Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Конвейер для исследования структур и сигнальных путей рецепторов сфингозин-1-фосфата

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через подсемейство рецепторов S1P (S1PR). Здесь описан конвейер для объяснения структур и функций S1PR.

Abstract

Лизофосфолипиды (LPL) являются биологически активными липидами, которые включают сфингозин-1-фосфат (S1P), лизофосфатидную кислоту и т. Д. S1P, метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, является одним из наиболее характерных LPL, который регулирует различные клеточные физиологические реакции через сигнальные пути, опосредованные рецепторами сфингозин-1-фосфата (S1PR). Это означает, что сигнальная система S1P-S1PR является замечательной потенциальной терапевтической мишенью для расстройств, включая рассеянный склероз (РС), аутоиммунные расстройства, рак, воспаление и даже COVID-19. S1PR, небольшое подмножество семейства рецепторов, связанных с G-белком класса A (GPCR), состоит из пяти подтипов: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 и S1PR5. Однако отсутствие подробной структурной информации препятствует открытию лекарств, нацеленных на S1PR. Здесь мы применили метод криоэлектронной микроскопии для решения структуры комплекса S1P-S1PR и выяснили механизм активации, селективного распознавания лекарств и связи G-белка с помощью клеточных функциональных анализов. Другие лизофосфолипидные рецепторы (LPLR) и GPCR также могут быть изучены с использованием этой стратегии.

Introduction

Сфингозин-1-фосфат (S1P), метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, представляет собой вездесущую лизофосфатидную сигнальную молекулу, которая включает в себя различные биологические активности, включая торговлю лимфоцитами, развитие сосудов, эндотелиальную целостность и частоту сердечных сокращений 1,2,3. S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через пять подтипов рецепторов S1P (S1PRs 1-5); S1PR встречаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения для последующих G-белков 4,5. S1PR1 в первую очередь связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку цАМФ; S1PR2 и S1PR3 соединены с Gi, Gq и G12/13, а S1PR4 и S1PR5 передают сигнал через Gi и G12/136.

Передача сигналов S1P-S1PR является критически важной терапевтической мишенью для нескольких заболеваний, включая аутоиммунные расстройства7, воспаление8, рак9 и даже COVID-1910. В 2010 году финголимод (FTY720) был лицензирован как первый в своем классе препарат, нацеленный на S1PR для лечения рецидивирующего рассеянного склероза (РС)11. Тем не менее, он способен связываться со всеми S1PR, кроме S1PR2, в то время как неспецифическое связывание с S1PR3 приводит к отеку коры головного мозга, сужению сосудов и бронхов и утечке эпителия легких12. В качестве альтернативной стратегии повышения терапевтической селективности были получены подтип-специфические лиганды для рецептора. Сипонимод (BAF312) был одобрен в 2019 году для лечения рецидивирующего рассеянного склероза13; он эффективно нацелен на S1PR1 и S1PR5, тогда как он не имеет сродства к S1PR3, проявляя меньше побочных эффектов в клинической практике14. В 2020 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США разрешило озанимод для терапииРС 15. Сообщалось, что озанимод обладает в 25 раз большей селективностью для S1PR1, чем для S1PR516. Примечательно, что в контексте нынешней пандемии COVID-19 было обнаружено, что агонистические препараты, нацеленные на S1PR, могут быть использованы для лечения COVID-19 с использованием методов иммуномодулирующей терапии17. По сравнению с финголимодом, озанимод показал превосходство в снижении симптомов у пациентов с COVID-19 и в настоящее время проходит клинические испытания10. Понимание структурной основы и функции S1PR закладывает значительную основу для разработки препарата, который избирательно нацелен на S1PRs18.

