Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att sätta upp en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus. Denna modell med hög genomströmning simulerar bättre infektioner in vivo jämfört med konventionella mikrobiologiska tekniker och ger forskare en fysiologiskt relevant plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel.
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en dyr process med allt lägre framgångsgrad, vilket gör ytterligare investeringar i forskning om upptäckt av antimikrobiella medel mindre attraktiva. Antimikrobiell läkemedelsupptäckt och efterföljande kommersialisering kan göras mer lukrativ om en misslyckad-snabb-och-misslyckas-billig strategi kan implementeras inom de ledande optimeringsstadierna där forskare har större kontroll över läkemedelsdesign och formulering. I den här artikeln beskrivs installationen av en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus, som är enkel, kostnadseffektiv, hög genomströmning och reproducerbar. Bakteriefysiologin i modellen efterliknar att vid infektion som bakterieproliferation är beroende av patogenens förmåga att skada vävnaden. Upprättandet av sårinfektion verifieras genom en ökning av livskraftiga bakterieantal jämfört med inokulumet. Denna modell kan användas som en plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel i blyoptimeringsstadiet. Det kan hävdas att tillgången till denna modell kommer att ge forskare som utvecklar antimikrobiella medel en misslyckas-snabbt-och-misslyckas-billigt modell, vilket kommer att bidra till att öka framgångsgraden i efterföljande djurförsök. Modellen kommer också att underlätta minskning och förfining av djuranvändning för forskning och i slutändan möjliggöra snabbare och mer kostnadseffektiv översättning av nya antimikrobiella medel för hud- och mjukdelsinfektioner till kliniken.
Hudinfektioner är en viktig global fråga, med stora ekonomiska kostnader för vårdgivare runt om i världen. Utvecklingen av multidrogresistens och biofilmbildning av patogener spelar en nyckelroll i förekomsten av icke-helande sår 1,2,3,4. Som ett resultat av detta är hud- och mjukvävnadsinfektioner en av de vanligaste orsakerna till förlängd sjukhusvistelse och efterföljande återinläggning5. Förseningar i sårläkning är kostsamma för både patienten och vårdgivare, med vissa uppskattningar som tyder på att cirka 6,5 miljoner patienter drabbas årligen i USA. I Storbritannien leder hudinfektioner och tillhörande komplikationer till cirka 75 000 dödsfall årligen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en formidabel sårpatogen som ofta isoleras från patientsår 2,7. Graden av uppkomst av multiresistans ökade drastiskt under 2000-talet. Under denna tid var cirka 60% av akuta bakteriella hud- och hudstrukturinfektioner kulturpositiva för meticillinresistenta S. aureus1. Det ökande antalet multiresistenta stammar bland stafylokocker, och faktiskt andra patogener, under de senaste 2 decennierna indikerar ett brådskande behov av snabb utveckling av antibiotika med nya verkningssätt som kan övervinna resistens.
Men sedan början av 2000-talet har antibiotikaupptäcktsprogram dominerats av längre utvecklingstider och låga framgångsgrader, med endast 17% av nya antibiotika som går in i kliniska prövningar i USA som uppnår marknadsgodkännande8. Detta tyder på en skillnad mellan resultat från in vitro-testning av nya antibiotika och deras kliniska resultat. Det kan hävdas att denna skillnad till stor del beror på skillnader i bakteriell fysiologi vid infektioner in vivo och under konventionella mikrobiologiska metoder vid testning av antibiotikas effektivitet i de prekliniska in vitro-stadierna. Därför behövs nya laboratoriemetoder som är mer representativa för bakteriell fysiologi under infektion för att förbättra framgångsgraden i antibiotikaupptäcktsprogram.
Nuvarande metoder för att studera hudinfektioner inkluderar studier på levande djur (t.ex. möss), ex vivo-hudmodeller (t.ex. svin) och 3D-vävnadskonstruerade hudmodeller (t.ex. människa)9,10,11,12. Studier på levande djur är strikt reglerade och har relativt låg genomströmning. I djurmodeller orsakar sår och infektion betydande lidande för djuren och väcker etiska problem. Mänskliga hudmodeller, ex vivo eller vävnadskonstruerade, kräver etiskt godkännande, efterlevnad av lokal och global lagstiftning (lagen om mänsklig vävnad, Helsingforsdeklarationen), och det finns svårigheter att skaffa vävnader, med vissa förfrågningar som tar år att uppfylla13,14. Båda modelltyperna är arbetsintensiva och kräver betydande expertis för att säkerställa experimentell framgång. Vissa nuvarande ex vivo-hudinfektionsmodeller kräver förinokulerade skivor och tillsatser för sårbädden för att möjliggöra infektion; Även om dessa modeller är otroligt användbara finns det begränsningar i infektionsprocessen eftersom tillsatser begränsar användningen av sårbädden som näringskälla10,15,16,17. Modellen som beskrivs i denna studie använder inga tillsatser till sårbädden, vilket säkerställer att infektionspatologin och livskraftiga cellantal är ett resultat av direkt utnyttjande av sårbädden som den enda näringskällan.
Med tanke på behovet av nya laboratoriemetoder har en ny ex vivo-modell med hög genomströmning av hudinfektioner utvecklats för att utvärdera effekten av nya antibiotika. Hudinfektionsstudier står inför många utmaningar-höga kostnader, etiska problem och modeller som inte visar en fullständig bild20,21. Ex vivo-modeller och 3D-explantmodeller möjliggör bättre visualisering av sjukdomsprocessen och den inverkan behandlingar kan ha från en mer kliniskt relevant modell. Här beskrivs installationen av en ny fårhudsmodell, som är enkel, reproducerbar och kliniskt relevant och har hög genomströmning. Fårskinn valdes eftersom får är ett av de stora däggdjur som vanligtvis används för att modellera svar på infektioner in vivo. Dessutom är de lätt tillgängliga från slakterier, vilket säkerställer en stadig tillgång på hud för forskning, och deras slaktkroppar skållas inte, vilket garanterar god vävnadskvalitet. Denna studie använde S. aureus som exempelpatogen; Modellen fungerar dock bra med andra mikroorganismer.
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en viktig men dyr satsning som beräknas kosta cirka 1 miljard dollar och ta cirka 15 år att slutföra. Över 90% av antimikrobiella läkemedelsupptäckter och prekliniska studier av antimikrobiell läkemedelseffekt utförs av akademiska forskare och små till medelstora företag med vanligtvis mindre än 50 anställda22. Dessa team är mycket ekonomiskt begränsade, vilket gör misslyckandet med blymolekyler i senare skeden av translationell forskning ka…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka EPSRC (EP/R513313/1) för finansieringen. Författarna vill också tacka R.B Elliot och Son Abattoir i Calow, Chesterfield, för att ha tillhandahållit lammhuvuden och för att vara så tillmötesgående i de tidiga stadierna av projektet, Kasia Emery för hennes stöd under hela utvecklingen av detta protokoll och Fiona Wright från institutionen för infektion, immunitet och hjärt-kärlsjukdom vid University of Sheffield för att ha bearbetat histologiproverna och varit så otroligt hjälpsamma under hela detta projekt.
24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
F12 HAM | Sigma | N4888 | |
Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |