Summary
Vi beskriver en kvalitativ analys för jäst vidhäftning och agar invasion som ett mått på invasiv och pseudohyphal differentiering. Denna enkla analys kan användas för att bedöma invasiv fenotyp av olika mutanter samt effekterna miljö-signaler och signalvägar i jäst differentiering.
Abstract
Jäst finns i naturliga biofilm, där många mikroorganismer kolonisera ytor. I konstgjorda miljöer, såsom ytor av syntet-objekt kan biofilmer minska industriell produktivitet, förstöra strukturer och hotar människors liv. 1-3 Å andra sidan kan utnyttja kraften i biofilmen hjälper till att rena miljön och skapa hållbar energi. 4-8 förmåga S. cerevisiae att kolonisera ytor och delta i komplexa biofilm var mestadels ignoreras tills återupptäckten av differentiering program som utlöses av olika signalvägar och miljömässiga ledtrådar i denna organism. 9, 10 Den fortsatta intresset för att använda S. cerevisiae som modellorganism för att förstå interaktion och konvergens av signalvägar, som Ras-PKA, Kss1 MAPK och Hog1 vägar osmolaritet, snabbt placeras S. cerevisiae i korsningen av biofilm biologi och signaltransduktion forskning. 11-20 Därför blev differentiering av jästceller till långa, lim, pseudohyphal filament en bekväm avläsning för aktivering av signaltransduktionsvägar på olika miljöförändringar. Det är dock filamentation en komplex samling av fenotyper, vilket gör testmetoder för det som om det vore en enkel fenotyp missvisande. Under det senaste decenniet har flera analyser framgångsrikt antogs från bakteriell biofilm studier till jäst forskning, såsom analyser MAT bildningen för att mäta koloni sprids på mjuk agar och kristallviolett färgning för att kvantitativt mäta cellytan följsamhet. 12, 21 Däremot har det skett en viss förvirring i analyser utvecklats för att kvalitativt bedöma lim och invasiva fenotyper av jäst i agar. Här presenterar vi en enkel och tillförlitlig metod för att beräkna lim och invasiva kvalitet jäststammar med lätt att förstå steg för att isolera vidhäftning bedömningen från invasion bedömning. Vår metod, som antogs från tidigare studier, 10, 16 innebär att växande celler i flytande media och bordläggning på differentiell näringsämnen förutsättningar för tillväxt av stora fläckar, som vi sedan tvätta med vatten för att bedöma vidhäftning och gnugga cellerna helt bort agarytan att bedöma invasion i agarn. Vi eliminera behovet av strimmor celler på agar, vilket påverkar invasion av celler i agar. I allmänhet noterade vi att haploida stammar som invaderar agar alltid lim, men inte alla lim stammar kan invadera agarsubstratet. Vår strategi kan användas tillsammans med andra analyser att noggrant dissekera den differentiering steg och krav av jäst signaltransduktion, differentiering, quorum sensing och biofilm bildas.
Protocol
- Sätt 200ul av växande kulturer av ränta på syntetiska material tallrikar med erforderlig svält villkoren (SC med 2% glukos jämfört med SC med 0,2% glukos, till exempel) Om tätheten av kulturer är alltför olika varandra, justera celler per 200ul kultur så varje droppe har ungefär samma mängd celler.
- Se till att föra register över vilka droppe på plattorna som är kultur.
- Håll glänt plattan locket och lämna antingen i rumstemperatur eller vid 30 ° C tills droppar är torra.
- Täta plattor med parafilm och plastfolie (tillval) och åka 30 ° C i 3-7 dagar.
- Dokument tillväxten av celler på plattor (genom att skanna, ta en digital bild, etc)
- Tvätta cellerna bort av agar ytan med högtryck vatten (helst DI-vatten) i cirka en minut att ta hand om agar inte lyfta och byta inriktning.
- Bli av med överflödigt vatten genom att trycka plattor på hushållspapper och lämnar dem öppna för att torka.
- När plattorna är torra dokument vidhäftning på varje platta (genom att skanna eller ta digitala bilder)
- Med handskar finger, försiktigt gnugga bort celler bildar agarytan under rinnande vatten i ungefär en minut.
- Torka plattorna som tidigare.
- Om du använder en dissekera omfattning, dra bort nålen innan du lägger plattorna mot ett mikroskop plattform.
- Dokument invasion med 10x eller 40x förstoring. Se till att fokusera på den mellersta delen av varje cirkel, för att kanterna blir för trångt för att se enskild cell morfologier. Kanterna kan indikera nivån av fintrådiga tillväxt och kan dokumenteras för framtida referens. Skanna eller ta en digital bild av hela plattan kan också vara till hjälp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jästceller visa olika differentiering lägen beroende på tillgången på näringsämnen och miljöförhållanden, inklusive sporer bildas i svält och stress, filamentation under olika näringsämnen påfrestningar och flockning. Olika jäst, inklusive S. cerevisiae och C. albicans kan också hittas i biofilmer som bildas av en mångfald av mikroorganismer. Även om det finns någon korrelation med filamentation och invasiva beteende är det inte klart exakt hur filamentation kan orsaka invasion och kolonisering av ytor och vävnader. Jäst kan säkert finnas i både vegetativa och fintrådiga former i biofilm i naturen samt ställen där de hotar människors hälsa, till exempel katetrar och infekterade mänskliga organ. 10-13 För att förstå de signalvägar som används av jäst att smitta djur och delta i skadliga och nyttiga biofilmer, måste vi utveckla tillgängliga och tillförlitliga analyser. Här har vi utvecklat ett test, adopterad från redan existerande vidhäftning och analyser invasion tillgängliga för jäst, vilket tillåter oss att kvalitativt bestämma lim och invasiva fenotyper av jäststammar och mutanter i olika miljöer. Analysen som presenteras här eliminerar kravet på strimmor jästceller på agar, där enbart effekten av strimmor i agarytan ändrar invasiva och vidhäftningsförmåga av jäst. Digital bildbehandling av särskilt de invaderande celler genom ett mikroskop tillåter semikvantitativ bedömning av graden av invasionen och vidhäftning. En sådan upptäckt av invasiva och lim celler är gratis de enda cell agar invasion analys som utvecklats av Sprague lab 9 och kan anpassas för att göra experiment halvfart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Lisa Schneper och Katrin Duevel för sina insikter i utvecklingen av denna analys.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
