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Biochemistry

स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स की संरचनाओं और सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने के लिए एक पाइपलाइन

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

एस 1 पी एस 1 पी रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) उपपरिवार के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है। यहां, एस 1 पीआर की संरचनाओं और कार्य पर विस्तार करने के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन किया गया है।

Abstract

लाइसोफॉस्फोलिपिड्स (एलपीएल) बायोएक्टिव लिपिड हैं जिनमें स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट (एस 1 पी), लाइसोफॉस्फेटिडिक एसिड आदि शामिल हैं। एस 1 पी, कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, सबसे अच्छी विशेषता वाले एलपीएल में से एक है जो स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से विभिन्न प्रकार की सेलुलर शारीरिक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है। इससे पता चलता है कि एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग सिस्टम मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), ऑटोइम्यून विकार, कैंसर, सूजन और यहां तक कि सीओवीआईडी -19 सहित विकारों के लिए एक उल्लेखनीय संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है। एस 1 पीआर, वर्ग ए जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) परिवार का एक छोटा सबसेट, पांच उपप्रकारों से बना है: एस 1 पीआर 1, एस 1 पीआर 2, एस 1 पीआर 3, एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5। विस्तृत संरचनात्मक जानकारी की कमी, हालांकि, एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली दवा की खोज में बाधा डालती है। यहां, हमने एस 1 पी-एस 1 पीआर कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि लागू की, और सेल-आधारित कार्यात्मक परख का उपयोग करके सक्रियण, चयनात्मक दवा मान्यता और जी-प्रोटीन युग्मन के तंत्र को स्पष्ट किया। इस रणनीति का उपयोग करके अन्य लाइसोफॉस्फोलिपिड रिसेप्टर्स (एलपीएलआर) और जीपीसीआर का भी अध्ययन किया जा सकता है।

Introduction

स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट (एस 1 पी), कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, एक सर्वव्यापी लाइसोफॉस्फेटिडिक सिग्नलिंग अणु है जिसमें लिम्फोसाइट तस्करी, संवहनी विकास, एंडोथेलियल अखंडता और हृदय गति 1,2,3 सहित विभिन्न जैविक गतिविधियां शामिल हैं। एस 1 पी पांच एस 1 पी रिसेप्टर उपप्रकारों (एस 1 पीआर 1-5) के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है; एस 1 पीआर विभिन्न प्रकार के ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में सीएमपी उत्पादन को रोकता है; एस 1 पीआर 2 और एस 1 पीआर 3 जीआई, जीक्यू और जी 12/13 के साथ युग्मित हैं, और एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5 जीआई और जी 12/136 के माध्यम से सिग्नल को स्थानांतरित करते हैं।

एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग ऑटोइम्यून विकार7, सूजन8, कैंसर 9 और यहां तक कि सीओवीआईडी -19 10 सहित कई बीमारियों के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य है। 2010 में, फिंगोलिमोड (एफटीवाई 720) को रिलैप्स मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 11 के इलाज के लिए एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली प्रथम श्रेणी की दवा के रूप में लाइसेंस दिया गया था। हालांकि, यह एस 1 पीआर 2 को छोड़कर सभी एस 1 पीआर को बांधने में सक्षम है, जबकि एस 1 पीआर 3 के लिए निरर्थक बाध्यकारी के परिणामस्वरूप सेरेब्रल कॉर्टेक्स, संवहनी और ब्रोन्कियल कसना, और फेफड़ों के उपकला रिसाव12 की सूजन होती है। चिकित्सीय चयनात्मकता बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में, रिसेप्टर के लिए उपप्रकार-विशिष्ट लिगेंड का उत्पादन किया गया है। सिपोनिमोड (बीएएफ 312) को 2019 में रिलैप्स एमएस उपचार13 के लिए अनुमोदित किया गया था; यह प्रभावी रूप से एस 1 पीआर 1 और एस 1 पीआर 5 को लक्षित करता है, जबकि इसका एस 1 पीआर 3 के लिए कोई संबंध नहीं है, नैदानिक अभ्यास14 में कम दुष्प्रभाव प्रदर्शित करता है। 2020 में, यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन ने एमएस थेरेपी15 के लिए ओज़ानिमोड को अधिकृत किया। यह बताया गया है कि ओज़ानिमोड एस 1 पीआर 516 की तुलना में एस 1 पीआर 1 के लिए 25 गुना अधिक चयनात्मकता रखता है। विशेष रूप से, वर्तमान कोविड-19 महामारी के संदर्भ में, यह पता चला है कि एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली एगोनिस्ट दवाओं का उपयोग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी थेरेपी तकनीकों 17 का उपयोग करकेकोविड-19 के इलाज के लिए किया जा सकता है। फिंगोलिमोड की तुलना में, ओज़ानिमोड ने कोविड-19 रोगियों में लक्षणों को कम करने में श्रेष्ठता दिखाई है और अब नैदानिकपरीक्षणों से गुजर रहा है। एस 1 पीआर के संरचनात्मक आधार और कार्य को समझना एक दवा विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण नींव रखता है जो चुनिंदा एस 1 पीआर18 को लक्षित करता है।

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) सहित बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक जानकारी की जांच के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। मार्च 2022 तक, प्रोटीन डेटाबैंक (पीडीबी) पर 180,000 से अधिक संरचनाएं जमा हैं, और उनमें से अधिकांश को एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया गया है। हालांकि, 201319 में यिफान चेंग और डेविड जूलियस द्वारा रिपोर्ट किए गए टीपीआरवी 1 (3.4 ए रिज़ॉल्यूशन) की पहली निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना के साथ, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रोटीन संरचनाओं के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक बन गई है, और ईएम पीडीबी संरचनाओं की कुल संख्या 10,000 से अधिक थी। महत्वपूर्ण सफलता क्षेत्र इमेजिंग के लिए नए कैमरों का विकास हैं जिन्हें प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्शन कैमरे और नई छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के रूप में जाना जाता है। क्रायो-ईएम ने पिछले एक दशक में संरचना जीव विज्ञान और संरचना-आधारित दवा की खोज में क्रांतिला दी है। यह समझने के रूप में कि मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स जीवित कोशिका में अपनी जटिल भूमिकाओं को कैसे पूरा करते हैं, जैविक विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, क्रायो-ईएम में गतिशील आणविक परिसरों के विरूपण को प्रकट करने की क्षमता है, विशेष रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन21 के लिए। जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का सबसे बड़ा सुपरफैमिली है और वर्तमान में विपणन किए गए फार्मास्यूटिकल्स22 के 30% से अधिक के लक्ष्य हैं। क्रायो-ईएम के विकास ने जीपीसीआर-जी प्रोटीन परिसरों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के फटने में योगदान दिया है, जो 'असभ्य' लक्ष्यों के लिए संरचनात्मक निर्धारण को सक्षम करता है जो अभी भी दवा डिजाइन23 में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण के लिए सुलभ नहीं हैं। इसलिए, क्रायो-ईएम एप्लिकेशन परमाणु रिज़ॉल्यूशन24 के करीब निकट-देशी स्थितियों में जीपीसीआर की त्रि-आयामी संरचना को निर्धारित करने का मौका प्रदान करता है। क्रायो-ईएम में प्रगति जीपीसीआर उत्तेजना या निषेध के यंत्रवत आधार की कल्पना करना संभव बनाती है, और जीपीसीआर-लक्षित दवा निर्माण25 के लिए उपन्यास बाध्यकारी साइटों को उजागर करने में और लाभ उठाती है।

