Summary
نحن تصف مقايسة النوعية لالتصاق الخميرة وغزو آغار كمقياس للتمايز الغازية والكاذبة. ويمكن استخدام هذا الاختبار البسيط لتقييم النمط الظاهري الغازية من المسوخ المختلفة فضلا عن الآثار البيئية والعظة مما يشير مسارات على التفرقة الخميرة.
Abstract
تم العثور على الخمائر في الأغشية الحيوية الطبيعية ، حيث العديد من الكائنات الحية الدقيقة استعمار السطوح. في البيئات الاصطناعية ، مثل أسطح الأشياء التي يصنعها الإنسان ، ويمكن الحد من الأغشية الحيوية الإنتاجية الصناعية ، وتدمير الهياكل ، وتهدد حياة الإنسان. 1-3 ومن ناحية أخرى ، يمكن تسخير قوة الأغشية الحيوية مساعدتها في تنظيف البيئة وتوليد الطاقة المستدامة. تم تجاهل معظمها 4-8 قدرة الجعوية S. لاستعمار سطوح والمشاركة في الأغشية الحيوية المعقدة إلى إعادة اكتشاف البرامج الناجمة عن تمايز مختلف مسارات إشارات ومنبهات البيئية في هذا الحي. 9 و 10 على الاهتمام المستمر في استخدام S. الجعوية باعتباره النموذج الحي لفهم التفاعل والتقارب بين مسارات الإشارات ، مثل رأس PKA ، MAPK Kss1 ، ومسارات الأسمولية Hog1 ، وضعت بسرعة S. الجعوية في تقاطع بيوفيلم البيولوجيا والبحوث إشارة تنبيغ. 11-20 ولتحقيق هذه الغاية ، وأصبح التمييز بين خلايا الخميرة إلى الطويل ، خيوط لاصقة الكاذبة قراءات مناسبة لتفعيل مسارات نقل الإشارة إلى التغيرات البيئية المختلفة. ومع ذلك ، filamentation هي عبارة عن مجموعة من الظواهر المعقدة ، الأمر الذي يجعل يعاير لأنها كما لو كانت بسيطة النمط الظاهري مضلل. في العقد الماضي ، تم اعتماد المقايسات بنجاح العديد من الدراسات للبحث عن البكتيريا بيوفيلم الخميرة ، مثل تشكيل MAT المقايسات لقياس انتشار مستعمرة أغار على الناعمة والكريستال البنفسجي تلطيخ لقياس الكمي سطح الخلية الانضمام. 12 ، 21 ومع ذلك ، كان هناك بعض الارتباك في المقايسات وضعت لتقييم الظواهر نوعيا لاصقة والغازية من الخميرة في أجار. هنا ، نقدم طريقة بسيطة وموثوق بها لتقييم جودة لاصقة والغازية من سلالات الخميرة مع سهلة لفهم خطوات لعزل تقييم التصاق من الاقتطاعات الإلزامية من الغزو. لدينا وسيلة ، من خلال الدراسات السابقة التي اعتمدت ، 10 ، 16 ينطوي على الخلايا المتزايد في وسائل الإعلام والطلاء السائل على المغذيات الشروط التفضيلية للنمو بقع كبيرة ، ونحن ثم يغسل بالماء لتقييم التصاق الخلايا تماما وفرك قبالة سطح آغار لتقييم الغزو في وآغار. نقضي على ضرورة streaking الخلايا على أجار ، مما يؤثر على غزو الخلايا في أجار. بصفة عامة ، لاحظنا أن السلالات التي تغزو فرداني آغار دائما لاصقة ، ولكن ليس كل سلالات لاصقة يمكن غزو المتوسطة أجار. ويمكن استخدام النهج الذي نتبعه في بالاشتراك مع فحوصات أخرى لتشريح دقيق للخطوات التمايز ومتطلبات نقل الإشارة الخميرة ، والتمايز ، والاستشعار عن النصاب القانوني ، وتشكيل بيوفيلم.
Protocol
- وضع 200ul الثقافات تزايد اهتمام وسائل الاعلام على لوحات الاصطناعية مع الشروط المطلوبة التجويع (SC الجلوكوز مع 2 ٪ مقابل SC مع السكر بنسبة 0.2 ٪ ، على سبيل المثال) إذا كانت كثافة ثقافات مختلفة جدا عن بعضها البعض ، وضبط عدد الخلايا في الثقافة 200ul لذلك كل قطرة وتقريبا نفس الكمية من الخلايا.
