Summary
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria.
Abstract
Con una disminución de la densidad mineral ósea, los huesos tienen más probabilidades de fracturarse, lo que afecta negativamente la calidad de vida de un paciente. El crecimiento y desarrollo de los huesos están regulados principalmente por osteoblastos y osteoclastos. Se ha aceptado ampliamente que los osteoclastos se derivan de las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea (BMM). LosBMm y otras células madre hematopoyéticas se encuentran en la cavidad de la médula ósea. Por lo tanto, aislar BMM estables individuales de poblaciones celulares diferentes y heterogéneas es un gran desafío. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria. Se recogieron células adherentes cultivadas durante 24-48 h en cultivo primario. El análisis citométrico de flujo mostró que aproximadamente el 37,94% de las células eran CD11b/c+ (antígeno de superficie monocito-macrófago). La tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y el análisis de western blot demostraron que losBMM podían diferenciarse en osteoclastos in vitro. Los hallazgos anteriores sugirieron que las células de adherencia secundaria podrían considerarse como un modelo celular adecuado para la investigación de la diferenciación de osteoclastos.
Introduction
Se ha informado que las células del linaje monocitos-macrófagos existentes en la médula ósea pueden diferenciarse en monocitos sanguíneos y macrófagos tisulares 1,2. Las células anteriores, que pueden diferenciarse en osteoclastos para equilibrar el crecimiento y desarrollo óseo, se utilizan comúnmente como modelo celular para inducir osteoclastos in vivo 3,4. La médula ósea es un tejido especial que contiene varios tipos diferentes de células, que incluyen, entre otras, células madre mesenquimales de la médula ósea, células de monocitos-macrófagos (BMM) de la médula ósea, células madre hematopoyéticas, células endoteliales y células inmunes. De hecho, varios estudios previos sugirieron que las células adherentes que salían precipitadas de la cavidad de la médula ósea del hueso largo podrían diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos 5,6,7,8. Aunque se han utilizado diferentes métodos de aislamiento y cultivo para producir diferentes poblaciones celulares homogéneas, todavía existen grandes desafíos para aislar y cultivar BMM de una variedad de tipos de células diferentes.
Se han desarrollado varios métodos para extraer macrófagos mononucleares de médula ósea (BMSC). Sin embargo, la mayoría de estos métodos son complejos 9,10,11. Por ejemplo, la centrifugación por gradiente de densidad requiere un kit especializado y la operación requiere mucho tiempo y es engorrosa. Este método es adecuado para el aislamiento de BMM a partir de muestras de sangre de alto volumen, pero no de muestras de médula ósea 9,12,13. Además, la extracción de muestras de tejido mediante la digestión de la colagenasa es un procedimiento complejo y lento; este método no se recomienda para el aislamiento de BMM a partir de muestras de médula ósea14,15. Además, aunque la separación de flujo puede resultar en poblaciones de monocitos/macrófagos altamente purificadas, requiere tamaños de muestra muy grandes y altos requisitos de instrumentos y equipos10,16. Además, el método de enriquecimiento de microperlas es extremadamente costoso y no es factible en un laboratorio general17.
Por lo tanto, en el estudio actual se propuso un método conveniente, rápido y barato para el aislamiento de macrófagos mononucleares de la médula ósea. Las células de la médula ósea adheridas durante diferentes puntos de tiempo se utilizaron para aislar BMM utilizando un método de adherencia secundaria. Los BMM extraídos con el método anterior podrían inducir la formación de osteoclastos in vitro, proporcionando así un modelo celular simple y conveniente para el futuro estudio de la osteoporosis in vitro.
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Protocol
Todos los experimentos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de experimentación con animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica China de Zhejiang (Número de aprobación: IACUC-20181029-11).
1. Extracción celular
- Coloque a las ratas Sprague-Dawley (ratas SD, de 1 a 10 días de edad, macho o hembra) en las jaulas de eutanasia llenas de CO2 a una tasa equilibrada de 30% -70% de volumen / minuto del contenedor. Después de que las ratas pierden el conocimiento (20-60 min), eutanasia a la rata por dislocación cervical para asegurar una muerte indolora.
