Summary
ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。
Abstract
骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。
Introduction
骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した5、6、7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。
骨髄単核球マクロファージ(BMSC)を抽出するためにいくつかの方法が開発されている。しかしながら、これらの方法の大部分は、複雑な9、10、11である。たとえば、密度勾配遠心分離には特殊なキットが必要であり、操作には時間がかかり面倒です。この方法は、大量の血液サンプルからのBMMの単離には適しているが、骨髄サンプル9、12、13からはそうではない。さらに、コラゲナーゼ消化を使用して組織サンプルを抽出することは、複雑で時間のかかる手順です。この方法は、骨髄サンプルからのBMMの単離には推奨されない14、15。さらに、流動分離は高度に精製された単球/マクロファージ集団をもたらす可能性がありますが、非常に大きなサンプルサイズと高い機器および機器要件が必要です10,16。さらに、マイクロビーズ濃縮法は極めて高価であり、一般の実験室17では実現不可能である。
したがって、現在の研究では、骨髄からの単核球マクロファージの単離のために、便利で、速く、そして安価な方法が提案された。異なる時点で接着した骨髄細胞を用いて、二次接着法を用いてBMMを単離した。上記の方法で抽出されたBMMは、 インビトロで破骨細胞の形成を誘導することができ、したがってイン ビトロでの骨粗鬆症の将来の研究のための簡単で便利な細胞モデルを提供する。
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Protocol
本試験における全ての実験は、浙江省中国医科大学実験動物研究センターの動物実験ガイドライン(承認番号:IACUC-20181029-11)に従って実施した。
1. 細胞抽出
- Sprague-Dawleyラット(SDラット、生後1〜10日、雄または雌)をCO2 で満たされた安楽死ケージに、30%〜70%の容器容量/分のバランスのとれた速度で入れる。ラットが意識を失った後(20〜60分)、頸部脱臼によってラットを安楽死させ、痛みのない死を確実にする。
- 消毒のためにラットを75%アルコールに10分間浸漬する。
- はさみと鉗子でラットのすべての四肢を慎重に取り除き、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。
- 500mLのDMEMに5mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加え、よく混ぜる。50 mLの滅菌遠沈管を取り、5 mLのFBSおよび45 mLのDMEM培地を加え、十分に混合して、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む10%FBS DMEMを得た。上記の培養液2 mLを5 mLチューブに加える。
- 四肢の骨を5mLチューブに移す。はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片(1〜3mm)に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。
- 100 mLの10%FBS DMEMを100 mm培養皿に加え、上清を培養皿に移した。上清を吸引するときは、組織破片を培養皿に移さないでください。
- 37°Cおよび5%CO2で約24 時間インキュベートする。このインキュベーション時間の後、間葉系幹細胞の大部分は培養皿壁に接着し、ゆっくりと増殖するが、ほとんどのBMMは依然として培養培地中に懸濁される。
- 100 mm培養皿の細胞懸濁液を新しい25 cm 2 フラスコに移し、37°Cおよび5%CO2 でさらに24時間細胞を培養し続ける。古い培地を慎重に取り除き、BMMがフラスコ壁に付着した後、新鮮な培地と交換してください。
- フラスコ内の細胞が80%〜90%コンフルエントに達したときの継代培養。
注:全ての細胞を37°Cおよび5%CO2で培養した。培養中、細胞形態は徐々に統一された。細胞は大きく、不規則な形をしており、放射状に成長し、複数の核が観察できるディスクの形でフラスコに付着していた。
2. 細胞のFACS染色
- 市販のトリプシン1~2mLを37°Cで5%CO2 で5分間使用してトリプシン消化し、二次付着細胞をカウントして最終細胞数100,000/サンプルを確保した(ノイバウアー血球計で細胞をカウント)。
- 細胞を3つの群に分割する(500μLのPBSは100,000個の細胞を含む):(1)染色されていない細胞を含むブランク対照群;(2)前記アイソタイプ対照群;(3)実験群(CD11b/c染色)とした。