क्रायो-ईएम प्रौद्योगिकी की जबरदस्त प्रगति पर भरोसा करते हुए, हमने हाल ही में26,27 एस 1 पीआर 1-, एस 1 पीआर 3-, और एस 1 पीआर 5-जीआई सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं की पहचान की है। मनुष्यों में, एस 1 पीआर विभिन्न ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में 3', 5'-चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) उत्पादन को रोकता है। एस 1 पीआर 3 और एस 1 पीआर 5 जीआई 6,28 के साथ युग्मन करने में भी सक्षम हैं। चूंकि जीआई-युग्मित रिसेप्टर सक्रियण सीएमपी29 के उत्पादन को कम करता है, इसलिए कार्यात्मक परिवर्तन26,27 पर कब्जा करने के लिए सीएमपी निषेध प्रभावों को मापने के लिए एक जीआई-निषेध सीएमपी परख पेश की गई थी। फोटिनस पाइरालिस ल्यूसिफेरेज़ के एक उत्परिवर्ती संस्करण का उपयोग करना जिसमें एक सीएमपी-बाध्यकारी प्रोटीन मॉइटी डाला गया है, यह सीएमपी परख इंट्रासेल्युलर सीएमपी एकाग्रता30 में परिवर्तन के माध्यम से जीपीसीआर गतिविधि की निगरानी के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। यह एक संवेदनशील और गैर रेडियोधर्मी कार्यात्मक परख है और दवा की खोज प्रयोजनों के लिए जीपीसीआर की एक विस्तृत श्रृंखला के वास्तविक समय डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग की निगरानी के लिए लागू किया जा सकताहै।

यहां, एस 1 पीआर के सक्रियण और दवा मान्यता मोड को हल करने में महत्वपूर्ण तरीकों का सारांश प्रदान किया गया है, जिसमें मुख्य रूप से क्रायो-ईएम जोड़तोड़ और जीआई-निषेध सीएमपी परख शामिल हैं। इस लेख का उद्देश्य जीपीसीआर की संरचनाओं और कार्यों में आगे के अन्वेषणों के लिए व्यापक प्रयोगात्मक मार्गदर्शन प्रदान करना है।

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Protocol

1. एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का शुद्धिकरण

  1. मानव एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए, सी-टर्मिनल अवशेषों 338-382 की कमी वाले एस 1 पीआर 1 के सीडीएनए को क्लोन करें, सी-टर्मिनस पर 345-398 के साथ जंगली प्रकार के जीआई 1, और जंगली प्रकार के जीआई 1 को पीफास्टबैक 1 वेक्टर और जंगली प्रकार के जीडीएनए में क्लोन करें।
    नोट: एस 1 पीआर के लिए सभी निर्माणों में एन-टर्मिनस पर फ्लैग एपिटोप टैग और सी-टर्मिनस पर 10 x उसका टैग के बाद हेमाग्लूटिनिन (एचए) सिग्नल अनुक्रम भी होता है। इसके अलावा, रिसेप्टर अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण की सुविधा के लिए टी 4 लाइसोजाइम (टी 4 एल) का अनुवाद करने के लिए एक सिंथेटिक डीएनए अनुक्रम (सामग्री की तालिका) एस 1 पीआर के एन-टर्मिनस में डाला गया था।
  2. एस 1 पीआर, जीआई 1, और जीβ1γ2 को एन्कोडिंग करने वाले बैकुलोवायरस की तैयारी
    1. पुनः संयोजक वैक्टर को -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल ट्यूब में संग्रहीत डीएच 5α सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) के 50 μL में जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गर्मी-झटका, उन्हें तुरंत बर्फ में स्थानांतरित करें, और उन्हें 2 मिनट के लिए ठंडा करें।
    3. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम के 300 μL के साथ पूरक के बाद 3-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिलाएं। एलबी अगर प्लेट के लिए कोशिकाओं की प्लेट 100 μL और 48 घंटे के लिए अंधेरे में रखकर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. एमएल कनामाइसिन, 10 μg / एमएल टेट्रासाइक्लिन, और 7 μg / एमएल जेंटामाइसिन युक्त एलबी माध्यम के 5 मिलीलीटर में सफेद कॉलोनी को टीका लगाएं, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
    5. पी 0 बैकुलोवायरस के उत्पादन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्लास्मिड मिनीप्रेप किट (सामग्री की तालिका) के साथ पुनः संयोजक बैक्मिड को अलग करें।
      नोट: उपयोग से पहले, शुद्ध बैक्मिड का विश्लेषण पीसीआर द्वारा पीयूसी / एम 13 फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों के साथ किया गया था। पीसीआर के लिए, चक्रों की संख्या = 30 चक्र, पिघलने का तापमान = 58 डिग्री सेल्सियस, और विस्तार समय = 1 मिनट प्रति 1 केबी।
    6. पहले के प्रोटोकॉल32 में वर्णित पी 0 बैकुलोवायरस तैयार करें।
      1. संस्कृति छह अच्छी तरह से प्लेटों में एसएफ 9 कोशिकाओं (ईएसएफ 9 21 मध्यम) और सत्यापित करें कि कोशिकाएं लॉग चरण (1.0-1.5 x 106 कोशिकाओं /
      2. ग्रेस के माध्यम के 100 μL में बैकुलोवायरस अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 μL पतला, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। ग्रेस के माध्यम के 100 μL में पुनः संयोजक बैक्मिड के 10 μg पतला, और धीरे से मिश्रण. पतला बैकुलोवायरस अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ पतला बैक्मिड को मिलाएं, धीरे-धीरे मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. कोशिकाओं (चरण 1.2.6.1) पर मिश्रण (बैक्मिड और अभिकर्मक) जोड़ें, और उन्हें 3 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट करें।
      4. ग्रेस के माध्यम को हटा दें और इसे ईएसएफ 9 21 सेल संस्कृति माध्यम के 2 एमएल के साथ बदलें। 27 डिग्री सेल्सियस पर छह अच्छी तरह से प्लेटों और अभिकर्मक के बाद 5 दिनों के बाद ईएसएफ 9 21 सेल संस्कृति माध्यम इकट्ठा।
      5. कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला को 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। यह पी0 बैकुलोवायरस स्टॉक है।
    7. पी 1 वायरस स्टॉक को अलग करें
      1. एक शंक्वाकार बोतल में एसएफ 9 कोशिकाओं के 30 एमएल स्थानांतरण, 270 आरपीएम पर मिलाते हुए 27 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, और सत्यापित करें कि कोशिकाएं लॉग चरण (1.0-1.5 x 106 कोशिकाओं /
      2. बोतल में पी 0 वायरस स्टॉक के 2 एमएल जोड़ें और 27 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए 270 आरपीएम पर हिलाएं।
      3. कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,800 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला को 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। यह पी 1 बैकुलोवायरस स्टॉक है।
    8. बैकुलोवाइरल स्टॉक को बढ़ाएं
      1. लॉग चरण (1.0-1.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल) और पी 1 स्टॉक के 1 एमएल में एसएफ 9 कोशिकाओं के 50 एमएल का उपयोग करके चरण 1.2.7 दोहराएं।
      2. परिणामी पी 2 बैकुलोवायरस स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, इसे प्रकाश से बचाएं।
        नोट: बेकुलोवायरस को अनिश्चित काल तक न बढ़ाएं, क्योंकि हानिकारक म्यूटेंट प्रत्येक मार्ग के साथ उत्पादित किए गए थे।
  3. एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की अभिव्यक्ति
    1. एमएल घनत्व तक पहुंचने के लिए संस्कृति एसएफ 9 कीटकोशिकाएं , पी 2 बैकुलोवायरस एन्कोडिंग एस 1 पीआर, जीआई 1, और जीβ1γ2 के साथ सह-संक्रमित 1: 2: 1 की मात्रा अनुपात में, और 48 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर फिर से संस्कृति।
    2. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 700 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और उपयोग के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. प्रोटीन शोधन
    1. कमरे के तापमान पर चरण 1.3 में प्राप्त सेल गोली को पिघलना, और फिर इसे लाइसिस बफर (20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 50 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल 2, 5 एमएम सीएसीएल2) में 100 μg / एमएल बेंज़ामिडीन, 100 μg / एमएल ल्यूपेप्टिन, 100 μg / एमएल एप्रोटिनिन, 100 μg / एमएल एप्रोटिनिन, 25 μG / एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रेरित करने के लिए 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन को हिलाएं।
      नोट: एपिरेस एक एटीपी डिफॉस्फोहाइड्रोलेज है। यह एटीपी से गामा फॉस्फेट और एडीपी से बीटा फॉस्फेट को हटाने को उत्प्रेरित करता है।
    2. ट्यूबों के लिए समाधान स्थानांतरण, 10 मिनट के लिए 70,000 x g पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला ध्यान से हटा दें। घुलनशील बफर (20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, 5 एमएम सीएसीएल2, 0.5% (डब्ल्यू / वी) एलएमएनजी, 0.1% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस, 1% (डब्ल्यू / वी) सोडियम कोलेट, 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल) में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. निलंबन को एक गिलास डौंस में स्थानांतरित करें और गोली को पूरी तरह से होमोजेनाइज करें। एमएल बेंज़ामिडीन, 100 μg / एमएल ल्यूपेप्टिन, 100 μg / एमएल एप्रोटिनिन, और 25 एमयू / एमएल एपिरेज़ को निलंबन में जोड़ें, और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल करें।
      नोट: छर्रों को समरूप बनाने के चरण जीपीसीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    4. ट्यूबों के लिए समाधान स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    5. धोने के बफर (20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, 5 एमएम सीएसीएल2, 10 μM एगोनिस्ट, 0.0375% (डब्ल्यू / वी) एलएमएनजी, 0.0125% (डब्ल्यू / वी) जीडीएन, 0.0125% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस) के साथ ध्वज राल को पूर्व-संतुलित करें।
    6. ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ध्वज राल के साथ सेते हैं।
    7. उपरोक्त मिश्रण को ग्लास कॉलम पर लोड करें और कॉलम को 50 एमएल वॉशिंग बफर के साथ धो लें, जिसमें 100 μg / एमएल बेंज़ामिडीन, 100 μg / एमएल ल्यूपेप्टिन और 100 μg / एमएल एप्रोटिनिन शामिल हैं।
    8. 20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 200 μg / एमएल फ्लैग पेप्टाइड, 10 μM एगोनिस्ट, 0.0375% (w / v) एलएमएनजी, 0.0125% (डब्ल्यू / वी) जीडीएन, 0.0125% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस, 0.01% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस, 100 μg /
    9. एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,300 एक्स जी पर 100 केडीए कट-ऑफ कंसंट्रेटर का उपयोग करके 1 एमएल पर ध्यान केंद्रित करें। एक 0.22 μM फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर, और समुच्चय को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 x g पर अपकेंद्रित्र।
    10. एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) जेल निस्पंदन कॉलम पर लोड करें जो एसईसी बफर के साथ पूर्व-संतुलित होता है जिसमें 20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 10 μM एगोनिस्ट, 100 Μm टीसीईपी, 0.00375% (डब्ल्यू /
    11. शिखर अंशों को इकट्ठा करें और क्रायो-ईएम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,300 एक्स जी पर 100 केडीए कट-ऑफ कंसंट्रेटर का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करें।

