Summary
우리는 침략과 pseudohyphal 차별화의 수단으로 효모 접착 및 한천 침공에 대한 질적 분석을 설명합니다. 이 간단한 분석은 다양한 돌연변이의 침략 표현형뿐만 아니라 효과 환경 단서를 평가하고 효모 차별에 대한 경로를 신호하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
효모는 많은 미생물이 표면을 식민지 자연 biofilms에서 찾을 수 있습니다. 같은 사람이 만든 개체의 표면과 같은 인공 환경에서는, biofilms는 산업 생산성을 줄이고 구조를 파괴하고, 인간의 생명을 위협하실 수 있습니다. 반면에 1-3, harnessing biofilms의 전원 환경을 청소하고 지속 가능한 에너지를 생성할 수 있습니다. 표면을 식민지 복잡한 biofilms에 참여 S. cerevisiae의 4-8의 능력은 주로이 생물의 다양한 신호 경로 및 환경 신호에 의해 트리거 차별화 프로그램의 재발견까지 무시되었습니다. 9, 10 빠르게 biofilm의 교차점에서 S.의 cerevisiae를 배치 등 라스 - PKA, Kss1 MAPK 및 Hog1 osmolarity 경로로 신호 통로,의 상호 작용과 융합을 이해하는 모델 생물로 S.의 cerevisiae를 사용하여 지속적인 관심을 생물학 및 신호 전달 연구. 이를 위해 11-20, 긴, 접착제, pseudohyphal 필라멘트로 효모 세포의 분화는 다양한 환경 변화에 따라 신호 전달 경로의 활성화를위한 편리한 판독되었다. 그러나, filamentation는 오해의 소지가있는 간단한 표현형 것처럼 그것을 시금하게 phenotypes의 복잡한 모음입니다. 지난 10 년간 여러 assays가 성공적으로 이러한 양적 세포 - 표면 부착을 측정하는 소프트 한천 및 크리스탈 바이올렛 얼룩에 콜로니 확산을 측정하는 매트 형성 assays 같은 효모 연구에 세균 biofilm 연구에서 채택되었다. 12 21 단, 질적 한천에서 효모의 접착제 및 침입 phenotypes을 평가하기 위해 개발 assays에 약간의 혼동이있었습니다. 여기, 우리는 침략 평가에서 접착 평가를 분리하는 단계를 이해하기 쉽게와 효모 종자의 접착제 및 침입 품질을 평가하기위한 단순하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다. 이전 연구, 10, 16에서 채택된 우리의 방법은 우리가 다음 접착력을 평가하기 위해 물로 씻고으로 침략을 평가하기 위해 한천 표면에서 완전히 세포를 문질러 큰 반점의 성장을위한 차동 영양 조건에 액체 미디어와 도금의 성장 세포를 포함 한천. 우리는 한천으로 세포의 침공에 영향을 한천에 세포를 줄이 필요를 제거합니다. 일반적으로, 우리는 한천를 침략 haploid 종자 항상 접착제 있으며, 아직 모든 접착제 종자는 한천 배지에 침입할 수 있다고 보여집니다. 우리의 접근 방식은 신중하게 효모 신호 전달, 차별화, 정족수 감지 및 biofilm 형성의 분화 단계와 요구 사항을 해부하다 다른 assays와 함께 사용할 수 있습니다.
Protocol
- 문화의 밀도가 서로 너무 다른 경우에 필요한 기아 조건 (0.2 % 포도당과 SC 대비 2 % 포도당과 SC, 예를 들어)와 합성 미디어 접시에 관심을 성장 문화 200ul 넣고, 200ul 문화마다 셀 수를 조정 따라서 각각의 드롭은 대략 세포의 동일한 금액있다.
- 문화는 접시에있는 드롭의 기록을 보관해야합니다.
- 방울이 건조 때까지 판 덮개 열려 유지하고 실내 온도 또는 30 중 하나두고 ° C.
- 시일 parafilm 및 플라스틱 포장 (선택 사항)와 함께 접시 및 3-7일 30 ° C에서 두십시오.
- (디지털 사진 등 복용, 검색하여) 접시에 세포의 성장을 문서
- 방향을 리프트 및 변경하지 한천에 대한 간병에 대해 잠시 고압 물 (DI 선호 물)와 한천 표면의 세포를 씻으십시오.
- 종이 타올에 번호판을 감청하고 건조에 열어두고으로 초과하는 물을 제거하십시오.
- 일단 접시 각 접시에 건조 문서 접착 (디지털 사진을 스캔하거나 복용에 의해)입니다
- 장갑 낀 손가락으로 부드럽게 옮겨 세포에 대해 잠시 동안 실행 물 아래에있는 한천 표면을 형성합니다.
- 이전처럼 번호판을 건조.
- 해부 범위를 사용하는 경우, 현미경 플랫폼에 번호판을 배치하기 전에 바늘을 제거합니다.
- 10X 또는 40x 배율로 문서 침공. 가장자리 너무 개별 셀 morphologies을 볼 붐비는 것입니다 각 써클의 중간 부분에 초점을 확인하십시오. 가장자리 filamentous 성장의 수준을 나타낼 수 있으며 나중에 참조할 수 있도록 문서화 수 있습니다. 스캔 또는 전체 접시의 디지털 사진을 찍을 때하면 도움이 될 수 있습니다.
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Discussion
효모 세포가 기아와 스트레스 상황, 각종 영양 스트레스하에 filamentation 및 응집에 따라 포자 형성을 포함하여 양분 가용성 및 환경 조건에 따라 다양한 차별 모드를 표시합니다. S. cerevisiae의 C. albicans와 등 다양한 효모는, 또한 미생물의 다양한 세트로 구성된 biofilms에서 찾을 수 있습니다. filamentation 및 침입 행동과 어떤 상관 관계가있다지만, 그것은 filamentation는 침략과 표면과 조직의 식민지가 발생할 수 있습니다 정확히 얼마나 명확하지 않습니다. 효모는 확실히 이러한 카테터 및 감염된 인간의 장기와 같은 식물과 filamentous 자연 biofilms의 양식뿐만 아니라 그들은 인간의 건강을 위협하는 장소 모두에서 찾을 수 있습니다. 10-13 동물을 감염과 유해하고 유익한 biofilms에 참여하는 효모에 의해 이용 신호 경로를 이해하기 위해서는, 우리는 접근하고 안정적인 assays을 개발해야합니다. 여기 우리는 우리가 질적으로 다양한 조건에서 효모 종자 및 돌연변이의 접착제 및 침입 phenotypes을 확인할 수 있도록 기존 접착 및 효모를 사용할 수 침공 assays에서 채택 분석을 개발했습니다. 여기에 제시 분석은 한천 표면을 줄이의 단순한 작업이 효모의 침략과 접착 특성을 변경 한천,에 효모 세포를 줄이에 대한 요구 사항을 제거합니다. 현미경에 의해 특히 침입 세포의 디지털 이미징은 침략과 유착의 정도의 세미 양적 평가 수 있습니다. 침투성과 접착 세포의 이러한 감지는 무료 단세포 한천 침공 분석 스프 라그 실험실 9 개발 시간 코스 실험을 수행하는 적응 수있다.
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Acknowledgments
우리는이 분석을 개발하고 그들의 통찰력에 대한 리사 Schneper와 카트린 Duevel 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
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