- 一次抗体(ブランク対照群は抗体なし;アイソタイプ対照群は抗CD11アイソタイプ対照、0.6 μLの抗体/サンプル、1 μg/サンプル;実験群は抗CD11b/c、抗体/サンプル1 μL、1 μg/サンプル)を氷上で30分間インキュベートする。
- 300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない一次抗体が洗い流されるようにします。
- 対応する二次抗体(ブランク対照群には抗体なし;アイソタイプ対照群および実験群にはヤギ抗ウサギIgG、0.25 μL抗体/サンプル、1:2,000)を氷上で暗所で30分間インキュベートする。
- 300-350 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSで再懸濁する。上記の手順を 1 回繰り返して、結合していない第 2 抗体が洗い流されるようにします。
- フローサイトメトリー(10,000細胞/サンプル)でCD11b/c陽性細胞を検出し、ソフトウェア(FlowJo 7.5など)でデータを分析します。
注:CD11b/c+細胞の最終百分率を得るために、以下の式を使用した:実験群におけるCD11b / c +細胞の割合−アイソタイプ対照群におけるCD11 +細胞の割合。
3. ライト・ギムザ染色
- 35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%CO2で24時間培養する。
- 培養液を捨て、PBSで3回洗浄する。
- ライト・ギムザ色素溶液(0.5 mL~0.8 mL)を細胞クライミングシートに1分間加える。
- 染料を蒸留水(0.5mL〜0.8mL)と綿棒で混合し、10分間静置する。
- 色素溶液を蒸留水で洗浄し、次いで1〜3分間乾燥させる。顕微鏡下で観察する。
4. トラップ染色
- 35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)上に3回継代した付着性二次細胞を播種し、37°Cおよび5%CO2で24時間培養する。
- 古い培地を、核因子-κBリガンド(RANKL)の50ng/mL受容体活性化剤および30ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を添加した10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地と交換し、37°Cおよび5%CO2 でさらに7日間培養する。
- 製造元のプロトコールに従ってTRAP染色キットで細胞を染色し、顕微鏡下で観察する。
注:TRAP陽性細胞は破骨細胞と定義され、これは光学顕微鏡下で紫色であった。TRAP陽性細胞の数は、ImageJソフトウェアを用いて測定した。
5. ウェスタンブロット
- 35mm2細胞クライミングシート(1×106細胞/ウェル)に3回継代した付着性二次細胞を播種し、24時間培養する。
- 古い培地を新鮮な10%FBS DMEMまたは破骨細胞誘導培地(50ng/mLのRANKLおよび30ng/mLのM-CSF)と交換し、37°Cおよび5%CO2でさらに7日間培養する。
- RIPA緩衝液で全細胞タンパク質を抽出し、10%SDS−PAGEにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜18、19に転写する。
- 5%脱脂粉乳(25mL)で2時間ブロックし、TBS-Tween 20(TBST)で3回、毎回10分間洗浄します。
- 一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし(抗βアクチン、抗TRAP、および抗カテプシンK;すべての一次抗体を1:1,000に希釈し、10mL希釈抗体/バンド)、TBSTで3回洗浄した。
- 二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG、1:2,000希釈、10mL希釈抗体/バンド)を室温で2時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄する。現像液を用いてタンパク質バンドを可視化する。
注:上記のタンパク質の発現レベルをβ-アクチンに正規化した。
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Representative Results
二次付着細胞集団は安定かつ均一であった。連続的な細胞増殖に伴い、細胞の大部分は不規則な形状でより大きくなり、放射状の接着円盤に成長した(図2C、D)。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11b/cを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した(図2A、B)。さらに、CD11b/c陽性細胞が単球-マクロファージ系譜細胞であることを確認するために、RANKLおよびM-CSFによる細胞処理後に二次接着細胞から破骨細胞への分化を誘導した。TRAP染色の結果、対照群と比較して、RANKLおよびM-CSFで誘導された細胞において細胞内紫赤色顆粒の数が有意に増加したことを示した(図2E、F)。さらに、破骨細胞特異的タンパク質TRAPおよびカテプシンKの発現レベルは有意に増加した(図2G、H)。