2. एस 1 पीआर संरचना को हल करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. डेटा संग्रह
    1. क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने के लिए, चमक निर्वहन सफाई प्रणाली का उपयोग करके 10 एस के लिए 300-जाल एयू आर 1.2 / 1.3 ग्रिड और 15 एमए पर 60 एस के लिए चमक निर्वहन रखें।
    2. नमूना विट्रिफिकेशन करें जैसा कि पहले33,34 वर्णित है। डुबकी-ठंड कंसोल में, चैंबर काम के माहौल के लिए तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस और सापेक्ष आर्द्रता को 100% पर सेट करें। 0 के लिए धब्बा बल का उपयोग करें, 0 एस का प्रतीक्षा समय, 2 या 3 एस का धब्बा समय, और 0 एस का नाली समय। यह आमतौर पर एकल विट्रिफिकेशन के लिए 5-10 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता पर नमूने के केवल 3 μL की आवश्यकता होती है।
    3. ऑटो ग्रिड असेंबली में ग्रिड क्लिप और लोड करें, नैनोकैब में ऑटो ग्रिड असेंबली लोड करें, और ऑटोलोडर द्वारा माइक्रोस्कोप में नैनोकैब लोड करें जैसा कि पहले35 वर्णित है। ईपीयू 2 सॉफ्टवेयर के साथ स्क्रीन नमूना गुणवत्ता34. आमतौर पर, उपयुक्त बर्फ की मोटाई के क्षेत्रों में एकत्र किए गए डेटा बेहतर थे।
    4. क्रायो-ईएम डेटा एकत्र करें जैसा कि पहले35 विस्तार से वर्णित है। एस 1 पी रिसेप्टर के लिए, 50-65 ई-/ ए2 के एक्सपोजर इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ -1.0 μm और -1.8 μm के बीच डिफोकस ऑफसेट सेट करें। एस 1 पीआर 1-जीआई कॉम्प्लेक्स के लिए, 2 एस के कुल एक्सपोजर समय पर के 2 डिटेक्टर के साथ गिनती मोड में ईपीयू 2 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित रूप से मूवी स्टैक एकत्र करें, प्रति सेकंड पांच कच्चे फ्रेम की रिकॉर्डिंग दर, और प्रति स्टैक 35 फ्रेम काउत्पादन करने के लिए 56 ई - /
      नोट: आमतौर पर, रिसेप्टर संरचना के पुनर्निर्माण के लिए 5,000 से अधिक फिल्मों की आवश्यकता होती है।
  2. रेलियन के संयोजन का उपयोग करके डेटा को संसाधित करें36 और क्रायोस्पार्क37 एक आदर्श क्रायो-ईएम घनत्व मानचित्र प्राप्त करने के लिए। प्रारंभ में डेटा को संसाधित करने के लिए रेलियन-3.1_gpu_ompi4 का उपयोग करें जिसमें पहले वर्णित समान संचालन शामिल हैं34.
    1. लिनक्स सिस्टम टर्मिनल में, डेटा स्टोरेज निर्देशिका की मूल निर्देशिका दर्ज करें।
    2. रेलियन ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) खोलने के लिए टर्मिनल में रेलियन कमांड दर्ज करें।
      नोट: यदि यह पहली बार है जब इस निर्देशिका में एक रेलियन जीयूआई खोला गया है, तो एक प्रॉम्प्ट विंडो पॉप अप होगी; हाँ पर क्लिक करें.
    3. रेलियन में कच्चे डेटा को आयात करने के लिए रेलियन जीयूआई के दाईं ओर फ़ंक्शन बार में आयात करें पर क्लिक करें।
      1. मूवीज/माइक्स विकल्प में, रॉ इनपुट फ़ाइल फ़ील्ड में डेटा पथ दर्ज करें (वाइल्डकार्ड अनुशंसित हैं) में हाँ का चयन करें, और इन मल्टी-फ्रेम फिल्मों के लिए हाँ का चयन करें?. पिक्सेल आकार (एंगस्ट्रॉम) क्षेत्र में फिल्मों के पिक्सेल आकार, वोल्टेज (केवी) क्षेत्र में माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग वोल्टेज (केवी में) और गोलाकार विपथन (मिमी) क्षेत्र में माइक्रोस्कोप के गोलाकार विपथन दर्ज करें। ये वे पैरामीटर हैं जो डेटा संग्रह के समय दर्ज किए गए थे।
      2. चल रहा विकल्प में, जहाँ प्रोग्राम चल रहा है सर्वर के अनुसार कतार नाम संशोधित करें (अन्य फ़ंक्शंस को भी इस पैरामीटर को संशोधित करने की आवश्यकता है)। अन्य पैरामीटर को रेलियन द्वारा सेट किए गए डिफ़ॉल्ट मानों पर छोड़ दें। अंत में, जब सभी पैरामीटर सही ढंग से पाए जाते हैं, तो प्रोग्राम चलाने के लिए रन! क्लिक करें।
    4. सभी फ्रेम38 के संरेखण के लिए मोशन सुधार फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      1. आई/ओ विकल्प में, ब्राउज़ पर क्लिक करें और इनपुट मूवीज स्टार फ़ाइल के इनपुट के रूप में मूवीज.स्टार नामक आयात फ़ंक्शन का आउटपुट चुनें। ए2) फ़ील्ड में प्रति फ्रेम खुराक दर्ज करें जो फ्रेम की संख्या से विभाजित कुल खुराक के बराबर है। पावर स्पेक्ट्रा के योग को सहेजने के लिए नहीं का चयन करें?.
      2. मोशन विकल्प में, बी-फैक्टर के लिए 250, पैच एक्स, वाई की संख्या के लिए 5.5 और समूह फ्रेम के लिए 2 दर्ज करें (समूह >3 की खुराक सुनिश्चित करें)। यदि संग्रह अवधि के दौरान डेटा लाभ-संदर्भित नहीं था, तो एक लाभ-संदर्भ छवि की आवश्यकता होती है जिसे रिक्त ग्रिड क्षेत्र प्राप्त करके प्राप्त किया जा सकता है। उपयोग रेलियन के स्वयं के कार्यान्वयन के लिए नहीं का चयन करें? और मोशनसीओआर 2 निष्पादन योग्य फ़ील्ड में मोशनकोर 239की निष्पादन योग्य फ़ाइल वाली निर्देशिका को इनपुट करें।
      3. रनिंग विकल्प में, सर्वर की कंप्यूटिंग पावर के अनुसार उपयुक्त एमपीआई और थ्रेड नंबर चुनें; यहां, एमपीआई = 8 और धागे = 3 का उपयोग किया गया था।
    5. विट्रीफाइड नमूना40 की क्रायो-ईएम छवि को संशोधित करने के लिए सीटीएफ अनुमान फ़ंक्शन का उपयोग करें। आई/ओ विकल्प में, ब्राउज़ पर क्लिक करें और इनपुट मूवीज स्टार फ़ाइल के इनपुट के रूप में सही माइक्रोग्राफ.स्टार नामक मोशन कोर के आउटपुट का चयन करें। जीसीटीएफ विकल्प में, इसके बजाय उपयोग के लिए हाँ का चयन करें?.
    6. आरएलएनसीटीएफमैक्सरेज़ोल्यूटिन >4 के मान के साथ माइक्रोग्राफ को हटाने के लिए सबसेट चयन फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      1. आई/ओ विकल्प में, माइक्रोग्राफ.स्टार के दाईं ओर स्थित ब्राउज़ पर क्लिक करें या माइक्रोग्राफ.स्टार से चुनें और इनपुट के रूप में micrographs_ctf.स्टार नामक सीटीएफएफआईएनडी के आउटपुट का चयन करें। सबसेट विकल्प में, मेटाडेटा मानों के आधार पर चयन के लिए हाँ का चयन करें का चयन करें? और खराब डेटा निकालने के लिए अधिकतम मेटाडेटा मान के लिए 4 दर्ज करें।
    7. मैनुअल पिकिंग: प्रारंभिक पिक और वर्गीकरण के लिए मैन्युअल रूप से कुछ छवियों को चुनें।
      1. आई/ओ विकल्प में, ब्राउज़ पर क्लिक करें और इनपुट के रूप में पिछली चयन निर्देशिका (चरण 2.2.6) से micrographs_selected.स्टार चुनें।
      2. रन पर क्लिक करें ! (एक विंडो पॉप अप होती है)। नई विंडो के ऊपरी-बाएं कोने में फ़ाइल पर क्लिक करें और सभी छवियों के चयन को रद्द करने के लिए पलटें चयन पर क्लिक करें। प्रत्येक प्रविष्टि की इसी पंक्ति में सबसे बाएं चयन बॉक्स की जाँच करें और छवियों की जाँच करने के लिए पिक पर क्लिक करें और ~ 500 अच्छी छवियों का चयन करें। चयनित छवियों को सहेजने और विंडो बंद करने के लिए फ़ाइल > सहेजें चयन पर क्लिक करें।
    8. ऑटो-पिकिंग: स्वचालित कण पिकिंग सॉफ्टवेयर पैकेज उपयोगी और शक्तिशाली41 हैं।