Многие методы используются для исследования структурной информации биомакромолекул, включая рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронную микроскопию (ЭМ). По состоянию на март 2022 года в банке данных белка (PDB) хранится более 180 000 структур, и большинство из них были разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии. Тем не менее, с первой структурой TPRV1 с почти атомным разрешением (разрешение 3,4 Å), о которой сообщили Ифань Чэн и Дэвид Джулиус в 2013году 19, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала основным методом для белковых структур, и общее количество структур EM PDB составило более 10 000. Важнейшими областями прорыва являются разработка новых камер для визуализации, известных как камеры прямого обнаружения электронов, и новые алгоритмы обработки изображений. Крио-ЭМ произвел революцию в структурной биологии и структурно-ориентированном открытии лекарств за последнее десятилетие20. Поскольку понимание того, как макромолекулярные комплексы выполняют свои сложные роли в живой клетке, является центральной темой в биологических науках, крио-ЭМ имеет потенциал для выявления конформаций динамических молекулярных комплексов, особенно для трансмембранных белков21. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим надсемейством трансмембранных белков и мишенью для более чем 30% продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов22. Разработка крио-ЭМ способствовала всплеску структур с высоким разрешением белковых комплексов GPCR-G, что позволяет определять структуры для «трудноизлечимых» мишеней, которые все еще недоступны для рентгеновского кристаллографического анализа в конструкции лекарственного средства23. Следовательно, крио-ЭМ-приложение дает возможность определить трехмерную структуру GPCR в почти нативных условиях при близком к атомному разрешению24. Достижения в области крио-ЭМ позволяют визуализировать механистические основы стимуляции или ингибирования GPCR, а также дополнительную пользу в раскрытии новых сайтов связывания для создания GPCR-таргетных лекарств25.

Опираясь на огромные успехи крио-ЭМ технологии, мы недавно идентифицировали структуры агонизированных сигнальных комплексов S1PR1-, S1PR3- и S1PR5-Gi26,27. У людей S1PR обнаруживаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения в отношении последующих G-белков 4,5. S1PR1 в основном связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку 3',5'-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). S1PR3 и S1PR5 также способны сцепляться с Gi 6,28. Поскольку активация Gi-связанных рецепторов снижает выработку цАМФ29, был введен анализ Ги-ингибирования цАМФ для измерения эффектов ингибирования цАМФ для захвата функциональных изменений 26,27. Используя мутантную версию люциферазы Photinus pyralis, в которую был вставлен цАМФ-связывающий фрагмент белка, этот анализ цАМФ предлагает простой и надежный метод мониторинга активности GPCR через изменения внутриклеточной концентрации цАМФ30. Он представляет собой чувствительный и нерадиоактивный функциональный анализ и может применяться для мониторинга нисходящей сигнализации в режиме реального времени широкого спектра GPCR для целей обнаружения лекарств31.

Здесь приводится краткое изложение критических методов разрешения режимов активации и распознавания лекарств S1PR, в первую очередь включая крио-ЭМ-манипуляции и анализ Ги-ингибирования цАМФ. Целью этой статьи является предоставление всестороннего экспериментального руководства для дальнейших исследований структур и функций GPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Очистка белкового комплекса S1PRs-G

