Dosage de l'adhésion et l'invasion Agar chez S. cerevisiae

Summary

Nous décrivons un test qualitatif pour l'adhésion de la levure et l'invasion d'agar comme une mesure de la différenciation invasive et pseudohyphal. Ce test simple peut être utilisé pour évaluer le phénotype invasif de divers mutants ainsi que les indices des effets environnementaux et les voies de signalisation sur la différenciation des levures.

Abstract

Les levures sont trouvés dans des biofilms naturels, où de nombreux microorganismes colonisent les surfaces. Dans les milieux artificiels, tels que les surfaces des objets artificiels, les biofilms peuvent réduire la productivité industrielle, détruire les structures, et menacent la vie humaine. 1-3 sur l'autre côté, en exploitant la puissance des biofilms peuvent aider à nettoyer l'environnement et générer de l'énergie durable. 4-8 La capacité de S. cerevisiae à coloniser les surfaces et de participer à des biofilms complexes a été largement ignorée jusqu'à ce que la redécouverte de la différenciation des programmes déclenchés par diverses voies de signalisation et les signaux environnementaux dans cet organisme. 9, 10 L'intérêt continue en utilisant S. cerevisiae comme organisme modèle pour comprendre l'interaction et de convergence des voies de signalisation, tels que le Ras-PKA, Kss1 MAPK et Hog1 voies osmolarité, rapidement placé S. cerevisiae dans la jonction du biofilm biologie et la recherche de transduction du signal. 11-20 à cette fin, la différenciation des cellules de levure en longues adhésif, filaments pseudohyphal est devenu une lecture commode pour l'activation des voies de transduction du signal lors de différents changements de l'environnement. Toutefois, la filamentation est un ensemble complexe de phénotypes, ce qui rend dosant pour elle comme si elle était un phénotype simples trompeuse. Dans la dernière décennie, plusieurs tests ont été adoptées avec succès des études de biofilm bactérien à la recherche de levures, telles que la formation des dosages MAT pour mesurer la propagation des colonies sur agar mou et coloration au cristal violet à mesurer quantitativement l'adhérence à la surface cellulaire. 12, 21 Cependant, il ya eu une certaine confusion dans les analyses développées pour évaluer qualitativement les phénotypes adhésif et envahissante de la levure dans l'agar. Ici, nous présentons une méthode simple et fiable pour évaluer la qualité adhésive et envahissantes de souches de levure faciles à comprendre des mesures pour isoler l'évaluation de l'adhérence de l'évaluation d'invasion. Notre méthode, adoptée par les études précédentes, 10, 16 implique des cellules en croissance dans des milieux liquides et le placage sur le traitement différencié des conditions de nutriments pour la croissance des grandes taches, que nous avons ensuite laver à l'eau pour évaluer l'adhérence des cellules et frottez complètement hors de la surface de la gélose pour évaluer l'invasion dans l'agar-agar. Nous éliminons le besoin de stries sur gélose cellules, ce qui affecte l'invasion des cellules dans la gélose. En général, nous avons observé que les souches haploïdes qui envahissent agar sont toujours adhésif, mais pas toutes les souches adhésive peut envahir gélose. Notre approche peut être utilisée en conjonction avec d'autres dosages soigneusement disséquer les étapes de différenciation et les exigences de la transduction du signal de la levure, la différenciation, le quorum sensing et la formation de biofilm.

Protocol

1. Mettez 200ul de cultures de plus en plus d'intérêt sur les plaques supports synthétiques avec les conditions de famine requis (SC avec 2% de glucose par rapport SC avec 0,2% de glucose, par exemple) Si la densité des cultures sont trop différentes les unes des autres, d'ajuster le nombre de cellules par culture 200ul de sorte que chaque goutte a à peu près la même quantité de cellules.
2. Assurez-vous de tenir des registres de qui tombent sur les plaques est où la culture.
3. Gardez le couvercle de la plaque entrouverte et laisser soit à température ambiante ou à 30 ° C jusqu'à ce que des gouttes sont à sec.
4. Sceau plaques avec du parafilm et pellicule plastique (facultatif) et laisser à 30 ° C pendant 3-7 jours.
5. Document de la croissance des cellules sur des plaques (par balayage, de prendre une photo numérique, etc)
6. Laver les cellules hors de la surface de la gélose avec de l'eau à haute pression (de préférence de l'eau DI) pendant environ une minute en prenant soin de ne pas lever agar et le changement d'orientation.
7. Débarrassez-vous de l'excès d'eau en tapant plaques sur du papier absorbant et les laisser ouvertes pour sécher.
8. Une fois les plaques sont sèches documents d'adhérence sur chaque assiette (par numérisation ou de prendre des photos numériques)
9. Cellules avec un doigt ganté, frottez doucement hors forment la surface de l'agar sous l'eau courante pendant environ une minute.
10. Sécher les plaques comme avant.
11. Si vous utilisez un champ de dissection, retirer l'aiguille avant de placer les plaques sur la plateforme de microscopie.
12. L'invasion de documents avec un grossissement de 10x ou 40x. Assurez-vous de se concentrer sur la partie du milieu de chaque cercle, les bords seront trop de monde pour voir les morphologies des cellules individuelles. Les bords peuvent indiquer le niveau de croissance filamenteuse et peuvent être documentées pour référence future. Numérisation ou de prendre une photo numérique de toute la plaque peut également être utile.

Discussion

Les cellules de levure modes d'affichage différents de différenciation en fonction de la disponibilité des nutriments et des conditions environnementales, y compris la formation de spores dans des conditions de famine et le stress, la filamentation sous diverses contraintes en éléments nutritifs, et de floculation. Levures différentes, y compris S. cerevisiae et C. albicans, peuvent également être trouvés dans les biofilms formés par un ensemble diversifié de micro-organismes. Bien qu'il y ait une certaine corrélation avec la filamentation et comportement envahissant, il n'est pas clair exactement comment filamentation pourrait causer l'invasion et la colonisation des surfaces et des tissus. La levure peut certainement être trouvée dans les deux formes végétatives et filamenteuses dans les biofilms dans la nature ainsi que les endroits où ils menacent la santé humaine, tels que des cathéters et des organes humains infectés. 10-13 Afin de comprendre les voies de signalisation utilisés par les levures pour infecter des animaux et de participer à des biofilms nuisibles et bénéfiques, nous devons développer des tests fiables et accessibles. Ici, nous avons développé un essai, adoptée par l'adhésion déjà existants et les tests disponibles pour l'invasion de la levure, ce qui nous permettra de déterminer qualitativement les phénotypes adhésives et invasives des souches de levures et de mutants dans différentes conditions. Le test présenté ici élimine l'obligation pour les stries des cellules de levure sur la gélose, où la seule action des stries sur la surface de l'agar change les qualités adhésives invasive et de la levure. L'imagerie numérique en particulier celle des cellules envahir par un microscope permet d'évaluation semi-quantitative du degré d'invasion et d'adhérence. Cette détection de cellules invasives et de l'adhésif est gratuit le dosage seule l'invasion des cellules agar développé par le laboratoire Sprague 9 et peut être adapté pour faire des expériences bien sûr du temps.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Moticam 350	Camera	Motic	discontinued (new model: Moticam 352)	A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.