      1. आई/ओ विकल्प में, ऑटोपिक के लिए इनपुट माइक्रोग्राफ के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और इनपुट के रूप में पिछली मैनुअलपिक निर्देशिका (चरण 2.2.7) से micrographs_selected.स्टार चुनें। लैप्लासियन-ऑफ-गाऊसी एल्गोरिथ्म का उपयोग शुरुआत में किया जाता है, इसलिए या के लिए हाँ का चयन करें: लैप्लासियन-ऑफ-गाऊसी का उपयोग करें।
      2. लैप्लासियन विकल्प में, एलओजी फिल्टर (ए) के लिए न्यूनतम व्यास को 80 और एलओजी फिल्टर (ए) के लिए अधिकतम व्यास को 130 पर सेट करें। ऑटोपिकिंग विकल्प में, न्यूनतम अंतर-कण दूरी (ए) को 65 पर सेट करें, और जीपीयू तक पहुँचा जा सकता है, तो जीपीयू त्वरण का उपयोग करने के लिए हाँ का चयन करें।
    9. अगले चरणों के लिए कणों को निकालें।
      1. आई/ओ विकल्प में, माइक्रोग्राफ स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.6 से micrographs_selected.स्टार चुनें। इनपुट निर्देशांक के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.8 से cords_suffix_autopick.स्टार चुनें।
      2. निकालें विकल्प में, रीस्केल कणों के लिए हाँ का चयन करें और बाद के चरणों को गति देने के लिए पुन: स्केल किए गए आकार (पिक्सेल) को 128 पर सेट करें।
    10. कणों के प्रारंभिक वर्गीकरण के लिए 2 डी वर्गीकरण
      1. आई/ओ विकल्प में, इनपुट छवियों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.9 से कण.स्टार चुनें। ऑप्टिमाइज़ेशन विकल्प में, कक्षाओं की संख्या 100 और मास्क व्यास (A) को 140 पर सेट करें।
      2. गणना विकल्प में, पूल किए गए कणों की संख्या 10 पर सेट करें, निर्देशिका दर्ज करें जो निर्देशिका फ़ील्ड को खरोंचने के लिए कॉपी कण में तेज स्थानीय ड्राइव (जैसे, एक एसएसडी ड्राइव) पर है, और तेजी से प्रसंस्करण गति के लिए जीपीयू त्वरण का उपयोग करने के लिए हां का चयन करें।
    11. कणों का चयन करने के लिए टेम्पलेट्स के रूप में अच्छे 2 डी परिणामों का चयन करने के लिए सबसेट चयन
      1. आई/ओ विकल्प में, मॉडल.स्टार से कक्षाओं का चयन करें के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और इनपुट के रूप में run_it025_model.स्टार नामक चरण 2.2.10 के आउटपुट का चयन करें। रन पर क्लिक करें!. पॉप-अप विंडो में, छवियों को सॉर्ट करें और रिवर्स सॉर्ट करें की जांच करें? और डिस्प्ले पर क्लिक करें!.
      2. ऑटो-पिकिंग फ़ंक्शन के संदर्भ के लिए संदर्भ के रूप में अच्छे प्रतिनिधि 2 डी परिणाम चुनें।
        नोट:: चयनित परिणाम लाल रंग में बॉक्सिंग कर रहे हैं। अच्छे और बुरे 2 डी वर्गीकरण परिणाम बाद में दिखाए जाते हैं।
      3. राइट-क्लिक करें और चयनित वर्ग सहेजें का चयन करें।
    12. ऑटो-पिकिंग के दूसरे दौर के लिए टेम्पलेट का उपयोग करें। आई/ओ विकल्प में, ऑटोपिक के लिए इनपुट माइक्रोग्राफ के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.6 से micrographs_selected.स्टार चुनें। 2 डी संदर्भों के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें, चरण 2.2.11 से class_averages.स्टार चुनें, और या के लिए नहीं का चयन करें: लैप्लासियन-ऑफ-गॉसिया एन का उपयोग करें।
    13. चरण 2.2.12 से coord_suffix_autopick.स्टार और चरण 2.2.6 से micrographs_selected.स्टार का उपयोग करके फिर से कण निष्कर्षण करें।
    14. चरण 2.2.13 से कणों.स्टार का उपयोग करके फिर से 2 डी वर्गीकरण करें।
    15. चरण 2.2.14 से run_it025_optimiser.स्टार का उपयोग करके फिर से सबसेट चयन करें।
      नोट: स्पष्ट आकृति और सही आकार के साथ सभी 2 डी छवियों को चुना जाना चाहिए।
    16. निम्नानुसार कण निष्कर्षण करें। आई/ओ विकल्प में, माइक्रोग्राफ स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें, चरण 2.2.6 से micrographs_selected.स्टार चुनें, और परिष्कृत कणों के लिए हाँ का चयन करें या परिष्कृत कणों को फिर से निकालें?. परिष्कृत कणों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.15 से कणों.स्टार का चयन करें।
    17. 3 डी प्रारंभिक मॉडल और एक संदर्भ मानचित्र उत्पन्न करना: आई / ओ विकल्प में, इनपुट छवियों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.16 से कण.स्टार चुनें। ऑप्टिमाइज़ेशन विकल्प में कक्षाओं की संख्या 1 पर सेट करें, और मास्क व्यास (ए) को 140 पर सेट करें।
    18. 3 डी वर्गीकरण और प्रारंभिक 3 डी मानचित्र उत्पन्न करना: आई / ओ विकल्प में, इनपुट छवियों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.16 से कण.स्टार चुनें। संदर्भ मानचित्र के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और चरण 2.2.17 से initial_model.एमआरसी चुनें। ऑप्टिमाइज़ेशन विकल्प में कक्षाओं की संख्या 4-6 और मास्क व्यास (ए) को 140 पर सेट करें।
    19. मास्क पीढ़ी: आई /ओ विकल्प में इनपुट के रूप में चरण 2.2.17 से अच्छे 3 डी मानचित्र (ओं) का चयन करें। प्रारंभिक बिनाराइजेशन थ्रेशोल्ड को 0.05 पर सेट करें (आउटपुट के आधार पर समायोजित करें), बाइनरी मैप को 3 तक कई पिक्सेल बढ़ाएं, और मास्क विकल्प में 8 में इस कई पिक्सेल के सॉफ्ट-एज जोड़ें।
    20. अगले प्रसंस्करण के लिए क्रायोस्पार्क का उपयोग करें।
    21. एक नया कार्यक्षेत्र बनाएं और पहली नौकरी के लिए जॉब बिल्डर पर क्लिक करें।
    22. कण स्टैक आयात करने के लिए, कण मेटा पथ फ़ील्ड में कण पथ (चरण 2.2.16) और कण डेटा पथ फ़ील्ड में फिल्म का पथ (चरण 2.2.16) दर्ज करें।
      नोट: वोल्टेज (केवी), गोलाकार विपथन (मिमी), और पिक्सेल आकार (एंगस्ट्रॉम) में तेजी लाने वाले पैरामीटर पहले की तरह ही हैं। आयाम कंट्रास्ट (अंश) मान 0.1 है।
    23. वॉल्यूम डेटा पथ में चरण 2.2.18 में श्रेष्ठ 3D वॉल्यूम का पथ दर्ज करके और आयात किए जा रहे वॉल्यूम के प्रकार के लिए मैप का चयन करके 3D वॉल्यूम आयात करें।
    24. वॉल्यूम डेटा पथ में मास्क पथ (चरण 2.2.19) दर्ज करके और आयात किए जा रहे वॉल्यूम के प्रकार के लिए मास्क का चयन करके मास्क आयात करें।
    25. गैर-समान शोधन: इनपुट के रूप में चरण 2.2.22, 2.2.23 और 2.2.24 के आउटपुट लें।
      नोट: यह फ़ंक्शन झिल्ली प्रोटीन के लिए बहुत उपयोगी है।
      1. गैर-समान शोधन के कणों (कण) के इनपुट के रूप में चरण 2.2.22 (imported_particles) के आउटपुट को खींचें, गैर-समान शोधन की मात्रा (वॉल्यूम) के इनपुट के रूप में चरण 2.2.23 (imported_volume_1) का आउटपुट, और गैर-समान शोधन के मुखौटा (मास्क) के इनपुट के रूप में चरण 2.2.24 (imported_mask_1) का आउटपुट।
        नोट: कभी-कभी मास्क के बिना बेहतर परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।
      2. क्लिक करें,कतारप्रसरण प्रारंभ करने के लिए।
    26. बेहतर परिणाम के लिए चरण 2.2.18-2.2.25 चलाएँ। प्रसंस्करण की उपरोक्त श्रृंखला के माध्यम से, एक अच्छा रिज़ॉल्यूशन एस 1 पीआर-जीआई 3 डी मानचित्र प्राप्त किया जा सकता है।