- تأكد من أن تحتفظ بسجلات منها قطرة على لوحات غير التي الثقافة.
- الحفاظ على الغطاء مواربا لوحة وإما ترك في درجة حرارة الغرفة أو حتى 30 درجة مئوية حتى قطرات جافة.
- لوحات الختم مع parafilm والبلاستيك التفاف (اختياري) وترك في 30 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام.
- وثيقة نمو الخلايا على لوحات (عن طريق المسح الضوئي والتقاط صورة رقمية ، الخ.)
- غسل الخلايا من على سطح المياه مع آغار الضغط العالي (DI يفضل الماء) لمدة دقيقة تقريبا مع الحرص على عدم رفع آغار وتغيير الاتجاه.
- التخلص من الماء الزائد عن طريق التنصت على لوحات المناشف الورقية وتركهم عرضة لتجف.
- مرة واحدة على لوحات جافة التصاق الوثيقة على كل لوحة (عن طريق المسح أو التقاط الصور الرقمية)
- مع إصبع القفاز ، وفرك بلطف خلايا شكل السطح آغار تحت الماء الجاري لمدة دقيقة تقريبا.
- لوحات الجافة كما كان من قبل.
- اذا كنت تستخدم على نطاق تشريح ، وإزالة الإبرة قبل وضع لوحات على منصة المجهر.
- الغزو وثيقة مع التكبير 10x أو 40X. تأكد من التركيز على الجزء الأوسط من كل دائرة ، على حواف سيكون مزدحما للغاية لرؤية morphologies الخلايا الفردية. يمكن أن تشير إلى حواف مستوى النمو الخيطية ، ويمكن أن تكون موثقة لتكون مرجعا في المستقبل. يمكن مسح أو التقاط صورة رقمية للوحة كاملة تكون مفيدة أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلايا الخميرة وسائط عرض مختلفة المفاضلة وفقا لتوافر المواد الغذائية والظروف البيئية ، بما في ذلك تشكيل بوغ في ظل ظروف المجاعة والإجهاد ، وتحت الضغوط filamentation المغذيات المختلفة ، وتلبد. ويمكن أيضا الخمائر المختلفة ، بما في ذلك وخميرة S. albicans C. ، يمكن العثور عليها في الأغشية الحيوية التي شكلتها مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة. وإن كان هناك بعض الارتباط مع filamentation والسلوك الغازية ، وأنه ليس من الواضح بالضبط كيف filamentation قد تسبب الغزو والاستعمار من السطوح والأنسجة. يمكن بالتأكيد خميرة يمكن العثور عليها في كل من الأشكال النباتية والخيطية في الأغشية الحيوية في الطبيعة ، وكذلك الأماكن التي تهدد صحة الإنسان ، مثل القسطرة والأعضاء البشرية المصابة. 10-13 وبغية فهم مسارات الإشارات التي تستخدمها الخمائر لتصيب الحيوانات والمشاركة في الأغشية الحيوية الضارة والنافعة ، علينا تطوير المقايسات الوصول إليها ويعول عليها. هنا قمنا بتطوير الفحص ، الذي اعتمد من التصاق القائمة بالفعل والمقايسات غزو المتاحة للخميرة ، والتي تسمح لنا لتحديد الظواهر نوعيا لاصقة والغازية من سلالات الخميرة والمسوخ في مختلف الظروف. المقايسة المقدمة هنا يلغي شرط streaking على خلايا الخميرة وآغار ، حيث عمل مجرد streaking سطح آغار تغيير الصفات الغازية والمواد اللاصقة من الخميرة. التصوير الرقمي من غزو خلايا خاصة من قبل المجهر يسمح للنصف الكمية تقييم درجة الغزو والالتصاق. الكشف عن هذه الخلايا الغازية وغير لاصقة مجانية للأجار خلية واحدة مقايسة الغزو الذي وضعه مختبر سبراغ (9) ويمكن تكييفها لدوام القيام بالمزيد من التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر ليزا Schneper Duevel وكاترين لرؤاهم في تطوير هذا الاختبار.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
