筋肉損傷のリスクを低減したマウスにおける用量調整されたレジスタンストレーニング
Summary
本プロトコルは、マウスなどの小動物で行われる精密リハビリテーション研究に組み込むことができる、用量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれる独自の技術について説明しています。
Abstract
漸進的レジスタンストレーニング(PRT)は、徐々に大きな外部負荷に対して筋肉収縮を行うことを含み、健康な個人および患者集団の筋肉量と筋力を増加させる可能性があります。小動物および大型動物のモデルに関する前臨床試験では、筋肉量と筋力を維持および/または回復するためのPRTの安全性と有効性をテストするための精密リハビリテーションツールが必要です。この記事で説明されているPRT方法論とデバイスを使用して、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)を実行できます。DARTデバイスは、マウスの足首背屈筋によって生成される同心円収縮トルクを客観的に評価するためのスタンドアロンダイナモメータとして使用することも、既存の等速性ダイナモメトリーシステムに追加することもできます。DARTデバイスは、この作業で提供される指示とオープンソースの3Dプリントファイルに基づいて、標準の3Dプリンターで製造できます。この記事では、四肢帯筋ジストロフィー2B/R2型(BLAJマウス)のマウスモデルにおいて、DARTの1回の発作によって引き起こされる収縮誘発性筋肉損傷と、同等の等尺性収縮(ISOM)によって引き起こされる筋肉損傷を比較する研究のワークフローについても説明します。8匹のBLAJマウス(各条件に4匹)のデータから、前脛骨筋(TA)の10%未満がDARTまたはISOMの1回の発作で損傷を受け、DARTはISOMよりも損傷が少ないことが示唆されています。
Introduction
運動は骨格筋に多くの健康上の利点をもたらします(Vina et al.1でレビューされています)。具体的には、漸進的に大きな外部負荷(バーベル、ダンベル、ケーブルプーリーウェイト回路など)に対して筋肉収縮を行うことを含むプログレッシブレジスタンストレーニング(PRT)は、健康な個人と患者集団の両方で筋肉量と筋力を増加させるのに役立つことが知られています(以前の出版物でレビュー2,3).PRTは過負荷原理に基づいており、筋肉が徐々に大きな外部負荷に対して収縮すると、生理学的断面積と力を生み出す能力を増やすことによって適応すると述べています4。げっ歯類におけるPRTの既存のモデルには、尾に抵抗を加えたはしご登り、アンタゴニストからの抵抗に対するアゴニスト筋の共収縮、加重ハーネスでの走行、電気ショックによって引き起こされるしゃがむ運動、および抵抗された車輪走行が含まれます5,6,7,8,9,10(以前の出版物でレビュー11,12).しかし、現在、ヒトの臨床研究および実践で使用されるPRTの方法およびデバイスによく似た、マウスで筋肉を標的とし、投与量を調整したPRTを正確に実行するための研究ツールはありません12,13。これは、マウスの基礎および前臨床試験において正確に投与されたPRTの安全性および有効性を研究する研究者の能力を制限する。
この障壁を克服するために、この研究では、現代の体育館のレジスタンストレーニング機器で採用されているケーブルプーリーウェイト回路設計に基づいて、PRT方法論とデバイスを開発します14,15,16。PRTのこの方法は、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれ、デバイスはDARTデバイスと呼ばれます。精密リハビリテーショントレーニングツールとしての機能に加えて、DARTデバイスは、マウスの前脛骨筋(TA)によって生成される可能性のある最大同心円収縮トルクを客観的に評価するためのスタンドアロン機器としても使用でき、1回の繰り返しの最大(1RM、良好なフォームを維持しながら1回だけ正常に持ち上げ/移動/押圧/しゃがむことができる最大負荷)が人間で評価される方法と同様に17、18.DARTデバイスは、カスタムビルドまたは市販の等速性ダイナモメータと組み合わせて、マウスのTA筋肉によって生成されるピーク等尺性テタニック力(ヒトの最大随意収縮[MVC]に匹敵)を測定し、ピーク破傷風力(例えば、ピーク力の50%)に基づく抵抗で用量調整PRTを実行することもできる。
この記事では、DARTデバイスの構造について説明し、収縮トルクを評価してDARTを実行するために、以前の出版物19、20、21、22に記載されているカスタムビルドの動力計と組み合わせる方法について説明します。この研究では、DARTデバイスを使用して、DARTの1回の発作(50%1RMの同心円状に偏った収縮の4セット)によって引き起こされる運動誘発性筋肉損傷と、等尺性収縮の同等の発作(4セットの10等尺性収縮)によって引き起こされる損傷を比較する方法についても説明します 四肢帯筋ジストロフィー2B型(LGMD2B、 またはLGMDR2)23,24。研究されたマウスモデルには、有害な偏心収縮後の遅発性筋肉損傷から骨格筋を保護するのに重要な役割を果たすジスフェリンと呼ばれるタンパク質が欠けています22,25,26,27,28,29,30.また、ジスフェリン欠損の雄マウスでは、同心円状に偏った強制運動は偏心的に偏った強制運動ほど有害ではなく、同心円状に偏ったトレーニングへの以前の曝露が、その後の偏心偏った収縮の発作からの損傷に対する保護を提供することが実証されています22。現在の研究は、用量調整された同心円状に偏ったレジスタンストレーニングを実行する際の現在のDART方法論とデバイスの実現可能性をテストするために実施されたため、DARTデバイスからの新しいデータを以前のデータと比較するための調査のためにオスのジスフェリン欠損マウスが選択されました。将来の研究では、雌のBLAJマウスが生物学的変数としての性別の影響を研究するために含まれます DARTへの反応に関連して。すでに多くの筋肉群にジストロフィー変化があり、すでに筋力低下と消耗があり、筋肉量と筋力を維持するためのリハビリテーションケアを求めている患者の筋肉がいる可能性のある病態生理学的状態をモデル化しているため、~1.5歳のマウスが研究されました26。
Protocol
この記事に記載されている実験は、実験動物の世話と使用のためのガイド(1996年、National Academy Press、2101 Constitution Ave. NW、Washington、DC 20055、USA)に従って、米国ミシガン州デトロイトのウェイン州立大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。B6.LGMD2B/R2をモデルとしたA-Dysfprmd/GeneJマウス(別名BLAJマウス、雄、~1.5歳)を本研究に用いた。マウスは市販の供給源から…
Representative Results
BLAJの雄マウス(1~1.5歳)を研究した。BLAJマウスは、ヒトの筋肉疾患LGMD2B / R2をモデル化しています。これらのマウスは、偏心筋収縮の単回発作からの遅発性筋肉損傷に特に感受性である22、29。したがって、BLAJマウスは、TA筋が同心円状に偏った方法で働かなければならない抵抗を正確に調整することによって、DARTが無害な方法で実行できるかどうか?…
Discussion
この記事では、投与量調整レジスタンストレーニング(DART)と呼ばれる一種の精密リハビリテーショントレーニングを実行するためのデバイスを構築する方法について、段階的な手順を説明します。この研究では、DARTの1回の発作の3日後の筋肉損傷(DARTグループ)と同等の等尺性トレーニングの3日後の損傷(ISOMグループ)を比較するためのトレーニング研究におけるDARTデバイスと方法論の適用に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Jain Foundation Inc.からの助成金、NICHDからのR03HD091648、NIH P2CHD086843に基づくAR3Tからのパイロット助成金、ウェイン州立大学のEACPHSからのFRAP賞、ウェイン州立大学の教員スタートアップパッケージ、および1R01AR079884-01(Peter L. Jones PI)からJARへの下請け契約によって資金提供されました。この研究は、JMB、MEP、およびJARに対する米国理学療法士協会-ミシガン(APTA-MI)の研究助成金からも資金提供されました。著者らは、レヌカ・ローチ博士(ミシガン州イースタンミシガン大学准教授)が原稿を批判的に読み、フィードバックを提供してくれたことを認めています。著者らは、3Dプリンティングに関するアドバイスを提供してくれたAnselm D. Motha氏を認めています。著者らは、https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories ジャイナ教財団のウェブサイトでストーリーを共有してくれたジスフェリノパチーの患者、特に運動の経験に感謝します。
