølgende klæbe til disse områder, hvilket muliggør cellebinding. Da mønsteret udføres ved hjælp af en digital (snarere end en fysisk) maske, kan der hurtigt oprettes en række mønstre uden besværet og omkostningerne forbundet med at designe og fremstille yderligere fotomasker. Derudover kan en bred vifte af ECM-proteiner (f.eks. Kollagen type I, gelatine og fibronectin) mønstres på substratet. Selvom denne protokol udføres ved hjælp af cellekulturchips lavet af PDMS, kan princippet anvendes på ethvert andet materiale af interesse46.
I dag studeres celleadfærd ofte på flade kultursubstrater, der mangler kompleksiteten af det oprindelige cellemikromiljø. 3D-miljøer som stilladser og hydrogeler bruges som et alternativ. Selvom disse cellekulturmiljøer forbedrer in vivo-relevansen, er både systematiske undersøgelser af celleadfærd og gennemførligheden af udlæsningsmetoder fortsat udfordrende. For systematisk at undersøge celleadfærd på repræsentative kultursubstrater er der behov for konsistente multicue substrater, der muliggør mikroskopisk aflæsning. Derfor beskriver vi i denne protokol en metode til at skabe multicue cellekultursubstrater med fysiologisk relevante geometrier og mønstrede ECM-proteiner. Den største udfordring ved at kombinere miljøsignaler som vævsgeometri og kontaktvejledningssignaler på in vitro-platforme er i vid udstrækning af teknologisk karakter. Konventionelle metoder til at anvende kontaktstyringssignaler (f.eks. Blød litografi, dyb UV-mønster og mikrokontaktudskrivning35,36) på cellekulturmaterialer er optimeret til plane substrater. Behovet for 3D-cellekulturmaterialer kombineret med kontaktvejledningssignaler fremhævede flere teknologiske udfordringer, såsom dårlig mønsterjustering, opløsning og fleksibilitet. For at overvinde disse udfordringer kan en høj kapacitet, maskeløs, lysbaseret mønstermetode bruges45,49. Her muliggør et optisk mikroskop præcis mønsterjustering og en opløsning i størrelsesordenen mikrometer (se figur 6). Desuden gør brugen af en digital maske det muligt for forskere at studere celleadfærd på en lang række mønstre uden behov for at fremstille arbejdskrævende fysiske masker.
UV-fotopatterning-tilgangen kan anvendes i kombination med en række 3D-geometrier (f.eks. cylindre, sadler, kupler, gruber) fremstillet af en række forskellige materialer48. De 3D-cellekultursubstrater, der anvendes i denne undersøgelse, er fremstillet af PDMS; dog kan andre materialer også bruges. Dette kan kræve forskellige trin for at producere det endelige cellekultursubstrat, der indeholder de interessante funktioner. Da celler har vist sig at være følsomme over for overfladeruhed af cellekulturmaterialer, er det vigtigt at skabe cellekulturchips med en glat overflade, så de observerede cellers respons fuldt ud kan tilskrives 3D-geometrien og kontaktstyringssignalerne50,51. Målemetoder såsom optisk profilometri, scanningselektronmikroskopi eller atomkraftmikroskopi kan bruges til at måle overfladeruhed. Efter fremstilling af cellekulturmaterialet kan man vælge en mønstermetode baseret på et eller flere fokusplaner afhængigt af de specifikke dimensioner af funktionen af interesse (se figur 3). Typisk bruges et enkelt brændplan til at mønstre et område inden for et Z-område på ca. 50 μm. Mønsteropløsningen viste sig at være konsistent ved hjælp af denne tommelfingerregel (se figur 6). En ulempe ved denne metode er imidlertid den øgede mønstertid med introduktionen af flere fokusplaner og mønstre. I vores hånd, ved hjælp af flere fokalplaner, er 3D geometriske funktioner op til 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) med succes blevet mønstret med høj mønsterkvalitet.