  1. Чтобы очистить человеческий белковый комплекс S1PRs-G, клонируют cDNAs S1PR1, лишенные C-концевых остатков 338-382, S1PR3 дикого типа S1PR3, S1PR5, усеченные с 345-398 на C-конце, и Дикий тип Gi1 в вектор pFastBac1 и cDNAs дикого типа Gβ1 и Gγ2 в вектор pFastBacdual (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все конструкции для S1RR также содержат последовательность сигналов гемагглютинина (HA), за которой следует эпитопная метка Flag на N-конце и 10-кратная его метка на C-конце. Кроме того, синтетическая последовательность ДНК (Таблица материалов) для трансляции лизоцима Т4 (T4L) была вставлена в N-конец S1PR, чтобы облегчить экспрессию и очистку рецепторов.
  2. Препарат бакуловируса, кодирующего S1PRs, Gi1 и Gβ1γ2
    1. Добавьте рекомбинантные векторы к 50 мкл dh5α-компетентной кишечной палочки (E. coli), хранящейся в пробирке объемом 1,5 мл при -80 °C, и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
    2. Тепловой удар по ячейкам при 42 °C в течение 90 с, немедленно перенесите их на лед и охладите в течение 2 мин.
    3. Встряхните пробирку при 37 °C в течение 3-5 ч после добавления 300 мкл среды лизогенного бульона (LB). Пластину 100 мкл клеток к пластине агара LB и инкубируют при 37 °C, выдерживая в темноте в течение 48 ч.
    4. Инокулируют белую колонию в 5 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 7 мкг/мл гентамицина, и культивируют при 37 °C в течение 16 ч.
    5. Изолируйте рекомбинантный бакмид с помощью плазмидного минипрепа (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя для получения бакуловируса P0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением очищенный бакмид анализировали методом ПЦР с помощью прямых и обратных праймеров pUC/M13. Для ПЦР число циклов = 30 циклов, температура плавления = 58 °C, а время продления = 1 мин на 1 Кб.
    6. Готовят панкуловирус P0, как описано в более раннем протоколе32.
      1. Культивируйте клетки sf9 (среда ESF921) в шестилуночных пластинах и убедитесь, что клетки находятся в фазе log (1,0-1,5 x 106 клеток/мл).
      2. Развести 8 мкл бакуловирусного трансфекционного реагента в 100 мкл среды Грейс и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Разбавьте 10 мкг рекомбинантного бакмида в 100 мкл среды Грейс и аккуратно перемешайте. Разбавленный бакмид соединить с разбавленным реагентом для трансфекции бакуловируса, аккуратно перемешать и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
      3. Добавьте смесь (бакмид и реагент) на клетки (этап 1.2.6.1) и нанесите на них пластины при температуре 27 °C в течение 3 ч.
      4. Удалите среду Grace и замените ее 2 мл клеточной культуральной среды ESF921. Обложите пластины с шестью лунками при 27 °C и соберите среду для культивирования клеток ESF921 через 5 дней после трансфекции.
      5. Центрифуга при 500 х г при 4 °C в течение 10 мин для удаления клеток и мусора. Переведите супернатант в пробирки по 2 мл. Это запас бакуловируса P0.
    7. Изолируйте запасы вирусов P1
      1. Переложите 30 мл клеток sf9 в коническую бутылку, культивируйте при 27 °C с встряхиванием при 270 об/мин и убедитесь, что клетки достигают логарифмической фазы (1,0-1,5 x 106 клеток/мл).
      2. Добавьте в бутылку 2 мл вирусного бульона P0 и встряхните при 270 об/мин в течение 4 дней при 27 °C.
      3. Переложите ячейки в трубку объемом 50 мл, центрифугу при 1 800 х г в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеток и мусора и перенесите супернатант в трубки объемом 50 мл. Это запас бакуловируса P1.
    8. Усиление бакуловирусного поголовья
      1. Повторите шаг 1.2.7, используя 50 мл ячеек sf9 в фазе журнала (1,0-1,5 x 106 ячеек/мл) и 1 мл запаса P1.
