Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird.
Abstract
Mit einer Abnahme der Knochenmineraldichte brechen Knochen eher, was sich negativ auf die Lebensqualität eines Patienten auswirkt. Das Wachstum und die Entwicklung von Knochen werden hauptsächlich durch Osteoblasten und Osteoklasten reguliert. Es ist allgemein anerkannt, dass Osteoklasten aus Monozyten-Makrophagen-Zellen (BMMs) des Knochenmarks gewonnen werden. BMMs und andere hämatopoetische Stammzellen befinden sich in der Knochenmarkhöhle. Daher ist die Isolierung einzelner stabiler BMMs aus verschiedenen und heterogenen Zellpopulationen eine große Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird. Adhärent Zellen, die für 24-48 h in Primärkultur kultiviert wurden, wurden gesammelt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 37,94% der Zellen CD11b / c + (Monozyten-Makrophagen-Oberflächenantigen) waren. Tartratresistente Säurephosphatase (TRAP)-Färbung und Western-Blot-Analyse zeigten, dass BMMs in vitro in Osteoklasten differenzieren konnten. Die oben genannten Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die sekundären Adhärenzzellen als geeignetes zelluläres Modell für die Osteoklastendifferenzierungsforschung angesehen werden könnten.
Introduction
Es wurde berichtet, dass Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, die im Knochenmark existieren, sich in Blutmonozyten und Gewebemakrophagendifferenzieren können 1,2. Die oben genannten Zellen, die sich in Osteoklasten differenzieren können, um das Knochenwachstum und die Knochenentwicklung auszugleichen, werden häufig als Zellmodell verwendet, um Osteoklasten in vivo 3,4 zu induzieren. Knochenmark ist ein spezielles Gewebe, das verschiedene Arten von Zellen enthält, zu denen unter anderem mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks, Monozyten-Makrophagenzellen (BMMs), hämatopoetische Stammzellen, Endothelzellen und Immunzellen gehören. Tatsächlich deuteten mehrere frühere Studien darauf hin, dass sich adhärente Zellen, die aus der Knochenmarkhöhle des langen Knochens strömten, in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten 5,6,7,8 differenzieren konnten. Obwohl verschiedene Isolations- und Kulturmethoden verwendet wurden, um verschiedene homogene Zellpopulationen herzustellen, gibt es immer noch große Herausforderungen bei der Isolierung und Kultivierung von BMMs aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um mononukleäre Makrophagen (BMSCs) des Knochenmarks zu extrahieren. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex 9,10,11. Zum Beispiel erfordert die Dichtegradientenzentrifugation ein spezielles Kit und der Betrieb ist zeitaufwendig und umständlich. Diese Methode eignet sich zur Isolierung von BMMs aus hochvolumigen Blutproben, jedoch nicht aus Knochenmarkproben 9,12,13. Darüber hinaus ist die Extraktion von Gewebeproben mittels Kollagenase-Verdauung ein komplexes und zeitaufwendiges Verfahren; Diese Methode wird nicht für die Isolierung von BMMs aus Knochenmarkproben14,15 empfohlen. Obwohl die Flusstrennung zu hochreinen Monozyten-/Makrophagenpopulationen führen kann, erfordert sie sehr große Stichprobengrößen und hohe Anforderungen an Instrumente und Ausrüstung10,16. Darüber hinaus ist die Mikroperlenanreicherungsmethode extrem teuer und in einem allgemeinen Labor nicht durchführbar17.
Daher wurde in der aktuellen Studie eine bequeme, schnelle und kostengünstige Methode zur Isolierung mononukleärer Makrophagen aus dem Knochenmark vorgeschlagen. Knochenmarkzellen, die für verschiedene Zeitpunkte hafteten, wurden verwendet, um BMMs mit einer sekundären Adhärenzmethode zu isolieren. BMMs, die mit der oben genannten Methode extrahiert wurden, könnten die Bildung von Osteoklasten in vitro induzieren und so ein einfaches und bequemes Zellmodell für die zukünftige Untersuchung von Osteoporose in vitro liefern.
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Protocol
Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den Tierversuchsrichtlinien des Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center (Zulassungsnummer: IACUC-20181029-11) durchgeführt.
1. Zellextraktion
- Legen Sie die Sprague-Dawley-Ratten (SD-Ratten, 1-10 Tage alt, männlich oder weiblich) mit einer ausgewogenen Rate von 30% -70% Behältervolumen / Minute in die mit CO2 gefüllten Euthanasiekäfige. Nachdem die Ratten das Bewusstsein verloren haben (20-60 min), euthanasieren Sie die Ratte durch Zervixdislokation, um einen schmerzlosen Tod zu gewährleisten.
