Summary
Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria.
Abstract
Con una diminuzione della densità minerale ossea, le ossa hanno maggiori probabilità di fratturarsi, influenzando così negativamente la qualità della vita di un paziente. La crescita e lo sviluppo delle ossa sono regolati principalmente da osteoblasti e osteoclasti. È stato ampiamente accettato che gli osteoclasti sono derivati da cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM). BMM e altre cellule staminali ematopoietiche si trovano nella cavità del midollo osseo. Pertanto, isolare singoli BBM stabili da popolazioni cellulari diverse ed eterogenee è una sfida enorme. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria. Sono state raccolte cellule aderenti coltivate per 24-48 ore in coltura primaria. L'analisi citometrica a flusso ha mostrato che circa il 37,94% delle cellule erano CD11b/c+ (antigene di superficie monocita-macrofago). La colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) e l'analisi western blot hanno dimostrato che i BMM potrebbero differenziarsi in osteoclasti in vitro. I risultati di cui sopra hanno suggerito che le cellule di aderenza secondaria potrebbero essere considerate come un modello cellulare adatto per la ricerca sulla differenziazione degli osteoclasti.
Introduction
È stato riportato che le cellule di lignaggio monociti-macrofagi esistenti nel midollo osseo possono differenziarsi in monociti del sangue e macrofagi tissutali 1,2. Le cellule di cui sopra, che possono differenziarsi in osteoclasti per bilanciare la crescita e lo sviluppo osseo, sono comunemente usate come modello cellulare per indurre osteoclasti in vivo 3,4. Il midollo osseo è un tessuto speciale contenente diversi tipi di cellule, che includono, ma non sono solo limitate alle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, alle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM), alle cellule staminali ematopoietiche, alle cellule endoteliali e alle cellule immunitarie. In effetti, diversi studi precedenti hanno suggerito che le cellule aderenti si sono precipitate fuori dalla cavità del midollo osseo dell'osso lungo potrebbero differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti 5,6,7,8. Sebbene siano stati utilizzati diversi metodi di isolamento e coltura per produrre diverse popolazioni cellulari omogenee, ci sono ancora grandi sfide nell'isolamento e nella coltura di BMM da una varietà di diversi tipi di cellule.
Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre macrofagi mononucleati del midollo osseo (BMSC). Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessi 9,10,11. Ad esempio, la centrifugazione a gradiente di densità richiede un kit specializzato e l'operazione richiede tempo e ingombro. Questo metodo è adatto per l'isolamento di BMM da campioni di sangue ad alto volume, ma non da campioni di midollo osseo 9,12,13. Inoltre, l'estrazione di campioni di tessuto utilizzando la digestione della collagenasi è una procedura complessa e dispendiosa in termini di tempo; questo metodo non è raccomandato per l'isolamento di BMM da campioni di midollo osseo14,15. Inoltre, sebbene la separazione del flusso possa portare a popolazioni di monociti / macrofagi altamente purificate, richiede dimensioni del campione molto grandi e requisiti elevati di strumenti e attrezzature10,16. Inoltre, il metodo di arricchimento delle microsfere è estremamente costoso e non è fattibile in un laboratorio generale17.
Pertanto, nel presente studio è stato proposto un metodo conveniente, veloce ed economico per l'isolamento dei macrofagi mononucleati dal midollo osseo. Le cellule del midollo osseo aderenti per diversi punti temporali sono state utilizzate per isolare i BMM utilizzando un metodo di aderenza secondaria. I BMM estratti con il metodo di cui sopra potrebbero indurre la formazione di osteoclasti in vitro, fornendo così un modello cellulare semplice e conveniente per il futuro studio dell'osteoporosi in vitro.
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Protocol
Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali del Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università medica cinese di Zhejiang (numero di approvazione: IACUC-20181029-11).
1. Estrazione cellulare
- Metti i ratti Sprague-Dawley (ratti SD, 1-10 giorni, maschio o femmina) nelle gabbie di eutanasia riempite con CO2 ad un tasso equilibrato del 30% -70% volume contenitore / minuto. Dopo che i ratti perdono conoscenza (20-60 min), eutanasizzare il ratto per lussazione cervicale per garantire una morte indolore.
- Immergere i ratti in alcool al 75% per 10 minuti per la disinfezione.