      2. Храните полученный запас бакуловируса Р2 при 4 °C, защищая его от света.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не усиливайте бакуловирус бесконечно, так как вредные мутанты производились с каждым проходом.
  3. Экспрессия белкового комплекса S1PRs-G
    1. Культивируйте клетки насекомых sf9 до плотности 2,5 х 106 клеток/мл, совместно заражайте с бакуловирусом P2, кодирующим S1PRs, Gi1 и Gβ1γ2 в объемном соотношении 1:2:1, и снова культивируйте при 27 °C в течение 48 ч.
    2. Соберите клетки путем центрифугирования при 700 х г при 4 °C в течение 15 мин, заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C для использования.
  4. Очистка белка
    1. Разморозьте клеточную гранулу, полученную на стадии 1,3, при комнатной температуре, а затем повторно суспендировали ее в буфере лизиса (20 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 5 мМ CaCl2), дополненном 100 мкг/мл бензамидина, 100 мкг/мл лейпептина, 100 мкг/мл апротинина, 25 мЕд/мл апиразы и 10 мкМ агониста. Перемешайте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы индуцировать образование белкового комплекса S1PRs-G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Апираза представляет собой АТФ-дифосфогидролазу. Он катализирует удаление гамма-фосфата из АТФ и бета-фосфата из АДФ.
    2. Переложите раствор в пробирки, центрифугируйте при 70 000 х г в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант. Повторно суспендировать гранулы в солюбилизирующий буфер (20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМMgCl2, 5 мМ CaCl2, 0,5% (мас./об.) ЛМНГ, 0,1% (мас./об.) CHS, 1% (мас./об.) холата натрия, 10% (v/v) глицерина).
    3. Переложите суспензию на стекло Dounce и полностью гомогенизируйте гранулу. Добавьте к суспензии 10 мкМ агонист, 4 мг scFv16, 100 мкг/мл бензамидина, 100 мкг/мл лейпептина, 100 мкг/мл апротинина и 25 мЕд/мл апиразы и перемешайте при 4 °C в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы гомогенизации гранул имеют решающее значение для производства белкового комплекса GPCR-G.
    4. Переложите раствор в пробирки и центрифугу при 100 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
    5. Предварительно уравновешивайте флаговую смолу с помощью промывочного буфера (20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 5 мМ CaCl2, агонист 10 мкМ, 0,0375% (мас./об.) LMNG, 0,0125% (мас./об.) GDN, 0,01% (мас./об.) CHS).
    6. Переложите надосадочное вещество в трубки и инкубируйте с флаг-смолой при 4 °C в течение 2 ч.
    7. Загрузите вышеуказанную смесь на стеклянную колонну и промыть колонну 50 мл промывочного буфера, дополненного 100 мкг/мл бензамидина, 100 мкг/мл лейпептина и 100 мкг/мл апротинина.
    8. Элюируют колонку с 10 мл буфера элюирования, содержащего 20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл флаг-пептида, 10 мкМ агониста, 0,0375% (мас./об.) LMNG, 0,0125% (мас./об.) GDN, 0,01% (мас./об.) CHS, 100 мкг/мл бензамидина, 100 мкг/мл лейпептина и 100 мкг/мл апротинина.
    9. Соберите белковый комплекс S1PRs-G и сконцентрируйте до 1 мл с помощью отсечной концентраторной установки 100 кДа при 1 300 х г при 4 °C. Фильтровать через фильтр 0,22 мкМ и центрифугу при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C для удаления агрегатов.
    10. Загрузите белковый комплекс S1PRs-G на фильтрующую колонну геля с исключением размера (SEC), предварительно уравновешенную буфером SEC, содержащим 20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ NaCl, агонист 10 мкМ, 100 мкм TCEP, 0,00375% (мас./об.) LMNG, 0,00125% (мас./об.) GDN и 0,001% (мас./об.) CHS при скорости потока 0,5 мл/мин при 4 °C.
    11. Соберите пиковые фракции и концентрат с помощью отсечной концентраторной установки 100 кДа при 1 300 х г при 4 °C для крио-ЭМ.