- Sumergir a las ratas en alcohol al 75% durante 10 min para su desinfección.
- Retire cuidadosamente todas las extremidades de la rata con tijeras y fórceps, aspire con PBS usando una pipeta y enjuague la sangre adherida a las extremidades.
- Agregue 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina en 500 ml de DMEM y mezcle bien. Tome un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, agregue 5 ml de FBS y 45 ml de medio DMEM, y mezcle bien para obtener una solución de DMEM de FBS al 10% que contenga una solución de penicilina / estreptomicina al 1%. Agregue 2 ml del medio de cultivo anterior en un tubo de 5 ml.
- Transfiera los huesos de las extremidades al tubo de 5 ml. Use tijeras para cortar los huesos de las extremidades en el tubo en trozos pequeños (1-3 mm) y mezcle el homogeneizado para volver a suspender las células de la médula ósea en el medio de cultivo. Párese durante 5 minutos hasta que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.
- Agregue 10 ml de DMEM fbs al 10% en un plato de cultivo de 100 mm y luego transfiera el sobrenadante al plato de cultivo. Al aspirar el sobrenadante, evite transferir los restos de tejido a la placa de cultivo.
- Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante aproximadamente 24 h. Después de este tiempo de incubación, la mayoría de las células madre mesenquimales se adherirán a la pared del plato de cultivo y crecerán lentamente, mientras que la mayoría de losBM aún estarán suspendidos en el medio de cultivo.
- Transfiera la suspensión celular en el plato de cultivo de 100 mm a un nuevo matrazde 25 cm 2 y continúe cultivando las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h adicionales. LosBMM se adherirán a la pared del matraz a las 24-48 h de cultivo. Retire el medio viejo con cuidado y reemplácelo con medio fresco después de que losBM se hayan adherido a la pared del matraz.
- Subcultivo cuando las células en el matraz alcanzaron una confluencia del 80%-90%.
NOTA: Todas las células se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2. Durante el cultivo, la morfología celular se unificó gradualmente. Las células eran grandes, de forma irregular, crecían radialmente y se unían al matraz en forma de disco, donde se podían observar múltiples núcleos.
2. Tinción FACS de la célula
- La tripsina digiere utilizando 1-2 ml de tripsina comercial a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min y cuenta las células adherentes secundarias para asegurar un recuento final de células de 100.000/muestra (cuenta las células con hemocitómetro neubauer).
- Divida las células en tres grupos (500 μL de PBS contiene 100.000 células): (1) el grupo de control en blanco que contiene células no teñidas; (2) el grupo de control de isotipos; y (3) el grupo experimental (tinción CD11b/c).
- Incubar anticuerpos primarios (sin anticuerpo para el grupo de control en blanco; control de isotipo anti-CD11 para el grupo de control de isotipo, 0,6 μL de anticuerpo/muestra, 1 μg/muestra; anti-CD11b/c para el grupo experimental, 1 μL de anticuerpo/muestra, 1 μg/muestra) en hielo durante 30 min.
- Centrifugar a 300-350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 μL de PBS. Repita el procedimiento anterior una vez para asegurarse de que los anticuerpos primarios no unidos se eliminen.
- Incubar el anticuerpo secundario correspondiente (sin anticuerpo para el grupo de control en blanco; IgG anti-conejo de cabra para el control de isotipos y los grupos experimentales, anticuerpo/muestra de 0,25 μL, 1:2.000) en hielo en la oscuridad durante 30 min.
- Centrifugar a 300-350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 μL de PBS. Repita el procedimiento anterior una vez para asegurarse de que los segundos anticuerpos no unidos se eliminen.
- Detecte las células CD11b/c positivas mediante citometría de flujo (10.000 células/muestra) y analice los datos por software (por ejemplo, FlowJo 7.5).
NOTA: Para obtener el porcentaje final de células CD11b/c+, se utilizó la siguiente fórmula: Porcentaje de células CD11b/c+ en el grupo experimental - el porcentaje de células CD11+ en el grupo control de isotipos.