図 1: 二次接着細胞抽出法のフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:(A-B)二次付着細胞を3世代安定培養した後、CD11b/c陽性細胞をフローサイトメトリーにより検出した。(C-D)3世代後の二次接着細胞の形態が示されている(白色光の場合はC、ライト・ギムザ染色の場合はD)。(E-F)破骨細胞形成に対するRANKLおよびM-CSFの効果を検出するためにTRAP染色を使用した(対照についてはE;F for RANKL and M-CSF).(ジー・エ細胞をRANKLおよびM−CSFで7日間処理し、TRAPおよびカテプシンKの発現レベルをウェスタンブロット分析によって決定した。データは、3回の独立した実験のSD±平均として表される。P<0.001対対照群であった。TRAP、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ;RANKL、核因子-κBリガンドの受容体活性化剤;M-CSF、マクロファージコロニー刺激因子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:マクロファージの抽出方法 この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである20。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを抽出するために、密度勾配遠心分離、コラゲナーゼ消化、ミクロスフェア濃縮およびフローサイトメトリーを含むいくつかの方法が開発されているが(表1)、これらの方法は時間がかかり、高いサンプル量と高価な装置を必要とする。そこで、本研究では、骨髄試料からモノサイト/マクロファージを簡便かつ迅速に抽出する方法を提案することを目指した。
骨髄には、BMMに加えて、BMSC、内皮細胞および免疫細胞を含む多くの細胞集団が存在する。BMSCが骨芽細胞に分化することができ、このプロセスが破骨細胞へのBMMの分化に影響を与えることは誰もが知っているように21。均一で安定したBMMは、 インビトロで破骨細胞分化を誘導するための重要な因子であるため、BMMを単離および抽出する際には、これらの制限因子を考慮することが特に重要である。同時に、破骨細胞に分化するBMMの能力も連続通過中に弱まる。したがって、BMMを骨髄から単離し、破骨細胞に誘導することに成功することは困難である。
骨髄中の接着細胞の接着時間に違いがあることを見出した。より具体的には、BMSCは基本的に培養の0〜24時間の間に培養皿壁に接着し、BMMは24時間後に培養皿壁に接着し始める。上記の知見に基づき、BMMを単離するために二次アドヒアランス法を選択した。若齢ラットのBMMはより強い分化能を示すため、子育てSDラット(年齢、1~10日齢)をBMMを抽出するために選択された。SDラットの骨髄細胞を回収し、24時間培養した後、細胞懸濁液を移し、さらに24時間培養した。収集された二次接着細胞には、多数のBMMが含まれていた。培養後、二次付着細胞は徐々に精製され、安定で均一になった。フローサイトメトリーの結果は、CD11b/c陽性細胞の割合が約37.94%に達したことを実証した。さらに、TRAP染色およびウェスタンブロット分析は、抽出されたBMMが破骨細胞に分化し得ることを示した。この知見は、二次付着法によって抽出されたBMMが破骨細胞22に首尾よく分化され得ることも示唆する以前の研究と一致した。
二次アドヒアランス法は、ハイテクラボ機器を必要とせずに、骨髄から単核球マクロファージを簡単かつ迅速に抽出するために使用できます。同時に、この方法は、小さな骨髄サンプルから細胞を単離するのに適しており、したがって、単核球マクロファージを抽出するために一般的に使用される以前の方法で観察された面倒で時間のかかる困難を克服する。全体として、二次アドヒアランス法によって抽出されたBMMは、インビトロで破骨細胞に分化させることに成功し、破骨細胞のインビトロ研究のための安定した細胞モデルを提供することができた。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、浙江省自然科学財団の支援を受けました(助成金番号。LY19H060001)および浙江省漢方薬科学技術計画プロジェクト(番号2022ZB093)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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