- Tauchen Sie die Ratten 10 Minuten lang zur Desinfektion in 75% Alkohol.
- Entfernen Sie vorsichtig alle Gliedmaßen der Ratte mit Schere und Pinzette, aspirieren Sie mit PBS mit einer Pipette und spülen Sie das Blut, das an den Gliedmaßen haftet.
- 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung in 500 ml DMEM geben und gut mischen. Nehmen Sie ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 5 ml FBS und 45 ml DMEM-Medium hinzu und mischen Sie gründlich, um ein 10% iges FBS-DMEM mit 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung zu erhalten. Fügen Sie 2 ml des oben genannten Kulturmediums in ein 5-ml-Röhrchen hinzu.
- Übertragen Sie die Gliedmaßenknochen in die 5-ml-Röhre. Verwenden Sie eine Schere, um die Gliedmaßenknochen im Schlauch in kleine Stücke (1-3 mm) zu schneiden und das Homogenat zu mischen, um die Knochenmarkzellen wieder in das Kulturmedium zu suspendieren. Stehen Sie 5 Minuten, bis sich die Gewebefragmente am Boden der Röhre abgesetzt haben.
- Fügen Sie 10 ml 10% FBS DMEM in eine 100-mm-Kulturschale hinzu und übertragen Sie dann den Überstand in die Kulturschale. Wenn Sie den Überstand absaugen, vermeiden Sie es, die Gewebeablagerungen in die Kulturschale zu übertragen.
- Inkubieren bei 37 °C und 5%CO2 für ca. 24 h. Nach dieser Inkubationszeit haftet die Mehrheit der mesenchymalen Stammzellen an der Kulturschalenwand und wächst langsam, während die meisten BMMs noch im Kulturmedium suspendiert sind.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in der 100-mm-Kulturschale in einen neuen 25-cm-2-Kolben und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für weitere 24 h. BMMs haften bei24-48 h Kultur an der Kolbenwand. Entfernen Sie das alte Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch frisches Medium, nachdem BMMs an der Kolbenwand haften.
- Subkultur, wenn die Zellen im Kolben 80% -90% Konfluenz erreichten.
HINWEIS: Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Während der Kultur wurde die Zellmorphologie allmählich vereinheitlicht. Die Zellen waren groß, unregelmäßig geformt, radial wachsend und in Form einer Bandscheibe am Kolben befestigt, wo multiple Kerne beobachtet werden konnten.
2. FACS-Färbung der Zelle
- Trypsin mit 1-2 ml kommerziellem Trypsin bei 37 °C und 5% CO 2 für 5 min verdauen und sekundäre adhärente Zellen zählen, um eine endgültige Zellzahl von 100.000/ Probe zu gewährleisten (Zellen zählen mit Neubauer Hämozytometer).
- Teilen Sie die Zellen in drei Gruppen ein (500 μL PBS enthalten 100.000 Zellen): (1) die leere Kontrollgruppe, die ungefärbte Zellen enthält; (2) die Isotyp-Kontrollgruppe; und (3) die experimentelle Gruppe (CD11b/c-Färbung).
- Inkubation primärer Antikörper (kein Antikörper für die Blindkontrollgruppe; Anti-CD11-Isotypkontrolle für die Isotyp-Kontrollgruppe, 0,6 μL Antikörper/Probe, 1 μg/Probe; Anti-CD11b/c für die Versuchsgruppe, 1 μL Antikörper/Probe, 1 μg/Probe) auf Eis für 30 min.
- Zentrifugieren Sie bei 300-350 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 μL PBS. Wiederholen Sie den obigen Vorgang einmal, um sicherzustellen, dass die ungebundenen primären Antikörper weggespült werden.
- Den entsprechenden Sekundärantikörper (kein Antikörper für die Blankkontrollgruppe; Ziegen-Antikaninchen-IgG für die Isotypkontrolle und die Versuchsgruppen, 0,25 μL Antikörper/Probe, 1:2.000) auf Eis im Dunkeln für 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie bei 300-350 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 μL PBS. Wiederholen Sie den obigen Vorgang einmal, um sicherzustellen, dass die ungebundenen zweiten Antikörper weggespült werden.
- Detektieren Sie die CD11b/c-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie (10.000 Zellen/Probe) und analysieren Sie die Daten per Software (z.B. FlowJo 7.5).
HINWEIS: Um den endgültigen Prozentsatz der CD11b / c + -Zellen zu erhalten, wurde die folgende Formel verwendet: Prozentsatz der CD11b / c + -Zellen in der experimentellen Gruppe - der Prozentsatz der CD11 + -Zellen in der Isotyp-Kontrollgruppe.
3. Wright-Giemsa-Färbung
- Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm 2 Zellkletterblätter (1 × 106 Zellen/Well) gelangt sind, und kultivieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.
- Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es dreimal mit PBS.
- Wright-Giemsa-Farbstofflösung (0,5 ml-0,8 ml) für 1 min in das Zellkletterblatt geben.
- Mischen Sie den Farbstoff mit destilliertem Wasser (0,5 ml-0,8 ml) mit einem Wattestäbchen und stehen Sie für 10 min.
- Waschen Sie die Farbstofflösung mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie dann für 1-3 min. Beobachten Sie unter einem Mikroskop.
4. TRAP-Färbung
- Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm 2 Zellkletterblätter (1 × 106 Zellen/Well) gelangt sind, und kultivieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.
- Ersetzen Sie das alte Medium durch das 10%ige FBS-DMEM- oder Osteoklasten-Induktionsmedium, ergänzt durch einen 50 ng/ml-Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL) und 30 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) und eine Kultur bei 37 °C und 5% CO2 für weitere 7 Tage.
- Färben Sie die Zellen mit dem TRAP-Färbeset nach Herstellerprotokoll und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop.
HINWEIS: TRAP-positive Zellen wurden als Osteoklasten definiert, die unter einem Lichtmikroskop violett waren. Die Anzahl der TRAP-positiven Zellen wurde mit der ImageJ-Software gemessen.
5. Westlicher Schandfleck
- Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm2 Zellkletterblättern (1 × 106 Zellen/Well) durchgangen wurden, und kultivieren Sie für 24 h.
- Ersetzen Sie das alte Medium durch frisches 10% FBS DMEM- oder Osteoklasteninduktionsmedium (50 ng/ml RANKL und 30 ng/ml M-CSF) und Kultur für weitere 7 Tage bei 37 °C und 5% CO2.
- Extrahieren Sie die gesamten zellulären Proteine mit RIPA-Puffer, trennen Sie sie durch 10% SDS-PAGE und übertragen Sie sie auf Polyvinylidenfluorid-Membranen18,19.
- Mit 5% Magermilchpulver (25 ml) für 2 h blocken und dreimal waschen, jeweils 10 min, mit TBS-Tween 20 (TBST).
- Inkubieren Sie primäre Antikörper bei 4 °C über Nacht (Anti-β-Actin, Anti-TRAP und Anti-Cathepsin K; alle primären Antikörper wurden um 1:1.000, 10 ml verdünnte Antikörper/Bande) verdünnt und dreimal mit TBST gewaschen.
- Inkubieren Sie den sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, 1:2.000 Verdünnung, 10 ml verdünnter Antikörper/Band) bei Raumtemperatur für 2 h und waschen Sie ihn dreimal mit TBST. Visualisieren Sie die Proteinbänder mit einer sich entwickelnden Lösung.
HINWEIS: Die Expressionsniveaus der oben genannten Proteine wurden auf β-Aktin normalisiert.
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Representative Results
Die sekundäre adhärente Zellpopulation war stabil und einheitlich. Mit der kontinuierlichen Zellproliferation wurde die Mehrheit der Zellen größer, mit unregelmäßiger Form und wuchs zu einer radialen adhärenten Scheibe (Abbildung 2C, D). Die Durchflusszytometrie zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen, die CD11b/c, einen molekularen Marker auf der Oberfläche von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, exprimieren, etwa 37,94% betrug (Abbildung 2A,B). Um weiter zu überprüfen, ob es sich bei den CD11b/c-positiven Zellen um Monozyten-Makrophagen-Abstammungszellen handelte, wurde nach einer Zellbehandlung mit RANKL und M-CSF die Differenzierung sekundärer adhärenter Zellen in Osteoklasten induziert. Die Ergebnisse der TRAP-Färbung zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Anzahl der intrazellulären purpurroten Granulate in den mit RANKL und M-CSF induzierten Zellen signifikant erhöht war (Abbildung 2E, F). Weiterhin waren die Expressionsniveaus der Osteoklasten-spezifischen Proteine TRAP und Cathepsin K signifikant erhöht (Abbildung 2G,H).
