Summary
हम खमीर और आक्रामक और pseudohyphal भेदभाव के एक उपाय के रूप में अगर आक्रमण आसंजन के लिए एक गुणात्मक परख का वर्णन. यह सरल परख विभिन्न म्यूटेंट के आक्रामक phenotype के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रभाव पर्यावरण cues का आकलन और खमीर भेदभाव पर रास्ते संकेतन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
- आवश्यक भुखमरी की स्थिति (0.2% ग्लूकोज के साथ अनुसूचित जाति बनाम 2% ग्लूकोज के साथ अनुसूचित जाति, उदाहरण के लिए) के साथ सिंथेटिक मीडिया प्लेटों पर ब्याज की बढ़ती संस्कृतियों के 200ul रखो यदि संस्कृतियों का घनत्व भी एक दूसरे से अलग हैं, 200ul संस्कृति के प्रति कोशिका गिनती समायोजित इसलिए प्रत्येक ड्रॉप मोटे तौर पर कोशिकाओं के एक ही राशि है.
- रिकॉर्ड प्लेटों पर जो ड्रॉप की जो संस्कृति है रखने के लिए सुनिश्चित करें.
- थाली ढक्कन अधखुला रखें और कमरे के तापमान पर या 30 में या तो छोड़ ° सी जब तक बूँदें सूख रहे हैं.
- Parafilm और प्लास्टिक की चादर (वैकल्पिक) के साथ सील प्लेटें और 3-7 दिनों के लिए 30 ° सी में छोड़ दें.
- (स्कैनिंग के द्वारा, एक डिजिटल चित्र, आदि लेने) प्लेटों पर कोशिकाओं के विकास को दस्तावेज़
- कोशिकाओं बंद धो के बारे में एक मिनट अगर के लिए ख्याल रख रही नहीं उठा और ओरिएंटेशन बदलने के लिए उच्च दबाव पानी (अधिमानतः डि पानी) के साथ अगर सतह की.
- कागज तौलिए पर प्लेटें दोहन और उन्हें सूखी करने के लिए खुला छोड़ने से अतिरिक्त पानी से छुटकारा प्राप्त करें.
- एक बार प्लेटें प्रत्येक प्लेट पर सूखी दस्तावेज़ आसंजन (स्कैनिंग या डिजिटल तस्वीरें लेने के द्वारा )
- एक दस्ताने उंगली के साथ, धीरे बंद रगड़ना कोशिकाओं अगर सतह के बारे में एक मिनट के लिए चल रहे पानी के नीचे के रूप में.
- पहले के रूप में प्लेटें सूखी.
- यदि एक विदारक गुंजाइश का उपयोग कर खुर्दबीन मंच पर प्लेटें रखने से पहले सुई को हटा दें.
- 10x या 40x बढ़ाई के साथ दस्तावेज़ आक्रमण . प्रत्येक चक्र के मध्य भाग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए किनारों भी होना व्यक्तिगत सेल morphologies देख भीड़ सुनिश्चित करें. किनारों filamentous विकास के स्तर से संकेत मिलता है और भविष्य में संदर्भ के लिए प्रलेखित किया जा सकता है है सकते हैं. स्कैन या पूरी थाली के एक डिजिटल तस्वीर लेने में भी सहायक हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
खमीर कोशिकाओं को पोषक तत्वों की उपलब्धता और पर्यावरण की स्थिति के अनुसार विभिन्न भेदभाव मोड भुखमरी और तनाव की स्थिति, विभिन्न पोषक तत्व तनाव के तहत filamentation, और flocculation के तहत बीजाणु गठन सहित, प्रदर्शित करते हैं. एस cerevisiae और सी. albicans सहित विभिन्न yeasts, सूक्ष्मजीवों की एक विविध सेट द्वारा गठित biofilms में भी पाया जा सकता है. हालांकि filamentation और आक्रामक व्यवहार के साथ कुछ संबंध है, यह स्पष्ट नहीं है बिल्कुल कैसे filamentation सतहों और ऊतकों के आक्रमण और उपनिवेशण का कारण हो सकता है. खमीर निश्चित रूप से प्रकृति में biofilms में दोनों वनस्पति और filamentous रूपों के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्थानों पर जहां वे मानव स्वास्थ्य धमकी, जैसे कैथेटर और संक्रमित मानव अंगों में पाया जा सकता है है. 10-13 क्रम में संकेत yeasts द्वारा उपयोग के लिए पशुओं को संक्रमित हैं और के लिए हानिकारक है और लाभप्रद biofilms में भाग लेने के रास्ते को समझने के लिए, हम सुलभ और विश्वसनीय assays विकसित करना होगा. यहाँ हम एक परख है, पहले से ही मौजूदा आसंजन और आक्रमण खमीर के लिए उपलब्ध assays से अपनाया है, जो हमें विभिन्न परिस्थितियों में गुणात्मक खमीर उपभेदों और म्यूटेंट के चिपकने वाला और आक्रामक phenotypes निर्धारित की अनुमति विकसित किया है. यहाँ प्रस्तुत परख अगर है, जहां अगर सतह streaking की मात्र कार्रवाई खमीर के आक्रामक और चिपकने वाला गुणों में परिवर्तन पर खमीर कोशिकाओं streaking के लिए आवश्यकता को समाप्त. विशेष रूप से एक खुर्दबीन द्वारा हमलावर कोशिकाओं के डिजिटल इमेजिंग अर्द्ध मात्रात्मक आक्रमण और आसंजन की डिग्री के आकलन के लिए अनुमति देता है. आक्रामक और चिपकने वाला कोशिकाओं के इस तरह के पता लगाने के मानार्थ एकल कक्ष अगर आक्रमण परख Sprague 9 प्रयोगशाला द्वारा विकसित की है और करने के लिए समय बेशक प्रयोगों करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम इस परख के विकास में अपनी अंतर्दृष्टि के लिए लिसा Schneper और कैट्रीन Duevel धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
