Summary
Biz invaziv ve pseudohyphal farklılaşması bir önlem olarak maya yapışma ve agar işgali için kalitatif bir testtir açıklar. Bu basit testi çeşitli mutant gibi invaziv fenotip etkileri çevresel ipuçlarını değerlendirmek ve maya farklılaşma sinyalizasyon yollar kullanılabilir.
Abstract
Mayalar, birçok mikroorganizma yüzeylerde kolonize doğal biyofilm, bulunur. Yapay ortamlarda, insan yapımı nesnelerin yüzeyler gibi, biyofilm, endüstriyel verimlilik azaltmak yapıları yok ve insan hayatını tehdit. Öte yandan 1-3, donanımımızı biyofilm, güç, çevreyi temiz ve sürdürülebilir enerji üretmek yardımcı olabilir. Yüzeylerde kolonize ve karmaşık biyofilm katılmak S. cerevisiae 4-8 yeteneği, çoğunlukla bu organizmada çeşitli sinyal yollar ve çevre ipuçları tarafından tetiklenen farklılaşma programları yeniden keşfedilmesini kadar göz ardı edildi. 9, 10, Ras-PKA, Kss1 MAPK ve Hog1 ozmolarite yollar gibi hızlı biyofilm birleşme S. cerevisiae yerleştirilen sinyalizasyon yolları, etkileşim ve yakınsama anlamak için bir model organizma olarak S. cerevisiae kullanarak sürekli ilgi biyoloji ve sinyal iletimi araştırma. Bu amaçla 11-20, uzun, yapıştırıcı, pseudohyphal filamentler maya hücreleri farklılaşma çeşitli çevresel değişikliklere bağlı sinyal iletim yollarının aktivasyonu için uygun bir okuma oldu. Ancak, filamentasyonu yanıltıcı basit bir fenotip sanki assaying yapar fenotipleri, karmaşık bir koleksiyon. Geçtiğimiz on yılda, birkaç testleri başarıyla, kantitatif hücre yüzey yapışmasını ölçmek için yumuşak agar ve kristal viyole boyama koloni yayılmasını ölçmek için MAT oluşumu deneyleri gibi maya araştırma, bakteriyel biyofilm çalışmaları kabul edildi. 12, 21 Ancak, agar maya yapışkan ve invaziv fenotipleri niteliksel olarak değerlendirmek için geliştirilen testlerin bazı karışıklıklar oldu. Burada, anlaşılması kolay işgali değerlendirme yapışma değerlendirmesi izole etmek için adımlar maya suşlarının yapışkan ve invaziv kalitesini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir yöntem mevcut. Önceki çalışmalarda, 10, 16 benimsenen yöntem, sıvı ortam ve kaplama, biz o yapışma değerlendirmek için su ile yıkayın ve içine işgali değerlendirmek için agar yüzeyinden tamamen hücreleri ovmak büyük lekeler, büyüme için diferansiyel besin koşullarına büyüyen hücreler içerir. agar. Biz, agar hücre işgali etkiler agara hücreleri şeritli için ihtiyacı ortadan kaldırır. Genel olarak, agar istila haploid suşlar her zaman yapıştırıcı, henüz tüm yapışkan suşları agar işgal ettiği görülmektedir. Bizim yaklaşımımız, maya sinyal iletimi, farklılaşma, yeter algılama ve biyofilm oluşumu farklılaşma adımları ve şartları dikkatli bir şekilde incelemek için diğer testleri ile birlikte kullanılabilir.
Protocol
- 200ul kültür başına hücre sayımı ayarlamak gerekli açlık koşulları (SC karşı% 0.2 glukoz ile% 2 glukoz SC, örneğin) ile sentetik medya plakalar üzerinde ilgi büyüyen kültürlerin 200ul koyun, kültürleri yoğunluğu birbirinden çok farklı ise, her damla kabaca aynı miktarda hücre vardır.
- Kültürdür plakalar üzerine damla kayıtlarını tutmak için emin olun.
- Damla kuruyana kadar plaka kapağı aralık bırakın tutun ve ya terk oda sıcaklığında veya 30 ° C.
- Mühür parafilm ve plastik ambalaj malzemesi ile (isteğe bağlı) ile plakaları ve 3-7 gün süreyle 30 ° C bırakın.
- (Dijital fotoğraf, vb. Alarak, tarama) plakalar hücrelerinin büyüme Belge
- Yönünü asansör ve değiştirmek için agar özen Yaklaşık bir dakika için yüksek basınçlı su (tercihen DI su) ile agar yüzeyinin hücreleri yıkayın.
- Aşırı su, kağıt havlu plakaları dokunarak ve kuruması için açık bırakarak kurtulun.
- Sonra plakaları her bir plaka üzerinde kuru belge yapışma (tarama veya dijital fotoğraf alarak )
- Eldivenli bir parmak ile hafifçe ovmak hücreleri agar yüzeyinden yaklaşık bir dakika boyunca akan suyun altında oluşturur.
- Daha önce olduğu gibi plakalar kurulayın.
- Diseksiyon kapsamı kullanarak, mikroskop platformu üzerine plaka yerleştirmeden önce iğneyi çıkarın.
- 10x veya 40x büyütme Belge işgali. Kenarları çok bireysel hücre morfolojileri görmek için kalabalık olacak, her bir dairenin orta kesiminde odaklanmak için emin olun. Kenarları ipliksi büyüme düzeyini gösterir ve ileride başvurmak için belgelenmelidir. Tarama ya da bütün plaka dijital bir resim çekmek de yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maya hücreleri, besin ve çevre koşullarına göre, açlık ve stres koşullarında, çeşitli besin zorlamaların filamentasyonu ve flokülasyon altında spor oluşumu da dahil olmak üzere çeşitli farklılaşma modları gösterir. S. cerevisiae ve C. albicans dahil olmak üzere çeşitli mayalar, aynı zamanda çeşitli bir dizi mikroorganizmaların oluşturduğu biyofilm içinde bulunabilir. Filamentasyonu ve invaziv davranış bazı korelasyon olmasına rağmen, bu filamentasyonu işgali ve kolonizasyonu yüzeyler ve dokular neden olabilir tam olarak ne kadar açık değildir. Maya, kateterler ve enfekte insan organları gibi bitkisel ve ipliksi doğada biyofilm biçimlerinin yanı sıra, insan sağlığını tehdit eden yerlerde, her ikisi de kesinlikle bulunabilir. 10-13, hayvanları ve zararlı ve yararlı biyofilm katılmak için mayalar tarafından kullanılan sinyalizasyon yollar anlamak için, ulaşılabilir ve güvenilir testlerin geliştirilmesi gerekir. Burada bize niteliksel çeşitli koşullarda maya suşları ve mutantlar yapışkan ve invaziv fenotipleri belirlemek için izin mevcut yapışma ve maya işgali deneyleri kabul edilen bir test, geliştirdik. Burada sunulan testi, agar agar yüzeyine bulaşması, sadece eylem maya, invaziv ve yapışkan nitelikleri değişiklikler üzerine maya hücreleri şeritli için gereksinimini ortadan kaldırır. Işgali ve yapışma derecesi yarı-kantitatif değerlendirme için özellikle mikroskop tarafından istila hücreleri Dijital görüntüleme sağlar. Böyle bir algılama invaziv ve yapışkan hücreleri tek bir hücre ücretsiz agar işgali tahlil Sprague laboratuar 9 tarafından geliştirilen ve zaman ders deneyler yapmak için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu testte gelişmekte olan anlayışlar Lisa Schneper ve Katrin Duevel teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