2. Электронная микроскопия для разрешения структуры S1PR

  1. Сбор данных
    1. Для подготовки крио-ЭМ-сеток держите 300-сетчатые сетки Au R1.2/1.3 в течение 10 с и тлеющий разряд в течение 60 с при 15 мА с помощью системы очистки тлеющего разряда.
    2. Выполняют витрификацию образцов, как описано ранее 33,34. В консоли погружной заморозки установите температуру на 4 °C и относительную влажность на 100% для рабочей среды камеры. Используйте силу пятна в течение 0, время ожидания 0 с, время блотирования 2 или 3 с и время слива 0 с. Обычно требуется только 3 мкл образца в концентрациях 5-10 мг/мл для одиночной витрификации.
    3. Обрезайте и загружайте сетки в сборку автоматической сетки, загружайте сборку автоматической сетки в Nanocab и загружайте Nanocab в микроскоп с помощью автозагрузчика, как описано ранее35. Качество образца экрана с программным обеспечением EPU234. Обычно данные, собранные в районах подходящей толщины льда, были лучше.
    4. Соберите крио-ЭМ данные, как подробно описано ранее35. Для рецептора S1P установите смещение дефокуса между -1,0 мкм и -1,8 мкм с экспозиционной электронной дозой 50-65 e-/Å2. Для комплексов S1PR1-Gi автоматически собирать стек фильмов с помощью программного обеспечения EPU2 в режиме подсчета с помощью детектора K2 при общем времени экспозиции 2 с, скорости записи пяти необработанных кадров в секунду и общей дозе 56 e-/Å2 для получения 35 кадров на стек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для восстановления структуры рецептора требуется более 5000 фильмов.
  2. Обработка данных с использованием комбинации RELION36 и криоСПАРК37 для получения идеальной крио-ЭМ карты плотности. Используйте RELION-3.1_gpu_ompi4 для первоначальной обработки данных, которая включает в себя операции, аналогичные описанным ранее34.
    1. В системном терминале Linux введите родительский каталог каталога хранилища данных.
    2. Введите команду relion в терминале, чтобы открыть графический интерфейс пользователя RELION.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это первый раз, когда RELION GUI был открыт в этом каталоге, появится окно приглашения; нажмите кнопку Да.
    3. Нажмите «Импорт» на панели функций в правой части графического интерфейса RELION, чтобы импортировать необработанные данные в RELION.
      1. В параметре «Фильмы/микрофоны» выберите «Да» для параметра «Импортировать необработанные фильмы/микроснимки?», введите путь к данным в поле «Необработанные входные файлы» (рекомендуется использовать подстановочные знаки) и выберите «Да» для параметра «Являются ли эти многокадровые фильмы?». Введите размер пикселя фильмов в поле «Размер пикселя» (Ангстрем), рабочее напряжение микроскопа (в кВ) в поле «Напряжение» (кВ) и сферическую аберрацию микроскопа в поле «Сферическая аберрация» (мм). Это параметры, которые были записаны в момент сбора данных.
      2. В параметре Выполняется измените имя очереди в соответствии с сервером, на котором запущена программа (другие функции также должны изменить этот параметр). Оставьте остальные параметры в значениях по умолчанию, установленных RELION. Наконец, когда все параметры определены правильно, нажмите кнопку ВЫПОЛНИТЬ! , чтобы запустить программу.
    4. Используйте функцию коррекции движения для выравнивания всех кадров38.
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» и выберите выход функции импорта с именем movies.star в качестве входных данных файла Input movies STAR. Введите дозу на кадр в поле Доза на кадр (e/A2), которое равно общей дозе, деленной на количество кадров. Выберите Нет для параметра Сохранить сумму спектров мощности?.
      2. В параметре «Движение» введите 250 для B-фактора, 5,5 для «Количество патчей X,Y» и 2 для групповых кадров (обеспечьте дозу группового >3). Если данные не были связаны с усилением в течение периода сбора, необходимо изображение с привязкой к коэффициенту усиления, которое можно получить, получив пустую область сетки. Выберите Нет для использования собственная реализация RELION? и введите каталог, содержащий исполняемый файл MOTIONCOR239, в исполняемое поле MOTIONCOR2 .
      3. В параметре Выполняется выберите соответствующий MPI и номер потока в соответствии с вычислительной мощностью сервера; здесь использовались MPI = 8 и threads = 3.
    5. Используйте функцию оценки CTF для модуляции крио-ЭМ изображения остеклованного образца40. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» и выберите выход Motion cor с именем corrected micrographs.star в качестве входных данных файла Input movies STAR. В параметре Gctf выберите Да для UseGctf?.
    6. Используйте функцию выбора подмножеств для удаления микроснимков со значением rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор», расположенную справа от ИЛИ выберите из micrographs.star , и выберите выход CtfFind с именем micrographs_ctf.star в качестве входных данных. В параметре Подмножество выберите Да для параметра Выбрать на основе значений метаданных? и введите 4 в качестве максимального значения метаданных , чтобы удалить неверные данные.
    7. Ручной отбор: выберите некоторые изображения вручную для предварительного выбора и классификации.
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» и выберите micrographs_selected.star из предыдущего каталога Select (шаг 2.2.6) в качестве входных данных.
      2. Нажмите на RUN! (появится окно). Нажмите «Файл» в левом верхнем углу нового окна и нажмите « Инвертировать выделение », чтобы отменить выбор всех изображений. Проверьте крайний левый флажок выбора в соответствующей строке каждой записи и нажмите на выбор , чтобы проверить изображения и выбрать ~ 500 хороших изображений. Нажмите «Файл > сохранить», чтобы сохранить выбранные изображения и закрыть окно.
    8. Автоподбор: пакеты программного обеспечения для автоматического сбора частиц являются полезными и мощными41.
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от «Входных микроснимков» для автовыбора и выберите micrographs_selected.star из предыдущего каталога ManualPick (шаг 2.2.7) в качестве входных данных. В начале используется алгоритм Лапласиана Гаусса, поэтому выберите Да для OR: используйте Лапласиан-оф-Гаусс.