3. एस 1 पीआर-जीआई मध्यस्थता सीएमपी निषेध परख

नोट: एस 1 पीआर-जीआई मध्यस्थता सीएमपी निषेध प्रयोग को कई भागों में विभाजित किया गया था, और निम्नलिखित विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं हैं। प्रयोगात्मक सिद्धांत और सामान्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 1 में एक प्रवाह चार्ट के रूप में दिखाया गया है।

  1. प्लास्मिड निर्माण
    1. एन-टर्मिनस (सामग्री की तालिका) पर फ्लैग टैग के बाद एचए सिग्नल अनुक्रम के साथ वेक्टर पीसीडीएनए 3.1 + में जंगली प्रकार के एस 1 पीआर 1, एस 1 पीआर 3 और एस 1 पीआर 5 के सीडीएनए को उप-क्लोन करें।
      नोट: सभी रिसेप्टर्स के लिए उत्परिवर्तन उत्परिवर्तन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।
  2. प्लास्मिड की तैयारी
    1. पुनः संयोजक पीसीडीएनए 3.1+ वैक्टर या सेंसर प्लास्मिड (सामग्री की तालिका) को डीएच 5 α सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) के 50 μL में -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल ट्यूब में संग्रहीत अलग से जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गर्मी-झटका, उन्हें तुरंत बर्फ में स्थानांतरित करें, और उन्हें 2 मिनट के लिए ठंडा करें।
      नोट: जीआई-निषेध सीएमपी परख किट (सामग्री की तालिका) द्वारा प्रदान किया गया सेंसर प्लास्मिड एक संशोधित ल्यूसिफेरेज़ जीन को सीएमपी बाध्यकारी डोमेन के साथ जुड़ा हुआ व्यक्त करता है और सीएमपी बाध्य होने पर ल्यूमिनेसेंस गतिविधि को बढ़ाता है।
    2. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम के 300 μL के साथ पूरक करने के बाद 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिलाएं। एलबी अगर प्लेट के लिए कोशिकाओं की प्लेट 100 μL और 48 घंटे के लिए अंधेरे में रखकर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एमएल एम्पीसिलीन युक्त एलबी माध्यम के 5 मिलीलीटर में सफेद कॉलोनी को टीका लगाएं, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्लास्मिड मिनीप्रेप किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डीएनए को अलग करें; प्लास्मिड 1.7 और 1.9 के बीच ए260/ए280 के मूल्य के साथ 350 एनजी / μL से अधिक की एकाग्रता पर था।
  3. सेल संस्कृति
    1. 10 सेमी पेट्री डिश में सीएचओ-के 1 कोशिकाओं को प्लेट करें, उन्हें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति दें, और जब मोनोलेयर 80% -90% संगम पर हो तो उन्हें फसल दें।
    2. सीएचओ-के 1 कोशिकाओं के विकास माध्यम की आकांक्षा करें, पेट्री डिश पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए प्री-वार्म के 4 एमएल जोड़ें, और 15 एस के लिए सेते हैं। फिर, एफ 12 मध्यम + 10% एफबीएस से मिलकर 4 एमएल विकास माध्यम जोड़ें।
    3. पेट्री डिश के किनारे धीरे-धीरे लहराते और टैप करके पेट्री डिश सतह से कोशिकाओं को हटा दें। सेल निलंबन के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब भरें। हिलाओ और धीरे धीरे सेल गुच्छे को हटाने के लिए धीरे-धीरे पिपेट।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा, और पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ पुनर्जीवित। इस चरण को दोहराएं।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 एक्स जी पर हेमासाइटोमीटर, और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के साथ सेल संख्या निर्धारित करें।
    6. एस्पिरेट पीबीएस बफर और एफ 12 मध्यम और 10% एफबीएस से मिलकर विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ सीएचओ-के 1 कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
    7. छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एफ 12 मध्यम और 10% एफबीएस से युक्त विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर रखने के लिए प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के150 μL बीज जोड़ें। लगभग24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह से प्लेट सेते हैं।
  4. क्षणिक अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक अभिकर्मक बफर (सामग्री की तालिका) के 200 μL में डीएनए के 2 μg (चरण 3.2.3) पतला। 10 एस के लिए भंवर द्वारा मिलाएं और उपयोग करने से पहले संक्षेप में कताई करें।
      नोट: यहां, डीएनए के 2 μg में रिसेप्टर वेक्टर (S1PR1, S1PR3, या S1PR5) के 0.5 μg और सेंसर प्लास्मिड के 1.5 μg शामिल हैं।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक (सामग्री की तालिका), 10 एस के लिए भंवर के 4 μL जोड़ें, और उपयोग करने से पहले संक्षेप में स्पिन करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. धीरे-धीरे समान रूप से वितरित करने के लिए प्रत्येक कुएं (सीएचओ-के 1 कोशिकाओं युक्त) में अभिकर्मक मिश्रण के 200 μL ड्रॉप करें। पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए छह अच्छी तरह से प्लेट को धीरे से हिलाएं।
    4. एफ 12 मध्यम + 10% एफबीएस से युक्त सेल विकास माध्यम के साथ 4-6 घंटे के बाद अभिकर्मक माध्यम को बदलें, और इनक्यूबेटर को छह अच्छी तरह से प्लेट वापस करें।
    5. हार्वेस्ट कोशिकाएं 24-48 घंटे पोस्ट-अभिकर्मक।
      1. 15 एस के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म) के 500 μL के साथ कुएं पर सीएचओ-के 1 कोशिकाओं को पचाएं और एफ 12 मध्यम + 10% एफबीएस से मिलकर विकास माध्यम के 1 एमएल को जोड़ें। अच्छी तरह से सतह से कोशिकाओं को रॉकिंग और धीरे-धीरे कुएं के किनारे टैप करके हटा दें।
      2. एक शंक्वाकार ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 250 x g पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला डालो और ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं की कटाई करें।
