ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる
Summary
がん免疫療法の時代、腫瘍微小環境ダイナミクスの解明への関心が飛躍的に高まっています。このプロトコルは、その染色およびイメージングステップに関して質量分析イメージング技術を詳述し、高度に多重化された空間分析を可能にする。
Abstract
免疫ベースの治療法の進歩は、がんの治療と研究に革命をもたらしました。これは、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価に対する需要の高まりを引き起こしました。標準的な免疫組織化学は組織構造の研究には適しているが、少数のマーカーの分析に限定される。逆に、フローサイトメトリーなどの技術は、組織形態に関する情報は失われるが、複数のマーカーを同時に評価することができる。近年、表現型解析と空間解析を統合した多重化戦略が、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価への包括的なアプローチとして浮上している。 ここでは、金属標識抗体と二次イオン質量分析を組み合わせた革新的な技術について、アッセイの開発と最適化、組織の準備、画像の取得と処理における技術的ステップに焦点を当てて説明します。染色する前に、金属標識抗体パネルを開発し、最適化する必要があります。このハイプレックス画像システムは、単一の組織切片で最大 40 個の金属タグ付き抗体をサポートします。注目すべきは、信号干渉のリスクは、パネルに含まれるマーカーの数とともに増加することです。パネル設計後、この干渉を最小限に抑えるために、抗体への金属同位体割り当てに特に注意を払う必要があります。予備パネル試験は、抗体の小さなサブセットおよび対照組織におけるパネル全体のその後の試験を用いて実施される。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片が得られ、金コーティングされたスライドに取り付けられ、さらに染色される。染色には2日かかり、標準的な免疫組織化学染色とよく似ています。サンプルが染色されると、画像取得装置に入れられます。視野が選択され、画像が取得、アップロード、および保存されます。最終段階は、システムの画像処理ソフトウェアを使用した干渉のフィルタリングと除去のための画像準備です。このプラットフォームの欠点は、分析ソフトウェアの欠如です。しかし、生成された画像は、異なる計算病理学ソフトウェアによってサポートされています。
Introduction
クローン性腫瘍集団を取り巻く多数の細胞型の重要性は、発癌の分類において重要な要素である。この腫瘍微小環境(TME)組成と相互作用の解明への関心は、がん治療兵器の一部としての免疫ベースの治療法の確立に続いて継続的に高まっています。したがって、治療戦略は、腫瘍中心のアプローチからTME中心のアプローチに移行している1.
近年、腫瘍サーベイランスやがん発生における免疫細胞の役割を解明する取り組みが目覚ましく増加しています2,3.医学研究では、サイトメトリーベースの方法やシングルプレックスおよびマルチプレックスイメージング技術など、TMEの複数の要素のユニークな相互作用を解読するこの試みの一環として、多数の方法が生まれました。
フローサイトメトリー(1960年代に発明)、蛍光活性化細胞ソーティング、マスサイトメトリーなどの先駆的な方法は、主にTME成分4の同定と定量に焦点を当てています。サイトメトリーベースの定量的手法は免疫ランドスケープ表現型化を可能にするが、細胞空間分布を決定することは不可能である。逆に、標準的なシングルプレックス免疫組織化学などの方法は、組織アーキテクチャを保持し、研究者が細胞分布を分析することを可能にするが、単一の組織切片における標的の数の減少は、これらの方法の限界である5,6。過去数年間で、マルチプレックス免疫蛍光、バーコード蛍光イメージング、イメージング質量分析などの単一細胞分解能のための多重イメージング技術が、同じ組織セクション7を使用して同時マーカー染色に関する情報を取得するための包括的な戦略として浮上してきました。
ここでは、金属タグ付き抗体と二次イオン質量分析を結合し、ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)、および新鮮凍結(FF)組織サンプル8,9を用いた単一細胞分解能定量、マーカー共発現(表現型解析)、空間分析を可能にする技術を紹介します。FFPEサンプルは、組織アーカイブサンプルに最も広く使用されている材料であり、新鮮な凍結サンプル10よりも多重化イメージング技術のためにより容易に利用可能なリソースを表す。さらに、この技術は数ヶ月後に画像を再取得する可能性を提供します。ここでは、FFPE組織サンプルを用いた染色および画像処理プロトコルについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEの複数の構成要素間の複雑で複雑な相互作用の包括的な解明は、依然としてがん研究の重要な目的である。メーカーは、この取り組みの一環として、特に過去5年間に多数の多重化アッセイを導入してきました。多重化空間解析は、腫瘍サンプルの構造形態を維持しながら、複数のターゲットの同時分類を容易にする汎用性と強力なツールです。空間分析技術は、本明細書11、<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この記事の編集のためにMDアンダーソンの研究医学図書館であるEditing ServicesのDon Norwoodと、MDアンダーソンの翻訳分子病理学部門のMultiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratoryを認めている。この出版物は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターがん免疫モニタリングおよび分析センター(CIMAC)への国立がん研究所(NCI)協力協定(U24CA224285)を通じて提供されたがん免疫モニタリングおよび分析センター-がん免疫学的データコモンズネットワーク(CIMAC-CIDC)に対する科学的および財政的支援によって促進された研究から部分的にもたらされました。
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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