      2. В параметре Laplacian установите минимальный диаметр для фильтра LoG (A) равным 80 и максимальный диаметр для фильтра LoG (A) равным 130. В параметре Автопикирование установите для параметра Минимальное расстояние между частицами (A) значение 65 и выберите Да для параметра Использовать ускорение графического процессора, если доступ к графическому процессору возможен.
    9. Извлеките частицы для следующих шагов.
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от файла MICROGRAPH STAR и выберите micrographs_selected.star из шага 2.2.6. Нажмите «Обзор» справа от входных координат и выберите cords_suffix_autopick.star из шага 2.2.8.
      2. В параметре «Извлечь » выберите «Да » для параметра «Изменить масштабирование частиц » и установите для параметра «Повторно масштабируемый размер (пиксели)» значение 128 , чтобы ускорить последующие шаги.
    10. 2D классификация для предварительной классификации частиц
      1. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от файла STAR входных изображений и выберите particles.star из шага 2.2.9. В параметре Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 100, а для параметра Диаметр маски (A) — значение 140.
      2. В параметре Вычисления установите для параметра Количество частиц пула значение 10, введите каталог, который находится на быстром локальном диске (например, SSD-диске), в поле Копировать частицу в скретч-каталог и выберите Да для использования ускорения графического процессора? для более высокой скорости обработки.
    11. Выбор подмножества для выбора хороших 2D-результатов в качестве шаблонов для выбора частиц
      1. В опции ввода-вывода нажмите кнопку Обзор справа от Выберите классы из model.star и выберите выходные данные Шага 2.2.10 с именем run_it025_model.star в качестве входных данных. Нажмите на КНОПКУ ВЫПОЛНИТЬ!. Во всплывающем окне установите флажки Сортировать изображения на и Обратная сортировка? и нажмите На Дисплей!.
      2. Выберите хорошие репрезентативные 2D-результаты в качестве ссылки на функцию автоподбора .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные результаты выделены красным цветом. Хорошие и плохие результаты 2D-классификации показаны позже.
      3. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Сохранить выбранные классы.
    12. Используйте шаблон для второго раунда автоподбора. В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от «Входных микроснимков» для автовыбора и выберите micrographs_selected.star из шага 2.2.6. Нажмите «Обзор» справа от 2D-ссылок, выберите class_averages.star из шага 2.2.11 и выберите «Нет для ИЛИ: используйте Laplacian-of-Gaussian».
    13. Снова выполните извлечение частиц, используя coord_suffix_autopick.star из Шага 2.2.12 и micrographs_selected.star из Шага 2.2.6.
    14. Снова выполните 2D-классификацию, используя particles.star из шага 2.2.13.
    15. Снова выполните выделение подмножества с помощью run_it025_optimiser.star из шага 2.2.14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все 2D-изображения с четкими контурами и правильными формами должны быть выбраны.
    16. Выполните извлечение частиц следующим образом. В опции ввода/вывода нажмите кнопку Обзор справа от файла MICROGRAPH STAR, выберите micrographs_selected.star из шага 2.2.6 и выберите Да для ИЛИ повторного извлечения рафинированных частиц?. Нажмите на Обзор справа от файла Refined particles STAR и выберите particles.star из Шага 2.2.15.
    17. 3D-начальная модель и генерация эталонной карты: В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от файла STAR «Входные изображения» и выберите particles.star из шага 2.2.16. Установите для параметра Количество классов значение 1, а для параметра Оптимизация — значение Диаметр маски (A) — 140.
    18. 3D-классификация и создание предварительной 3D-карты: В опции ввода-вывода нажмите «Обзор» справа от файла STAR «Входные изображения» и выберите particles.star из шага 2.2.16. Нажмите кнопку Обзор справа от Справочной карты и выберите initial_model.mrc из Шага 2.2.17. Установите для параметра «Количество классов» значение 4–6, а для параметра «Оптимизация» — значение «Диаметр маски (A)».
    19. Генерация маски: выберите хорошие 3D-карты из шага 2.2.17 в качестве входных данных в опции ввода-вывода. Установите порог начальной бинаризации равным 0,05 (настройте в зависимости от выходных данных), увеличьте двоичное сопоставление этого количества пикселей до 3 и добавьте мягкий край этого количества пикселей в 8 в параметре «Маска».
    20. Используйте cryoSPARC для следующей обработки.
    21. Создайте новую рабочую область и щелкните Конструктор заданий для первого задания.
    22. Чтобы импортировать стек частиц, введите путь частицы (шаг 2.2.16) в поле мета-путь частицы и путь фильма (шаг 2.2.16) в поле путь данных частицы .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры Ускоряющее напряжение (кВ), Сферическая аберрация (мм) и Размер пикселя (Ангстрем) такие же, как и раньше. Значение амплитудного контраста (дроби) равно 0,1.
    23. Импортируйте 3D-тома, введя путь к лучшему 3D-тому на шаге 2.2.18 в пути к данным тома и выбрав Map в поле Тип импортируемого тома.
    24. Импортируйте маску, введя путь к маске (шаг 2.2.19) в путь к данным тома и выбрав Маска в поле Тип импортируемого тома.
    25. Неравномерное уточнение: Возьмите результаты этапов 2.2.22, 2.2.23 и 2.2.24 в качестве входных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция очень полезна для мембранных белков.
      1. Перетащите выход Шага 2.2.22 (imported_particles) в качестве входа частиц (частиц) Неоднородного Уточнения, выход Шага 2.2.23 (imported_volume_1) как вход объема (объема) Неравномерного Уточнения и выход Шага 2.2.24 (imported_mask_1) в качестве входа маски (маски) Неравномерного Уточнения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда лучшие результаты могут быть достигнуты без маски.
      2. Щелкните Очередь , чтобы начать обработку.
    26. Выполните шаги 2.2.18-2.2.25 для достижения лучших результатов. Благодаря вышеуказанной серии обработки можно получить карту S1PR-Gi 3D с хорошим разрешением.