- Rimuovere con cura tutti gli arti del ratto con forbici e pinze, aspirare con PBS usando una pipetta e lavare il sangue aderente agli arti.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di penicillina/streptomicina in 500 mL di DMEM e mescolare bene. Prendere un tubo di centrifuga sterile da 50 mL, aggiungere 5 mL di FBS e 45 mL di mezzo DMEM e mescolare accuratamente per ottenere una soluzione di DMEM FBS al 10% contenente l'1% di penicillina/streptomicina. Aggiungere 2 mL del terreno di coltura di cui sopra in un tubo da 5 mL.
- Trasferire le ossa degli arti nel tubo da 5 ml. Utilizzare le forbici per tagliare le ossa degli arti nel tubo in piccoli pezzi (1-3 mm) e mescolare l'omogeneizzato per risospendere le cellule del midollo osseo nel terreno di coltura. Riposare per 5 minuti fino a quando i frammenti di tessuto si sono depositati sul fondo del tubo.
- Aggiungere 10 ml di DMEM FBS al 10% in una piastra di coltura da 100 mm, quindi trasferire il surnatante nel piatto di coltura. Quando si aspira il surnatante, evitare di trasferire i detriti tissutali nel piatto di coltura.
- Incubare a 37 °C e 5% CO2 per circa 24 ore. Dopo questo tempo di incubazione, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali aderirà alla parete del piatto di coltura e crescerà lentamente, mentre la maggior parte dei BBM sarà ancora sospesa nel terreno di coltura.
- Trasferire la sospensione cellulare nella piastra di coltura da 100 mm in un nuovo matraccio da25 cm 2 e continuare a coltivare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 per ulteriori 24 ore. I BMM aderiranno alla parete del pallone a 24-48 ore di coltura. Rimuovere con cura il vecchio mezzo e sostituirlo con un mezzo fresco dopo che i BBM hanno aderito alla parete del pallone.
- Sottocoltura quando le cellule nel pallone hanno raggiunto l'80% -90% di confluenza.
NOTA: Tutte le cellule sono state coltivate a 37 °C e al 5% di CO2. Durante la coltura, la morfologia cellulare è stata gradualmente unificata. Le cellule erano grandi, di forma irregolare, crescevano radialmente e attaccate al pallone in una forma di disco, dove si potevano osservare più nuclei.
2. Colorazione FACS della cellula
- La tripsina digerisce utilizzando 1-2 mL di tripsina commerciale a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti e conta le cellule aderenti secondarie per garantire un conteggio finale delle cellule di 100.000/campione (conta delle cellule con emocitometro Neubauer).
- Dividere le cellule in tre gruppi (500 μL di PBS contiene 100.000 celle): (1) il gruppo di controllo vuoto contenente cellule non macchiate; (2) il gruppo di controllo dell'isotipo; e (3) il gruppo sperimentale (colorazione CD11b/c).
- Incubare gli anticorpi primari (nessun anticorpo per il gruppo di controllo in bianco; controllo dell'isotipo anti-CD11 per il gruppo di controllo dell'isotipo, 0,6 μL di anticorpo/campione, 1 μg/campione; anti-CD11b/c per il gruppo sperimentale, 1 μL di anticorpo/campione, 1 μg/campione) sul ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 300-350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere le cellule con 500 μL di PBS. Ripetere la procedura di cui sopra una volta per assicurarsi che gli anticorpi primari non legati vengano lavati via.
- Incubare l'anticorpo secondario corrispondente (nessun anticorpo per il gruppo di controllo in bianco; IgG anti-coniglio di capra per il controllo dell'isotipo e i gruppi sperimentali, anticorpo/campione da 0,25 μL, 1:2.000) sul ghiaccio al buio per 30 min.
- Centrifugare a 300-350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere le cellule con 500 μL di PBS. Ripetere la procedura di cui sopra una volta per assicurarsi che i secondi anticorpi non legati vengano lavati via.
- Rileva le cellule CD11b/c positive mediante citometria a flusso (10.000 cellule/campione) e analizza i dati tramite software (ad esempio, FlowJo 7.5).
NOTA: Per ottenere la percentuale finale di cellule CD11b/c+, è stata utilizzata la seguente formula: Percentuale di cellule CD11b /c+ nel gruppo sperimentale - la percentuale di cellule CD11+ nel gruppo di controllo isotipo.