Derudover er det vigtigt at nævne, at højden (Z-aksen) af geometriske træk, der kan bruges i kombination med denne protokol, er begrænset. Da både UV-fotopatterning og mange cellulære aflæsninger er afhængige af en mikroskopiopsætning, bestemmer målenes arbejdsafstand den maksimale højde af en funktion. I vores hånd kan geometrier, der overstiger en højde på 300 μm, stadig UV-fotopatterneres, og aflæsninger er udført ved hjælp af et konfokalt mikroskop med 40x mål. Således er mekanobiologisk forskning lige fra intracellulære til cellulære og vævsskalaer mulig ved anvendelse af den beskrevne protokol.
En anden faktor, der skal tages højde for, er risikoen for, at prøver tørrer ud under eller efter UV-fotopatterning49. Dette er især relevant ved brug af 3D-geometrier, da konveksiteter ofte udsættes uden for cellekulturmaterialer. Som vist i figur 4 kan dette resultere i ujævne mønstre med proteinaggregater, der dannes oven på interessefunktionen. Vask af cellekulturchips efter proteininkubation og under cellekultur er afgørende for korrekt belægning af 3D-geometrier. Derfor anbefales det altid at efterlade små mængder af en arbejdsløsning (PBS, PLPP, proteinopløsning, cellekulturmedium) oven på cellekulturchippen.
Indtil videre er flere proteinbelægninger (fibronectin, kollagen type I og IV, gelatine, FNC) og celletyper (humane knoglemarvstromale celler, humane myofibroblaster, humane endotelceller, humane keratocytter og dermale fibroblaster) blevet anvendt i kombination med den beskrevne fotopatteringsmetode på strukturerede cellekulturmaterialer. Som vist i en tidligere undersøgelse48 er optimering af proteininkubationsparametre nøglen til systematisk undersøgelse i nye celletyper. Derfor anbefales det at teste en række proteinkoncentrationer, inkubationstemperaturer og inkubationstider, inden der udføres et nyt eksperiment med nye proteiner eller celler. Ved at sammenligne cellemorfologi efter indledende adhæsion på homogene, mønstrede flade områder med cellemorfologi under ‘normale’ cellekulturbetingelser kan der opnås et optimeret sæt eksperimentelle parametre. Derudover kan hver celletype kræve en anden tid efter såning for at vise en genkendelig vedhæftningsmorfologi på et specifikt multicue-miljø (se figur 5). Til dette formål er det afgørende at optimere den tid, der kræves pr. celletype for at præsentere kontakthændelser på det mønstrede område under vask i trin 8.4. For eksempel observerede vi, at humane keratocytter på linjemønstre viser langstrakte morfologier inden for de første 30 minutter efter såning, mens endotelceller og dermale fibroblaster kræver flere timer, før de viser en ændring i adhæsionsmorfologi. De eksperimentelle parametre, der kræves til proteininkubation (trin 7) og cellesåning (trin 8), kan således afhænge af det valgte protein og den valgte celletype.
Den præsenterede tilgang til at anvende kontaktvejledningssignaler på 3D-geometrier kan hjælpe med at skabe en dybere forståelse af celleadfærd i komplekse multicue-miljøer. Dette kan omfatte undersøgelser af intracellulære komponenter, såsom fokale adhæsioner og kerner, og kan også involvere eksperimenter udført på en større celle- eller vævsskala ved anvendelse af den foreslåede metode. Til sidst forventes det, at den opnåede viden kan bruges i design af vævstekniske applikationer, hvor komplekse cellulære miljøer er designet til at styre celleadfærd mod et ønsket resultat.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) for at levere humane primære keratocytter. Dette arbejde er blevet støttet af Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Det Europæiske Forskningsråd (bevilling 851960) og Ministeriet for Uddannelse, Kultur og Videnskab for Gravitationsprogrammet 024.003.013 “Materialedrevet regenerering”. Forfatterne vil gerne takke Alvéole for deres korrespondance, hjælp og fejlfinding.
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |