Summary
Мы описываем качественный анализ для адгезии дрожжей и агар вторжение в качестве меры инвазивных и pseudohyphal дифференциации. Этот простой анализ может быть использован для оценки инвазивного фенотипа различных мутантов, а также эффекты сигналами окружающей среды и сигнальных путей на дрожжах дифференциации.
Abstract
Дрожжи находятся в естественном биопленки, где многие микроорганизмы колонизировать поверхности. В искусственных условиях, таких как поверхности искусственных объектов, биопленки может снизить производительность, уничтожить структур, и поставить под угрозу человеческую жизнь. 1-3 С другой стороны, использование энергии биопленок может помочь очистить окружающую среду и создания устойчивой энергетики. 4-8 способность ЗассЬаготусез С. колонизировать поверхности и участвовать в сложных биопленки в основном игнорируются, пока новое открытие дифференциация программ вызваны различные сигнальные пути и сигналами окружающей среды в данном организме. 9, 10 по-прежнему заинтересовано в использовании С. CEREVISIAE качестве модельного организма для понимания взаимодействия и сближения сигнальных путей, таких, как Рас-ПКА, Kss1 МАРК, и Hog1 пути осмолярность, быстро размещены С. CEREVISIAE на стыке биопленки биологии и исследования передачи сигнала. 11-20 С этой целью, дифференциация клеток дрожжей в длинные, клей, pseudohyphal нитей стал удобным отсчет для активации пути передачи сигналов от различных изменений окружающей среды. Тем не менее, филаментации представляет собой сложный набор фенотипов, что делает опробование для него, как будто это простая фенотипа в заблуждение. В последнее десятилетие в ряде тестов были успешно приняты от бактериального исследования биопленки на дрожжах исследований, таких как формирование MAT тесты для измерения колонии распространяются на мягком агаре и окрашивания кристаллическим фиолетовым количественно измерить на поверхности клеток приверженности. 12, 21, однако, наблюдается некоторая путаница в анализах разработана с целью качественного анализа клея и инвазивного фенотипа дрожжей в агар. Здесь мы приведем простой и надежный метод оценки клея и инвазивных качества штаммов дрожжей с легким для понимания шагов, чтобы изолировать адгезии оценки от вторжения оценки. Наш метод, принятый от предыдущих исследований, 10, 16 включает в себя растущих клеток в жидкой среде и покрытие по дифференциальным питательных условий для роста крупных пятен, которые мы затем промыть водой для оценки адгезии и втирать клетки полностью от поверхности агара для оценки вторжение в агар. Мы устраняем необходимость полос клеток на агар, который влияет на вторжение в клетки в агар. В целом, мы обнаружили, что гаплоидных штаммов, которые вторгаются в агар всегда клея, но не все штаммы клей может вторгнуться в агар. Наш подход может быть использован в сочетании с другими анализы тщательно анализировать дифференциацию шагов и требований дрожжей передачи сигнала, дифференциация, кворума, а также формирование биопленок.
Protocol
- Положите 200ul растущих культур процентов по синтетических пластин сред с требуемым условиям голодания (ПК с 2% глюкозы по сравнению с SC с 0,2% глюкозы, например) Если плотность культур, слишком отличаются друг от друга, настроить клеток в культуре 200ul так что каждая капля имеет примерно такое же количество клеток.
- Убедитесь в том, чтобы вести учет которых падают на пластины которого культура.
- Держите приоткрытой пластины крышкой и оставить либо при комнатной температуре или при температуре 30 ° С до капли сухой.
- Уплотнение пластин с парафильмом и полиэтиленовой пленкой (опционально) и оставить на 30 ° С в течение 3-7 дней.
- Документ рост клеток на пластинах (путем сканирования, принимая цифрового изображения, и т.д.)
- Вымойте клетки прочь поверхность агара с водой под высоким давлением (желательно DI воды) в течение приблизительно минуты заботясь о агар не отменять и изменять ориентацию.
- Избавиться от лишней воды, нажав пластин на бумажных полотенцах и оставляя их открытыми для просушки.
- Как только пластины сухой адгезии документ на каждой пластине (путем сканирования или принятие цифровых фотографий)
- С палец в перчатке, аккуратно стереть клетки образуют поверхность агара в проточной воде в течение приблизительно минуты.
- Сухие пластины, как раньше.
- При использовании рассекает сферу, удалите иглу до размещения пластин на микроскоп платформы.
- Документ вторжения с 10x или 40x увеличением. Убедитесь в том, чтобы сосредоточиться на среднюю часть каждого круга, для края будут слишком тесно, чтобы увидеть отдельные морфологии клетки. Края могут указать уровень нитчатые роста и могут быть документированы для дальнейшего использования. Сканирование или принимать цифровое изображение всей пластине также может быть полезно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дрожжевые клетки отображать различные режимы дифференциации в зависимости от наличия питательных веществ и условий окружающей среды, в том числе образование спор в голоде и стрессе, филаментации в различных питательных напряжений и флокуляции. Различные дрожжи, в том числе С. CEREVISIAE и C. Albicans, также могут быть найдены в биопленки образована разнообразных микроорганизмов. Хотя есть некоторая корреляция с филаментации и инвазивных поведение, пока не ясно, как именно филаментации может привести к инвазии и колонизации поверхностей и тканей. Дрожжи, безусловно, может быть найден как в вегетативной и нитчатых форм в биопленки в природе, а также места, где они угрожают здоровью человека, таких как катетеры и инфицированных человеческих органов. 10-13 Для того чтобы понять сигнальных путей, используемых дрожжей для заражения животных и участвовать во вредных и полезных биопленки, мы должны развивать доступных и надежных тестов. Здесь мы разработали анализа, заимствованные из уже существующих адгезии и инвазии анализы для дрожжей, которые позволяют нам качественно определить клея и инвазивного фенотипа штаммов дрожжей и мутантов в различных условиях. Анализ представленных здесь снимает требование полос дрожжевых клеток на агар, где простые действия полос поверхность агара изменения инвазивных и клей качества дрожжей. Цифровые изображения особо вторжения клеток микроскоп позволяет полу-количественная оценка степени инвазии и адгезии. Такое выявление инвазивных и клей клетки бесплатный одной клетки агар вторжения анализа разработан Спраг лаборатории 9 и может быть адаптирована к делать эксперименты время курса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Лизу Schneper и Катрин Duevel за их идеи в развитии этого анализа.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