3. Tinción wright-giemsa
- Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces sobre láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivar a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.
- Deseche el medio de cultivo y lave tres veces con PBS.
- Añadir la solución de colorante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) a la lámina de escalada celular durante 1 min.
- Mezcle el tinte con agua destilada (0.5 mL-0.8 mL) con un hisopo de algodón y descanse durante 10 min.
- Lave la solución de tinte con agua destilada y luego séquela durante 1-3 min. Observar bajo un microscopio.
4. Tinción TRAP
- Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces sobre láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivar a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.
- Reemplace el medio antiguo con el DMEM FBS al 10% o el medio de inducción de osteoclastos suplementado con 50 ng / ml activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL) y 30 ng / ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), y cultive a 37 ° C y 5% de CO2 durante 7 días adicionales.
- Manche las células con el kit de tinción TRAP de acuerdo con el protocolo del fabricante y observe bajo un microscopio.
NOTA: Las células TRAP-positivas se definieron como osteoclastos, que eran de color púrpura bajo un microscopio de luz. El número de células TRAP-positivas se midió utilizando el software ImageJ.
5. Western blot
- Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces en láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivo durante 24 h.
- Reemplace el medio antiguo con DMEM de FBS fresco al 10% o medio de inducción de osteoclastos (50 ng / ml de RANKL y 30 ng / ml de M-CSF) y cultive durante 7 días adicionales a 37 ° C y 5% de CO2.
- Extraer proteínas celulares totales con tampón RIPA, separadas por 10% SDS-PAGE, y transferir a membranas de fluoruro de polivinilideno18,19.
- Bloquee con polvo de leche desnatada al 5% (25 ml) durante 2 h y lave tres veces, durante 10 minutos cada vez, con TBS-Tween 20 (TBST).
- Incubar anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche (anti-β-actina, anti-TRAP y anti-catepsina K; todos los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1.000, 10 ml de anticuerpos/banda diluidos), y lavar tres veces con TBST.
- Incubar el anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra, dilución 1:2.000, anticuerpo/banda diluida de 10 ml) a temperatura ambiente durante 2 h, y lavar tres veces con TBST. Visualice las bandas de proteínas utilizando una solución en desarrollo.
NOTA: Los niveles de expresión de las proteínas anteriores se normalizaron a β-actina.
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Representative Results
La población secundaria de células adherentes fue estable y uniforme. Con la proliferación celular continua, la mayoría de las células se hicieron más grandes, con forma irregular y crecieron en un disco adherente radial (Figura 2C, D). La citometría de flujo mostró que el porcentaje de células que expresan CD11b/c, un marcador molecular en la superficie de las células del linaje monocito-macrófago, fue de aproximadamente el 37,94% (Figura 2A, B). Para verificar aún más que las células CD11b/c positivas eran células de linaje monocito-macrófago, se indujo la diferenciación de células adherentes secundarias en osteoclastos después del tratamiento celular con RANKL y M-CSF. Los resultados de la tinción TRAP mostraron que, en comparación con el grupo de control, el número de gránulos intracelulares de color rojo púrpura aumentó significativamente en las células inducidas con RANKL y M-CSF (Figura 2E, F). Además, los niveles de expresión de las proteínas específicas de osteoclasto TRAP y catepsina K aumentaron significativamente (Figura 2G,H).
