توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة
Summary
في عصر العلاج المناعي للسرطان ، زاد الاهتمام بتوضيح ديناميكيات البيئة الدقيقة للورم بشكل ملحوظ. يفصل هذا البروتوكول تقنية تصوير مطياف الكتلة فيما يتعلق بخطوات التلطيخ والتصوير ، والتي تسمح بالتحليل المكاني المتعدد الإرسال للغاية.
Abstract
لقد أحدث التقدم في العلاجات القائمة على المناعة ثورة في علاج السرطان وأبحاثه. وقد أدى ذلك إلى تزايد الطلب على توصيف المشهد المناعي للورم. على الرغم من أن الكيمياء النسيجية المناعية القياسية مناسبة لدراسة بنية الأنسجة ، إلا أنها تقتصر على تحليل عدد صغير من العلامات. على العكس من ذلك ، يمكن لتقنيات مثل قياس التدفق الخلوي تقييم علامات متعددة في وقت واحد ، على الرغم من فقدان المعلومات حول مورفولوجيا الأنسجة. في السنوات الأخيرة ، ظهرت استراتيجيات متعددة الإرسال تدمج التحليل الظاهري والمكاني كنهج شاملة لتوصيف المشهد المناعي للورم. هنا ، نناقش تقنية مبتكرة تجمع بين الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية ومطياف الكتلة الأيونية الثانوية مع التركيز على الخطوات التقنية في تطوير الفحص وتحسينه ، وإعداد الأنسجة ، والحصول على الصور ومعالجتها. قبل تلطيخ ، يجب تطوير لوحة الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية وتحسينها. يدعم نظام الصور عالي الضفيرة هذا ما يصل إلى 40 جسما مضادا موسوما بعلامات معدنية في قسم واحد من الأنسجة. وتجدر الإشارة إلى أن خطر تداخل الإشارة يزداد مع زيادة عدد العلامات المدرجة في اللوحة. بعد تصميم اللوحة ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لتعيين النظائر المعدنية للجسم المضاد لتقليل هذا التداخل. يتم إجراء اختبار اللوحة الأولي باستخدام مجموعة فرعية صغيرة من الأجسام المضادة والاختبار اللاحق للوحة بأكملها في أنسجة التحكم. يتم الحصول على أقسام الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين وتركيبها على شرائح مغلفة بالذهب وملطخة أكثر. يستغرق التلطيخ 2 أيام ويشبه إلى حد كبير تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية القياسية. بمجرد تلطيخ العينات ، يتم وضعها في أداة الحصول على الصور. يتم تحديد حقول العرض، ويتم الحصول على الصور وتحميلها وتخزينها. المرحلة الأخيرة هي إعداد الصور لتصفية وإزالة التداخل باستخدام برنامج معالجة الصور الخاص بالنظام. عيب هذه المنصة هو عدم وجود برامج تحليلية. ومع ذلك ، يتم دعم الصور التي تم إنشاؤها بواسطة برامج علم الأمراض الحسابية المختلفة.
Introduction
تعد أهمية أنواع الخلايا العديدة المحيطة بمجموعات الأورام النسيلة عنصرا حاسما في تصنيف التسرطن. وقد ازداد الاهتمام بتوضيح تكوين وتفاعلات البيئة الدقيقة للورم (TME) باستمرار بعد إنشاء العلاج القائم على المناعة كجزء من ترسانة علاج السرطان. لذلك ، تحولت استراتيجيات العلاج من نهج يركز على الورم إلى نهج يركز على TME1.
زادت الجهود المبذولة لتوضيح أدوار الخلايا المناعية في مراقبة الورم وتطور السرطان بشكل لافت للنظر في السنوات الأخيرة 2,3. في البحوث الطبية ، نشأت مجموعة كبيرة من الأساليب ، بما في ذلك الأساليب القائمة على قياس الخلايا وتقنيات التصوير أحادية البلكس والمتعددة ، كجزء من هذه المحاولة لفك رموز التفاعلات الفريدة لعناصر متعددة من TMEs.
تركز الطرق الرائدة مثل قياس التدفق الخلوي (اخترع في 1960s) ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، وقياس الخلايا الجماعية بشكل أساسي على تحديد مكونات TMEوقياسها كميا 4. على الرغم من أن التقنيات الكمية القائمة على قياس الخلايا تسمح بالتنميط الظاهري للمناظر الطبيعية المناعية ، إلا أن تحديد التوزيع المكاني الخلوي أمر مستحيل. على العكس من ذلك ، فإن طرقا مثل الكيمياء النسيجية المناعية أحادية البلكس القياسية تحافظ على بنية الأنسجة وتمكن الباحثين من تحليل التوزيع الخلوي ، على الرغم من أن انخفاض عدد الأهداف في قسم نسيج واحد هو قيد على هذه الطرق 5,6. على مدى السنوات العديدة الماضية ، ظهرت تقنيات التصوير متعددة الإرسال لدقة الخلية الواحدة مثل التألق المناعي المتعدد ، والتصوير الفلوري بالترميز الشريطي ، وقياس الطيف الكتلي التصويري كاستراتيجيات شاملة للحصول على معلومات حول تلطيخ العلامات المتزامنة باستخدام نفس قسم الأنسجة7.
نقدم هنا تقنية تجمع بين الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي وتمكن من تحديد كمية دقة الخلية الواحدة ، والتعبير المشترك للعلامة (النمط الظاهري) ، والتحليل المكاني باستخدام عينات الأنسجة الثابتة من الفورمالين ، والبارافين المدمج (FFPE) ، وعينات الأنسجة المجمدة الطازجة (FF) 8,9. عينات FFPE هي المواد الأكثر استخداما على نطاق واسع لأرشفة عينات الأنسجة وتمثل موردا متاحا بسهولة أكبر لتقنيات التصوير متعددة الإرسال من العينات المجمدة الطازجة10. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إمكانية استعادة الصور بعد أشهر. هنا ، نناقش بروتوكولات التلطيخ ومعالجة الصور باستخدام عينات أنسجة FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال التوضيح الشامل للتفاعلات المعقدة والمعقدة بين المكونات المتعددة ل TME هدفا محوريا لأبحاث السرطان. قدم المصنعون العديد من الفحوصات متعددة الإرسال كجزء من هذا الجهد ، خاصة على مدى السنوات ال 5 الماضية. التحليل المكاني متعدد الإرسال هو أداة متعددة الاستخدامات وقوية تسهل التصنيف المتز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون دون نوروود من خدمات التحرير ، ومكتبة الأبحاث الطبية في MD Anderson لتحرير هذه المقالة ومختبر التألق المناعي المتعدد وتحليل الصور في قسم علم الأمراض الجزيئية الانتقالية في MD Anderson. نتج هذا المنشور جزئيا عن بحث تم تيسيره من خلال الدعم العلمي والمالي لمراكز مراقبة وتحليل مناعة السرطان – شبكة كومنز البيانات المناعية للسرطان (CIMAC-CIDC) المقدمة من خلال اتفاقية التعاون بين المعهد الوطني للسرطان (NCI) (U24CA224285) إلى مركز جامعة تكساس إم دي أندرسون للسرطان مركز مراقبة وتحليل مناعة السرطان (CIMAC).
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