        नोट: प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारण से पहले, एलिसा द्वारा रिसेप्टर्स की सेल सतह अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करें जैसा कि पहले26 वर्णित है।
  5. डी-लूसिफेरिन-पोटेशियम नमक के साथ संतुलन (सामग्री की तालिका)
    1. 3 मिलीलीटर परख बफर के साथ कटाई कोशिकाओं (24-48 घंटे पोस्ट-अभिकर्मक) को तुरंत निलंबित करें (यानी, हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) जिसमें 10 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.4 होता है), डी-लूसिफेरिन-पोटेशियम नमक के अतिरिक्त 3% वी /
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति सेल निलंबन के 90 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण।
    3. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारण
    1. डीएमएसओ में भंग सिपोनिमोड के अग्रिम 10 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें और लिगैंड उत्तेजना से पहले 25 μM फोर्स्कोलिन युक्त एचबीएसएस बफर का उपयोग करके एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाएं।
      नोट: लिगैंड के बिना नियंत्रण समूह को छोड़कर, शेष में 10-11-10-5 मोल / एल की एकाग्रता ढाल सीमा है।
    2. 30 मिनट के लिए विभिन्न सांद्रता पर एगोनिस्ट समाधान के 10 μL (अच्छी तरह से प्रति) के साथ उत्तेजित करें।
    3. संबंधित सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) मापदंडों का उपयोग करके माइक्रोप्लेट रीडर पर ल्यूमिनेसेंस संकेतों की गणना निम्नानुसार करें। डिटेक्शन विधि के लिए ल्यूमिनेसेंस, पढ़ने के प्रकार के लिए समापन बिंदु और प्रकाशिकी प्रकार के लिए ल्यूमिनेसेंस फाइबर का चयन करें। ऑप्टिक्स गेन को 255 पर सेट करें।
      नोट: प्रत्येक माप को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों में दोहराया गया था, प्रत्येक ट्रिप्लिकेट में।
    4. प्रतिदीप्ति संकेत के मूल्यों को प्राप्त करें, डेटा को स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात करें, और नॉनलाइनियर रिग्रेशन (वक्र फिट) खुराक-प्रतिक्रिया फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा को संसाधित करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोग का योजनाबद्ध चित्रण। प्रयोगात्मक सेटअप और निष्पादन के लिए एक विस्तृत चरण-वार गाइड। संक्षेप में, रिसेप्टर और संशोधित लूसिफेरेज़ को अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं में रिसेप्टर और सेंसर प्लास्मिड को ट्रांसफेक्ट करके सीएचओ-के 1 कोशिकाओं में क्षणिक रूप से सह-व्यक्त किया गया था। कोशिकाओं को डी-लूसिफेरिन-पोटेशियम नमक, ल्यूसिफेरेज़ सब्सट्रेट के साथ एचबीएसएस समाधान में निलंबित कर दिया गया था, और 24 घंटे के बाद 96-अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता दी गई थी। कोशिकाओं में पारगम्यता की अनुमति देने के लिए, डी-ल्यूसिफेरिन को कोशिकाओं के साथ पूर्व-संतुलित किया जाना चाहिए। ऑक्सीडेटिव एंजाइम ल्यूसिफेरेज़ लूसिफेरिन को ऑक्सीलुसिफेरिन में बदल देता है और प्रकाश का उत्सर्जन करता है। दूसरी ओर, संशोधित लूसिफेरेज़, सीएमपी से बंधे होने पर ही रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से प्रकाश उत्पन्न करता है, और प्रकाश की तीव्रता का कोशिकाओं में सीएमपी स्तरों के साथ सकारात्मक संबंध होता है। एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय जीपीसीआर के साथ सीएमपी के स्तर को विनियमित किया गया था। जीआई-युग्मित रिसेप्टर्स ने सीएमपी के स्तर को कम कर दिया, जिससे जीआई-निषेध सीएमपी प्रयोग में एडेनिल साइक्लेज को सक्रिय करने के लिए फोर्स्कोलिन के अलावा की आवश्यकता हुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स के नमूने को ठंडा करने से पहले, शुद्ध नमूने को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा अलग करने और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के साथ विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। चित्रा 2 एक उदाहरण के रूप में एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स दिखाता है। सजातीय जीपीसीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का शिखर अंश आमतौर पर आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2 ए) के ~ 10.5 एमएल पर स्थित था। एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स (चित्रा 2 बी) के एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण से एस 1 पीआर 3, जीयूआई, जीβ और एससीएफवी 16 के सैद्धांतिक बैंड के अनुरूप चार बैंड का पता चलता है, और इस प्रकार पता चलता है कि परिसर सफलतापूर्वक शुद्ध हो गया था। रिसेप्टर बैंड अक्सर संशोधन के विभिन्न डिग्री (ग्लाइकोसिलेशन या पामिटॉयलेशन) के कारण फैला हुआ पाया गया था, और जी का बैंड नहीं मिला था।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटीन शोधन परिणामों का विश्लेषण (ए) जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राम प्रोटीन के अनुरूप शिखर अंश दिखा रहा है। (बी) एसडीएस-पेज जेल वैद्युतकणसंचलन पैटर्न। इस आंकड़े को संदर्भ27 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स के जटिल अंशों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एकत्र और केंद्रित किया गया था। ग्रिड विट्रिफिकेशन और नमूना स्क्रीनिंग के लिए प्रक्रियाओं और प्रतिनिधि परिणामों पर पहले चर्चा की गई थी। दो अलग-अलग प्रसंस्करण प्लेटफार्मों का उपयोग करके एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए एक फ़्लोचार्ट (चित्रा 3) प्रस्तुत किया गया है: रेलियन -3 और क्रायोस्पार्क वी 3।