Materials
| AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing | Anmiao Star (N/A) | AMS127 | High precision, low friction wheel bearing. If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter, 22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice. Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions. |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. | Stock #012767 | Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2. |
| Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | BS4 50–6824 | Electrode for NMES. If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives. |
| Coplin Staining Dish | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. S17495 | Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections |
| Cura 4.4.1. Software | Ultimaker, Utrecht, Netherlands | Ultimaker Cura 4.4.1. | Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| Eosin Y | Millipore Sigma (Burlington, MA) | HT110132-1L | Pink cytoplasmic stain |
| Gorilla Super Glue | The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) | Gorilla Super Glue Micro Precise | Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components |
| Hematoxylin solution, Gill No.3 | Millipore Sigma (Burlington, MA) | GHS332-1L | Dark blue stain for nuclei |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. 06-666. Manufacturer #34120 | Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes. |
| Labview 2014 | National Instruments, Austin, Texas, USA | Labview 2014 | Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator. |
| Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks | ThermoFisher (Waltham, MA) | S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMD | Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue |
| Magic depilatory cream | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| Metal alligator clip | JINSHANGTOPK (web-based business) | 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps | Spring clamp to hold tibial pin |
| Micrscope slides | Globe Scientific (Mahwah, NJ) | 1354W. Diamond White Glass Slides | Charged microscope slides |
| Mineral Oil | ThermoFisher (Waltham, MA) | BP26291 | Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing |
| Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | #11778 | Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. This is the material used to 3D print device components. |
| Monoprice Select Mini V2 3D printer | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | Mini V2 3D | 3D printer for computer-aided fabrication of device components. |
| NIH Image software | National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) | NIH Image for Windows | Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage. NIH Image is also known as Image J. |
| Photoshop CS4 | Adobe (San Jose, CA) | Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows | Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields |
| PSIU6 stimulation isolation unit | Grass Instruments (West Warwick, RI) | PSIU6 isolation unit | Isolation unit for NMES. Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit |
| Roboz 4-0 silk black braided suture material | Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) | Roboz Surgical SUT152 | Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training |
| S48 square pulse stimulator | Grass Instruments (West Warwick, RI) | S48 Stimulator | Laboratory electrical stimulator for NMES . If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative. Please contact co-author Jones for more information. |