Abbildung 1: Flussdiagramm der sekundären adhärenten Zellextraktionsmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: (A-B) Nach drei Generationen stabiler Kultur sekundärer adhärenter Zellen wurden CD11b/c-positive Zellen durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. (C-D) Die Morphologie der sekundären adhärenten Zellen nach drei Generationen ist dargestellt (C für weißes Licht, D für Wright-Giemsa-Färbung). (E-F) Die TRAP-Färbung wurde verwendet, um die Wirkung von RANKL und M-CSF auf die Osteoklastenbildung (E wie Kontrolle; F für RANKL und M-CSF). (G-H) Die Zellen wurden 7 Tage lang mit RANKL und M-CSF behandelt und die Expressionsniveaus von TRAP und Cathepsin K wurden durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. P < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. TRAP, tartratresistente Säurephosphatase; RANKL, Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden; M-CSF, Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Methode zur Extraktion von Makrophagen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Osteoklasten sind einer der bedeutendsten Zelltypen, die am Auftreten und der Entwicklung von Knochenerkrankungen beteiligt sind, sowie eines der Hauptobjekte der Knochenkrankheitsforschung20. Monozyten/Makrophagen können sich in Osteoklasten differenzieren. Da mononukleäre Makrophagen (RAW264.7-Zellen) zu teuer in der Anschaffung sind und während der Kultur leicht aktiviert werden können, ist es schwierig, In-vitro-Differenzierungsexperimente mit dieser Zelllinie durchzuführen. Obwohl mehrere Methoden zur Extraktion von Monozyten/Makrophagen aus dem Knochenmark entwickelt wurden, darunter Dichtegradientenzentrifugation, Kollagenaseaufschluss, Mikrosphärenanreicherung und Durchflusszytometrie (Tabelle 1), sind diese Methoden zeitaufwendig, während sie hohe Probenvolumina und kostspielige Ausrüstung erfordern. Daher zielte die aktuelle Studie darauf ab, eine einfache und schnelle Methode zur Extraktion von Monozytec/Makrophagen aus Knochenmarkproben vorzuschlagen.
Es gibt viele Zellpopulationen im Knochenmark, einschließlich BMSCs, Endothelzellen und Immunzellen zusätzlich zu BMMs. Wie wir alle wissen, können BMSCs in Osteoblasten differenzieren, und dieser Prozess wird die Differenzierung von BMMs in Osteoklasten21 beeinflussen. Gleichmäßige und stabile BMMs sind signifikante Faktoren für die Induktion der Osteoklastendifferenzierung in vitro, daher ist es besonders wichtig, diese limitierenden Faktoren bei der Isolierung und Extraktion von BMMs zu berücksichtigen. Gleichzeitig wird auch die Fähigkeit von BMMs, sich in Osteoklasten zu differenzieren, während des kontinuierlichen Durchgangs schwächer. Daher ist es eine Herausforderung, BMMs aus dem Knochenmark zu isolieren und sie erfolgreich in Osteoklasten zu induzieren.
Wir fanden heraus, dass es Unterschiede in der Adhärenzzeit von adhärenten Zellen im Knochenmark gibt. Genauer gesagt haften BMSCs während 0-24 h Kultur grundsätzlich an der Kulturschalenwand, während BMMs nach 24 h an der Kulturschalenwand haften. Basierend auf dem obigen Befund wurde die sekundäre Adhärenzmethode ausgewählt, um BMMs zu isolieren. Säugende SD-Ratten (Alter, 1-10 Tage alt) wurden ausgewählt, um BMMs zu extrahieren, da die BMMs junger Ratten eine stärkere Differenzierungsfähigkeit aufweisen. Die Knochenmarkzellen von SD-Ratten wurden gesammelt, und nach 24 h Kultivierung wurde die Zellsuspension für weitere 24 h übertragen und kultiviert. Die gesammelten sekundären adhärenten Zellen enthielten eine große Anzahl von BMMs. Nach der Kultur wurden die sekundären adhärenten Zellen allmählich gereinigt und stabil und gleichmäßig. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass der Prozentsatz der CD11b / c-positiven Zellen etwa 37,94% erreichte. Darüber hinaus zeigten TRAP-Färbungen und Western-Blot-Analysen, dass sich die extrahierten BMMs in Osteoklasten differenzieren konnten. Dieser Befund stimmte mit einer früheren Studie überein, die auch darauf hindeutete, dass BMMs, die mit der sekundären Adhärenzmethode extrahiert wurden, erfolgreich in Osteoklasten22 differenziert werden konnten.
Mit der sekundären Adhärenzmethode lassen sich einfach und schnell mononukleäre Makrophagen aus dem Knochenmark extrahieren, ohne dass High-Tech-Laborgeräte benötigt werden. Gleichzeitig eignet sich diese Methode, um Zellen aus einer kleinen Knochenmarkprobe zu isolieren und so die umständlichen und zeitraubenden Schwierigkeiten zu überwinden, die bei den bisherigen Methoden zur Extraktion mononukleärer Makrophagen beobachtet wurden. Insgesamt konnten BMMs, die mit der sekundären Adhärenzmethode extrahiert wurden, in vitro erfolgreich in Osteoklasten differenziert werden, wodurch ein stabiles Zellmodell für die In-vitro-Untersuchung von Osteoklasten bereitgestellt wurde.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Förderkennzeichen) unterstützt. LY19H060001) und das Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (Nr. 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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