Figure 3
चित्रा 3: पीएफटीवाई 720-बाउंड एस 1 पीआर 3-जीआई-एससीएफवी 16 परिसरों का डेटा प्रोसेसिंग वर्कफ़्लो। पीएफटीवाई 720-एस 1 पीआर 3-जीआई-एससीएफवी 16 कॉम्प्लेक्स के क्रायो-ईएम डेटा प्रोसेसिंग फ्लोचार्ट को दिखाया गया है। प्रतिनिधि क्रायो-ईएम माइक्रोग्राफ ऑटो-पिकिंग, 2 डी वर्गीकरण औसत, 3 डी पुनर्निर्माण, और पीएफटीवाई 720-एस 1 पीआर 3-जीआई-एससीएफवी 16 कॉम्प्लेक्स के गैर-समान शोधन को आंकड़े में दिखाया गया है। इस आंकड़े को संदर्भ27 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्मों को पहले रेलियन -3 में आयात किया गया था, और बाद में औसत माइक्रोग्राफ उत्पन्न करने के लिए गति सुधार और सीटीएफ-अनुमान किया गया था। कणों और पुनरावृत्ति 2 डी वर्गीकरण को चुनकर, आगे की प्रक्रिया के लिए बेहतर कण प्राप्त किए गए थे। अच्छी तरह से परिभाषित 2 डी वर्गों के साथ कणों का चयन करना महत्वपूर्ण है जो स्पष्ट रूप से एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स (चित्रा 4 ए) की माध्यमिक संरचनात्मक जानकारी का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि खराब गुणवत्ता वाले कण बाद के प्रसंस्करण चरणों (चित्रा 4 बी) को बाधित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण होता है। 3 डी वर्गीकरण का उपयोग करते हुए, कणों को शोर कणों को बाहर करने, विभिन्न संभावित रचनाओं को अलग करने और कई 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए वर्गीकृत किया गया था। आखिरकार, एक एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स ईएम मानचित्र (चित्रा 5 ए) का उत्पादन फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) (चित्रा 5 बी) के माध्यम से अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ किया गया था, गैर-वर्दी शोधन के माध्यम से।

Figure 4
चित्रा 4: 2 डी वर्गों का चयन करना ( ए, बी) 2 डी वर्गीकरण से परिणाम। (ए) आगे की प्रक्रिया के लिए अच्छी तरह से परिभाषित वर्गों वाले 2 डी वर्ग औसत का चयन करें, और (बी) कम रिज़ॉल्यूशन और शोर वाले आंशिक कणों या कणों को अस्वीकार करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: pFTY720-बाध्य S1PR3-Gi-sFv16 परिसरों की उच्च संकल्प संरचना . (ए) pFTY720 बाध्य S1PR3 कॉम्प्लेक्स की उच्च संकल्प संरचना अच्छी तरह से परिभाषित क्रायो-ईएम घनत्व एस 1 पीआर 3 और जीआई प्रोटीन संरचना तत्वों का प्रतिनिधित्व प्रदर्शित करता है। (बी) पीएफटीवाई 720-बाउंड एस 1 पीआर 3-जीआई कॉम्प्लेक्स के लिए गोल्ड-स्टैंडर्ड फूरियर शेल सहसंबंध (एफएससी) वक्र। इस आंकड़े को संदर्भ27 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्रायो-ईएम के साथ एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को हल करके, हमने सेल में कार्यात्मक परख का उपयोग करके सक्रियण, चयनात्मक दवा मान्यता और जी-प्रोटीन युग्मन के तंत्र को स्पष्ट किया। जीआई-निषेध सीएमपी परख कोशिकाओं (चित्रा 1) में सीएमपी एकाग्रता के स्तर में परिवर्तन को मापता है, और इसका उपयोग अक्सर जीएस या जीआई के साथ युग्मित रिसेप्टर्स की सक्रियण शक्ति को मान्य करने के लिए किया जाता था।

प्रयोग प्रणाली में सेंसर प्लास्मिड के लिए रिसेप्टर की एकाग्रता अनुपात प्रयोगात्मक व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, कार्यात्मक विश्लेषण को प्रभावी ढंग से और सटीक रूप से करने के लिए, किसी को अधिकतम ईअधिकतम मूल्य के साथ एक प्लास्मिड एकाग्रता अनुपात चुनना चाहिए। इस प्रयोग में, सेंसर प्लास्मिड के रिसेप्टर के तीन एकाग्रता अनुपात (1: 1, 1: 3 और 1: 9) की जांच की गई थी। परिणामों से पता चला है कि एक अधिकतम ईअधिकतम मूल्य प्राप्त किया गया था जब सेंसर प्लास्मिड के लिए रिसेप्टर की एकाग्रता अनुपात 1: 3 (चित्रा 6) था।

Figure 6
चित्रा 6: खिड़की की अवधि पर सेंसर प्लास्मिड के लिए एस 1 पीआर 3 के विभिन्न एकाग्रता अनुपात के प्रभाव को सीएचओ-के 1 सेल लाइन में खोजा गया था। डेटा को ट्रिप्लिकेट में किए गए तीन स्वतंत्र प्रयोगों ± एसईएम के साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेंसर प्लास्मिड के लिए रिसेप्टर की एकाग्रता अनुपात के अलावा, इस प्रयोग में नियोजित सेल लाइनें भी महत्वपूर्ण थीं। अधिकांश रिसेप्टर्स के लिए एचईके 293 और सीएचओ-के 1 सेल लाइनों के बीच कोई पर्याप्त अंतर नहीं था। दूसरी ओर, सीएचओ-के 1 सेल लाइनों में एस 1 पीआर 3 (चित्रा 7) के लिए एचईके 2 9 3 कोशिकाओं की तुलना में अधिक यथार्थवादी समग्र वक्र था। इसलिए, सीएचओ-के 1 कोशिकाओं को एस 1 पीआर 3 के कार्यात्मक प्रयोग सत्यापन के लिए चुना गया था।

Figure 7
चित्रा 7: खिड़की की अवधि पर सेंसर प्लास्मिड के लिए एस 1 पीआर 3 के विभिन्न एकाग्रता अनुपात के प्रभाव का पता एचईके 2 9 3 सेल लाइन में लगाया गया था। डेटा को ट्रिप्लिकेट में किए गए तीन स्वतंत्र प्रयोगों ± एसईएम के साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम द्वारा एस 1 पीआर की संरचनाओं का निर्धारण करने और जीआई-मध्यस्थता सीएमपी निषेध परख द्वारा एस 1 पीआर की सक्रियण शक्ति को मापने के लिए एक प्राथमिक पाइपलाइन का वर्णन करता है। प्रयोग की सफलता के लिए कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं।

एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए, वायरस की गुणवत्ता और एसएफ 9 कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए। रिसेप्टर की अभिव्यक्ति खराब एसएफ 9 कोशिकाओं में नाटकीय रूप से कम हो जाती है। एसएफ 9 कोशिकाओं के स्वास्थ्य का आकलन उनके व्यास को मापकर किया गया था। स्वस्थ एसएफ 9 सेल का व्यास लगभग 15 μm है। एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स की उपज रिसेप्टर, जीआई और जीβγ वायरस के वॉल्यूम अनुपात से प्रभावित होती है जिसे इन विट्रो42 में एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को इकट्ठा करके दूर किया जा सकता है। इसके अलावा, जीपीसीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स हमेशा स्थिर नहीं होते हैं, और इस प्रकार नैनोबीआईटी रणनीति विकसित की गई थी और अक्सर जटिल43 को स्थिर करने के लिए लागू किया गया है।

नमूने की गुणवत्ता क्रायो-ईएम प्रयोग में सब कुछ के लिए नींव है। नमूना स्क्रीनिंग में एक एकत्रीकरण या पृथक्करण घटना अक्सर देखी गई है। कुछ दृष्टिकोण जीपीसीआर-जी-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स स्थिरीकरण में सहायक हो सकते हैं। एस 1 पीआर के सी-टर्मिनस अवशेष एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स प्रोजेक्ट26 में नमूना एकत्रीकरण का कारण बन सकते हैं। सिग्नलिंग मार्ग परख का उपयोग एस 1 पीआर26,27 के लिए स्वीकार्य सी-टर्मिनल अंत का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए। एलएमएनजी की एकाग्रता दूसरा सबसे आवश्यक कारक है; अत्यधिक डिटर्जेंट सांद्रता जीपीसीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को स्थिर कर सकती है, लेकिन वे इसके रिज़ॉल्यूशन को भी कम कर सकते हैं, जबकि कम सांद्रता विपरीत कर सकती है। कॉम्प्लेक्स को स्थिर करने में महत्वपूर्ण पहलू एक इष्टतम डिटर्जेंट एकाग्रता है जो जितना संभव हो उतना कम है। इसके अलावा, नमूने की एकाग्रता कभी-कभी एकत्र किए गए डेटा की मात्रा को प्रभावित कर सकती है। एक नमूना विट्रीफाइंग करते समय, हम अक्सर एक ढाल बनाते हैं। डेटा प्रोसेसिंग में, कण चयन और 2 डी या 3 डी वर्गीकरण में एल्गोरिदम की पसंद एस 1 पीआर-जी प्रोटीन परिसरों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से लिगेंड और ईसीएल मॉडलिंग के लिए; ईसीएल का घनत्व शियान लियू एट अल 42 द्वारा वर्णित साहित्य में हल किए गए एस 1 पीआर 1 संरचना में निरंतर पाया गया था और एस 1 पीआर 5 संरचनाओं26 में असंतत पाया गया था। जबकि सभी जीपीसीआर परिसरों के लिए इस समस्या का कोई सार्वभौमिक समाधान नहीं है, ईएम घनत्व मानचित्र में सुधार करने वाली किसी भी रणनीति की कोशिश की जानी चाहिए। विट्रिफिकेशन, डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण कदम पहले34,44 वर्णित किए गए थे।

क्रायो-ईएम द्वारा एस 1 पीआर की संरचनाओं को निर्धारित करने के बाद एस 1 पीआर लिगेंड की सक्रियण या निषेध शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक परख की आवश्यकता होती है। कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। जीआई-निषेध सीएमपी परख नियमित रूप से एगोनिस्ट के कारण कोशिकाओं में सीएमपी स्तरों में परिवर्तन की निगरानी करके रिसेप्टर सक्रियण शक्ति का मूल्यांकन करता है। ए) सेल संस्कृति, बी) अभिकर्मक, सी) प्लास्मिड रिसेप्टर (या उत्परिवर्तन) और सेंसर प्लास्मिड का तिल अनुपात, और डी) सेल प्रकार की पसंद एक सफल प्रयोग के लिए सभी महत्वपूर्ण हैं। कोशिकाओं का स्वास्थ्य अभिकर्मक दक्षता और रिसेप्टर या सेंसर अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है, जो प्रयोग के सिग्नल-टू-शोर अनुपात पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है। कोशिकाएं आमतौर पर 20 पीढ़ियों के बाद स्वस्थ होती हैं, हालांकि यह हमेशा ऐसा नहीं होता है। कोशिकाओं की स्थिति पर हमेशा नजर रखना महत्वपूर्ण है। सेल मार्ग के दौरान ट्रिप्सिन पाचन अवधि को कसकर प्रबंधित किया जाना चाहिए क्योंकि सेल की स्थिति का समय के साथ महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। अभिकर्मक अभिकर्मक कई सेल प्रकारों में रिसेप्टर अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं, और एक उपयुक्त सेल ब्रांड का चयन किया जाना चाहिए। जीआई-निषेध सीएमपी परख में सेंसर प्लास्मिड के लिए प्लास्मिड रिसेप्टर के तिल अनुपात को अनुकूलित किया जाना चाहिए। हम अक्सर रिसेप्टर और सेंसर प्लास्मिड के बीच तिल अनुपात की एक श्रृंखला चुनते हैं और रिसेप्टर म्यूटेंट के साथ जीआई-निषेध सीएमपी परख के लिए डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता की उच्चतम भिन्नता की पहचान करते हैं।

एलिसा परख 45 और नैनोबीआईटी46 जैसे विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों में सेलुलर सीएमपी स्तरों की निगरानी के लिए कुछ अन्यपरखों का उपयोग किया जाता है। सीएमपी एलिसा परख का उपयोग विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ बाध्य सीएमपी की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है। सीएमपी-विशिष्ट एंटीबॉडी को माइक्रोटाइटर प्लेट पर लंगर डाला जाता है और पेरोक्सीडेज सीएमपी ट्रेसर एंटीबॉडी के साथ बंधन के लिए सीएमपी के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। प्लेट से बंधे पेरोक्सीडेज सीएमपी ट्रेसर की मात्रा को फ्लोरोमेट्रिक परीक्षणों का उपयोग करके मापा जाता है जो सीएमपी की मात्रा के विपरीत आनुपातिक है। 2007 में, जियांग एट अल ने बायोल्यूमिनेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (बीआरईटी) तकनीक (वाईएफपी-एपैक-आरएलयूसी का उपयोग करके सीएमपी सेंसर) 46 का उपयोग करके विवो में सीएमपी के स्तर की निगरानी करने के लिए एक विधि विकसित की। नैनोबीआईटी-आधारित सीएमपी परख सीएमपी सेंसर एलजीबीआईटी-एपैक-एसएमबीआईटी लागू करता है, जो क्रमशः एलजीबीआईटी और एसएमबीआईटी के साथ वाईएफपी और आरएलयूसी को प्रतिस्थापित करता है, और इसका उपयोग रिसेप्टर और जी-प्रोटीन हेटरोट्रिमर के बीच जी-प्रोटीन हेटरोट्रिमर या युग्मन के पृथक्करण को मापने के लिए किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स के डेटा को सिचुआन विश्वविद्यालय में वेस्ट चाइना क्रायो-ईएम सेंटर और दक्षिणी विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय (एसयूएसटेक) में क्रायो-ईएम सेंटर में काटा गया था और सिचुआन विश्वविद्यालय में डुयू हाई-परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग सेंटर में संसाधित किया गया था। इस काम को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एलसी के 32100965, डब्ल्यूवाई के 32100988, जेडएस के 31972916) और सिचुआन विश्वविद्यालय के पूर्णकालिक पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फंड (2021 एससीयू 12003 से एलसी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

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जैव रसायन अंक 184
स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स की संरचनाओं और सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने के लिए एक पाइपलाइन
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Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

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