3. Colorazione Wright-Giemsa
- Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule/pozzetto) e coltivare a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
- Scartare il terreno di coltura e lavare tre volte con PBS.
- Aggiungere la soluzione colorante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) al foglio di arrampicata cellulare per 1 min.
- Mescolare il colorante con acqua distillata (0,5 ml-0,8 ml) con un batuffolo di cotone e riposare per 10 minuti.
- Lavare la soluzione colorante con acqua distillata e quindi asciugare per 1-3 minuti. Osservare al microscopio.
4. Colorazione TRAP
- Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule/pozzetto) e coltivare a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.
- Sostituire il vecchio mezzo con il 10% FBS DMEM o osteoclast induction medium integrato con 50 ng/mL attivatore del recettore del ligando nucleare fattore-κB (RANKL) e 30 ng/mL del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), e coltura a 37 °C e 5% CO2 per altri 7 giorni.
- Macchiare le cellule con il kit di colorazione TRAP secondo il protocollo del produttore e osservarle al microscopio.
NOTA: le cellule TRAP-positive sono state definite osteoclasti, che erano viola al microscopio ottico. Il numero di cellule TRAP-positive è stato misurato utilizzando il software ImageJ.
5. Macchia occidentale
- Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule / pozzetto) e coltivare per 24 ore.
- Sostituire il vecchio mezzo con dmEM FBS fresco al 10% o mezzo di induzione osteoclasto (50 ng/mL di RANKL e 30 ng/mL di M-CSF) e la coltura per altri 7 giorni a 37 °C e 5% di CO2.
- Estrarre proteine cellulari totali con tampone RIPA, separate dal 10% SDS-PAGE, e trasferirle alle membrane di polivinilidene fluoruro 18,19.
- Bloccare con polvere scremata al 5% (25 mL) per 2 ore e lavare tre volte, per 10 minuti ogni volta, con TBS-Tween 20 (TBST).
- Incubare gli anticorpi primari a 4 °C durante la notte (anti-β-actina, anti-TRAP e anti-catepsina K; tutti gli anticorpi primari sono stati diluiti 1:1.000, 10 mL di anticorpo/banda diluita) e lavare tre volte con TBST.
- Incubare l'anticorpo secondario (IgG anti-coniglio di capra, diluizione 1:2.000, 10 ml di anticorpo/banda diluita) a temperatura ambiente per 2 ore e lavare tre volte con TBST. Visualizza le bande proteiche utilizzando una soluzione in via di sviluppo.
NOTA: I livelli di espressione delle proteine di cui sopra sono stati normalizzati a β-actina.
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Representative Results
La popolazione cellulare aderente secondaria era stabile e uniforme. Con la continua proliferazione cellulare, la maggior parte delle cellule è diventata più grande, con forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale (Figura 2C, D). La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b/c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi, era di circa il 37,94% (Figura 2A,B). Per verificare ulteriormente che le cellule CD11b/c positive fossero cellule di lignaggio monociti-macrofagi, la differenziazione delle cellule aderenti secondarie in osteoclasti è stata indotta dopo il trattamento cellulare con RANKL e M-CSF. I risultati della colorazione TRAP hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, il numero di granuli rosso porpora intracellulare era significativamente aumentato nelle cellule indotte con RANKL e M-CSF (Figura 2E, F). Inoltre, i livelli di espressione delle proteine osteoclast-specifiche TRAP e catepsina K sono stati significativamente aumentati (Figura 2G,H).
