Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina
Summary
Nell’era dell’immunoterapia del cancro, l’interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un’analisi spaziale altamente multiplexata.
Abstract
I progressi nelle terapie a base immunitaria hanno rivoluzionato il trattamento e la ricerca sul cancro. Ciò ha innescato una crescente domanda per la caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Sebbene l’immunoistochimica standard sia adatta per lo studio dell’architettura tissutale, è limitata all’analisi di un piccolo numero di marcatori. Al contrario, tecniche come la citometria a flusso possono valutare più marcatori contemporaneamente, sebbene le informazioni sulla morfologia del tessuto vengano perse. Negli ultimi anni, le strategie multiplexed che integrano l’analisi fenotipica e spaziale sono emerse come approcci completi alla caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Qui, discutiamo di una tecnologia innovativa che combina anticorpi marcati con metallo e spettrometria di massa a ioni secondari concentrandoci sulle fasi tecniche nello sviluppo e nell’ottimizzazione del test, nella preparazione dei tessuti e nell’acquisizione e nell’elaborazione delle immagini. Prima della colorazione, è necessario sviluppare e ottimizzare un pannello anticorpale marcato in metallo. Questo sistema di immagini hi-plex supporta fino a 40 anticorpi marcati con metallo in una singola sezione di tessuto. Da notare, il rischio di interferenze del segnale aumenta con il numero di marcatori inclusi nel pannello. Dopo la progettazione del pannello, è necessario prestare particolare attenzione all’assegnazione dell’isotopo metallico all’anticorpo per ridurre al minimo questa interferenza. Il panel test preliminare viene eseguito utilizzando un piccolo sottogruppo di anticorpi e il successivo test dell’intero pannello nei tessuti di controllo. Sezioni di tessuto fissate in formalina e incorporate in paraffina sono ottenute e montate su vetrini rivestiti d’oro e ulteriormente colorate. La colorazione richiede 2 giorni e ricorda da vicino la colorazione immunoistochimica standard. Una volta che i campioni sono macchiati, vengono posizionati nello strumento di acquisizione delle immagini. I campi visivi vengono selezionati e le immagini vengono acquisite, caricate e archiviate. La fase finale è la preparazione delle immagini per il filtraggio e la rimozione delle interferenze utilizzando il software di elaborazione delle immagini del sistema. Uno svantaggio di questa piattaforma è la mancanza di software analitico. Tuttavia, le immagini generate sono supportate da diversi software di patologia computazionale.
Introduction
L’importanza dei numerosi tipi di cellule che circondano le popolazioni tumorali clonali è un elemento cruciale nella categorizzazione della carcinogenesi. L’interesse nel chiarire la composizione e le interazioni di questo microambiente tumorale (TME) è aumentato continuamente in seguito all’istituzione della terapia a base immunitaria come parte dell’arsenale di trattamento del cancro. Pertanto, le strategie di trattamento sono passate da un approccio incentrato sul tumore a uno incentrato sulla TME1.
Gli sforzi per chiarire il ruolo delle cellule immunitarie nella sorveglianza del tumore e nello sviluppo del cancro sono aumentati notevolmente negli ultimi anni 2,3. Nella ricerca medica, una pletora di metodi, tra cui metodi basati sulla citometria e tecnologie di imaging singleplex e multiplex, sono sorti come parte di questo tentativo di decifrare le interazioni uniche di più elementi delle TME.
Metodi pionieristici come la citometria a flusso (inventata nel 1960), la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e la citometria di massa si concentrano principalmente sull’identificazione e la quantificazione dei componenti della TME4. Anche se le tecniche quantitative basate sulla citometria consentono la fenotipizzazione del paesaggio immunitario, determinare la distribuzione spaziale cellulare è impossibile. Al contrario, metodi come l’immunoistochimica singleplex standard preservano l’architettura tissutale e consentono ai ricercatori di analizzare la distribuzione cellulare, sebbene un numero ridotto di bersagli in una singola sezione di tessuto sia una limitazione di questi metodi 5,6. Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging multiplexed per la risoluzione di singole cellule come l’immunofluorescenza multiplex, l’imaging a fluorescenza con codice a barre e la spettrometria di massa per imaging sono emerse come strategie complete per acquisire informazioni sulla colorazione simultanea dei marcatori utilizzando lastessa sezione 7 del tessuto.
Qui presentiamo una tecnologia che accoppia anticorpi marcati con metalli e spettrometria di massa a ioni secondari e consente la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori (fenotipizzazione) e l’analisi spaziale utilizzando campioni di tessuto fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE) e freschi congelati (FF) 8,9. I campioni FFPE sono i materiali più utilizzati per i campioni di archiviazione dei tessuti e rappresentano una risorsa più facilmente disponibile per le tecnologie di imaging multiplexed rispetto ai campioni freschi congelati10. Inoltre, questa tecnologia offre la possibilità di riacquisire le immagini mesi dopo. Qui, discutiamo i nostri protocolli di colorazione ed elaborazione delle immagini utilizzando campioni di tessuto FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
La spiegazione completa delle complesse e intricate interazioni tra le molteplici componenti di una TME rimane un obiettivo fondamentale della ricerca sul cancro. I produttori hanno introdotto numerosi saggi multiplex come parte di questo sforzo, specialmente negli ultimi 5 anni. L’analisi spaziale multiplexata è uno strumento versatile e potente che facilita la categorizzazione simultanea di diversi bersagli preservando la morfologia strutturale nei campioni tumorali. Le tecniche di analisi spaziale possono essere eseg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Don Norwood di Editing Services, Research Medical Library di MD Anderson per aver modificato questo articolo e il Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory presso il Department of Translational Molecular Pathology di MD Anderson. Questa pubblicazione è il risultato in parte della ricerca facilitata dal supporto scientifico e finanziario per il Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornito attraverso il National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) all’Università del Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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