| Scott’s bluing reagent | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | 6697-32 | Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining |
| SigmaStat version 3.5 | Systat Software (San Jose, CA) | SigmaStat version 3.5 | Statistical software package for statistical analyses |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled tabletop anesthesia system |
| Triple antibiotic first aid ointment | Global Health Products (wed-based business) | Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment | Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care |
References
- Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
- Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
- Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H., Chandler, T. J., Brown, L. E. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. , 547-570 (2019).
- Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
- Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
- Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
- Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
- Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
- Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
- Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 39-59 (2022).
- Roche, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 61-84 (2022).
- Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
- . Dr. Gustav Zander’s Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child’s Play Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016)
- Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
- ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
- Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
- Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , (2012).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
- Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
- Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
- Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies – Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
- . DYSFERLIN Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021)
- Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
- Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
- Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
- Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
- Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
- Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
- Dutton, M. . Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , 238 (2011).
- Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
- Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist’s guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
- Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
- Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers – A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
- Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
- Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
- Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
- Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
- Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
- . Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation – Inaugural Scientific Retreat Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021)
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).
Cite This Article
Begam, M., Narayan, N., Mankowski, D., Camaj, R., Murphy, N., Roseni, K., Pepin, M. E., Blackmer, J. M., Jones, T. I., Roche, J. A. Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage. J. Vis. Exp. (186), e64000, doi:10.3791/64000 (2022).