Figura 1: Diagrama de flujo del método de extracción de células adherentes secundarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: (A-B) Después de tres generaciones de cultivo estable de células adherentes secundarias, se detectaron células CD11b/c positivas por citometría de flujo. (C-D) Se muestra la morfología de las células adherentes secundarias después de tres generaciones (C para la luz blanca, D para la tinción de Wright-Giemsa). (E-F) Se utilizó tinción TRAP para detectar el efecto de RANKL y M-CSF sobre la formación de osteoclastos (E para el control; F para RANKL y M-CSF). (G-H) Las células fueron tratadas con RANKL y M-CSF durante 7 días y los niveles de expresión de TRAP y catepsina K se determinaron mediante análisis de western blot. Los datos se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes. P < 0,001 frente al grupo control. TRAP, fosfatasa ácida resistente al tartrato; RANKL, activador del receptor del ligando del factor nuclear-κB; M-CSF, factor estimulante de colonias de macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Método para extraer macrófagos Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
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Discussion
Los osteoclastos son uno de los tipos celulares más importantes involucrados en la aparición y desarrollo de enfermedades óseas, así como uno de los principales objetos de investigación de enfermedades óseas20. Los monocitos/macrófagos pueden diferenciarse en osteoclastos. Dado que los macrófagos mononucleares (células RAW264.7) son demasiado caros de comprar y se activan fácilmente durante el cultivo, es difícil realizar experimentos de diferenciación in vitro utilizando esta línea celular. Aunque se han desarrollado varios métodos para extraer monocitos/macrófagos de la médula ósea, incluida la centrifugación por gradiente de densidad, la digestión de la colagenasa, el enriquecimiento de la microesfera y la citometría de flujo (Tabla 1), estos métodos requieren mucho tiempo, mientras que requieren altos volúmenes de muestra y equipos costosos. Por lo tanto, el estudio actual tuvo como objetivo proponer un método simple y rápido para extraer monocytec/macrófagos de muestras de médula ósea.
Hay muchas poblaciones celulares en la médula ósea, incluyendo BMSC, células endoteliales y células inmunes además de BMM. Como todos sabemos, las BMSC pueden diferenciarse en osteoblastos, y este proceso afectará la diferenciación de las BMM en osteoclastos21. LosBM uniformes y estables son factores importantes para inducir la diferenciación de osteoclastos in vitro, por lo que es particularmente importante considerar estos factores limitantes al aislar y extraer BMM. Al mismo tiempo, la capacidad de los BMM para diferenciarse en osteoclastos también se debilitará durante el paso continuo. Por lo tanto, es un desafío aislar losBM de la médula ósea e inducirlos con éxito en osteoclastos.
Encontramos que existen diferencias en el tiempo de adherencia de las células adherentes en la médula ósea. Más específicamente, los BMSC básicamente se adhirieron a la pared del plato de cultivo durante 0-24 h de cultivo, mientras que losBMM comienzan a adherirse a la pared del plato de cultivo después de 24 h. Sobre la base del hallazgo anterior, se seleccionó el método de adherencia secundaria para aislar a los BMM. Se seleccionaron ratas SD lactantes (edad, 1-10 días de edad) para extraer BMM, ya que los BMM de ratas jóvenes exhiben una mayor capacidad de diferenciación. Se recolectaron las células de la médula ósea de ratas SD, y después de cultivar durante 24 h, la suspensión celular se transfirió y se cultivó durante otras 24 h. Las células adherentes secundarias recolectadas contenían un gran número de BMM. Después del cultivo, las células adherentes secundarias se purificaron gradualmente y se volvieron estables y uniformes. Los resultados de la citometría de flujo demostraron que el porcentaje de células CD11b/c positivas alcanzó aproximadamente el 37,94%. Además, la tinción TRAP y el análisis de western blot mostraron que losBM extraídos podían diferenciarse en osteoclastos. Este hallazgo fue consistente con un estudio previo que también sugirió que los BMM extraídos por el método de adherencia secundaria podrían diferenciarse con éxito en osteoclastos22.
El método de adherencia secundaria se puede utilizar para extraer de forma simple y rápida macrófagos mononucleares de la médula ósea, sin necesidad de equipos de laboratorio de alta tecnología. Al mismo tiempo, este método es adecuado para aislar células de una pequeña muestra de médula ósea, superando así las dificultades engorrosas y lentas observadas en los métodos anteriores comúnmente utilizados para extraer macrófagos mononucleares. En general, los BMM extraídos por el método de adherencia secundaria podrían diferenciarse con éxito en osteoclastos in vitro, proporcionando así un modelo celular estable para el estudio in vitro de osteoclastos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención no. LY19H060001) y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de Zhejiang (no. 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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