Figura 1: Diagramma di flusso del metodo di estrazione delle celle aderenti secondarie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (A-B) Dopo tre generazioni di coltura stabile di cellule aderenti secondarie, le cellule CD11b/c positive sono state rilevate mediante citometria a flusso. (C-D) Viene mostrata la morfologia delle cellule aderenti secondarie dopo tre generazioni (C per la luce bianca, D per la colorazione di Wright-Giemsa). (E-F) La colorazione TRAP è stata utilizzata per rilevare l'effetto di RANKL e M-CSF sulla formazione di osteoclasti (E per il controllo; F per RANKL e M-CSF). (G-H) Le cellule sono state trattate con RANKL e M-CSF per 7 giorni e i livelli di espressione di TRAP e catepsina K sono stati determinati dall'analisi western blot. I dati sono espressi come la media ± SD di tre esperimenti indipendenti. P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo. TRAP, fosfatasi acida resistente al tartrato; RANKL, attivatore del recettore del ligando fattore nucleare-κB; M-CSF, fattore stimolante le colonie di macrofagi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Metodo per l'estrazione dei macrofagi Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Gli osteoclasti sono uno dei tipi di cellule più significativi coinvolti nell'insorgenza e nello sviluppo di malattie ossee, nonché uno degli oggetti primari della ricerca sulle malattie ossee20. Monociti / macrofagi possono differenziarsi in osteoclasti. Poiché i macrofagi mononucleati (cellule RAW264.7) sono troppo costosi da acquistare e si attivano facilmente durante la coltura, è difficile eseguire esperimenti di differenziazione in vitro utilizzando questa linea cellulare. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per estrarre monociti / macrofagi dal midollo osseo, tra cui la centrifugazione con gradiente di densità, la digestione della collagenasi, l'arricchimento della microsfera e la citometria a flusso (Tabella 1), questi metodi richiedono molto tempo, mentre richiedono elevati volumi di campioni e attrezzature costose. Pertanto, l'attuale studio mirava a proporre un metodo semplice e rapido per estrarre monociti / macrofagi da campioni di midollo osseo.
Ci sono molte popolazioni cellulari nel midollo osseo, tra cui BMSC, cellule endoteliali e cellule immunitarie oltre ai BBM. Come tutti sappiamo, le BMSC possono differenziarsi in osteoblasti e questo processo influenzerà la differenziazione dei BBM in osteoclasti21. I BMM uniformi e stabili sono fattori significativi per indurre la differenziazione degli osteoclasti in vitro, quindi è particolarmente importante considerare questi fattori limitanti quando si isolano ed estraggono BBM. Allo stesso tempo, la capacità dei BBM di differenziarsi in osteoclasti si indebolirà anche durante il passaggio continuo. Pertanto, è difficile isolare i BMM dal midollo osseo e indurli con successo negli osteoclasti.
Abbiamo scoperto che ci sono differenze nel tempo di aderenza delle cellule aderenti nel midollo osseo. Più specificamente, i BMSC hanno sostanzialmente aderito al muro del piatto di coltura durante 0-24 ore di coltura, mentre i BBM iniziano ad aderire al muro del piatto di coltura dopo 24 ore. Sulla base dei risultati di cui sopra, è stato selezionato il metodo di aderenza secondaria per isolare i BMM. I ratti da latte SD (età, 1-10 giorni) sono stati selezionati per estrarre I BMM, poiché i BBM dei ratti giovani mostrano una maggiore capacità di differenziazione. Le cellule del midollo osseo dei ratti SD sono state raccolte e, dopo la coltura per 24 ore, la sospensione cellulare è stata trasferita e coltivata per altre 24 ore. Le cellule aderenti secondarie raccolte contenevano un gran numero di BMM. Dopo la coltura, le cellule aderenti secondarie sono state gradualmente purificate e sono diventate stabili e uniformi. I risultati della citometria a flusso hanno dimostrato che la percentuale di cellule CD11b/c positive ha raggiunto circa il 37,94%. Inoltre, la colorazione TRAP e l'analisi western blot hanno dimostrato che i BMM estratti potrebbero differenziarsi in osteoclasti. Questo risultato era coerente con uno studio precedente che suggeriva anche che i BMM estratti con il metodo di aderenza secondaria potevano essere differenziati con successo in osteoclasti22.
Il metodo di aderenza secondaria può essere utilizzato per estrarre in modo semplice e rapido macrofagi mononucleati dal midollo osseo, senza richiedere attrezzature di laboratorio ad alta tecnologia. Allo stesso tempo, questo metodo è adatto per isolare le cellule da un piccolo campione di midollo osseo, superando così le difficoltà ingombranti e dispendiose in termini di tempo osservate nei metodi precedenti comunemente usati per estrarre macrofagi mononucleati. Nel complesso, i BMM estratti con il metodo dell'aderenza secondaria potrebbero essere differenziati con successo in osteoclasti in vitro, fornendo così un modello cellulare stabile per lo studio in vitro degli osteoclasti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (sovvenzione n. LY19H060001) e il Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (n. 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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