3. S1PRs-Gi опосредованный анализ ингибирования цАМФ

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент по ингибированию цАМФ, опосредованный S1PRs-Gi, был разделен на несколько частей, и ниже приведены подробные экспериментальные процедуры. Экспериментальный принцип и общий экспериментальный процесс показаны в виде блок-схемы на рисунке 1.

  1. Построение плазмид
    1. Субклонирование cDNAs диких типов S1PR1, S1PR3 и S1PR5 в вектор pcDNA3.1+ с последовательностью сигналов HA, за которой следует тег Flag на N-конце (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мутации для всех рецепторов были сгенерированы с помощью набора мутагенеза (Таблица материалов).
  2. Получение плазмиды
    1. Добавьте рекомбинантные векторы pcDNA3.1+ или плазмиду датчика (Таблица материалов) к 50 мкл dh5α-компетентной кишечной палочки (E. coli), хранящейся в пробирке объемом 1,5 мл при -80 °C отдельно, и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Тепловой удар по ячейкам при 42 °C в течение 90 с, немедленно перенесите их на лед и охладите в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сенсорная плазмида, обеспечиваемая набором для анализа ги-ингибирования цАМФ (Таблица материалов), экспрессирует модифицированный ген люциферазы, слитый с цАМФ-связывающим доменом, и увеличивает люминесцентную активность при связывании цАМФ.
    2. Встряхните пробирку при 37 °C в течение 1 ч после добавления 300 мкл среды лизогенного бульона (LB). Пластину 100 мкл клеток к агаровой пластине LB и инкубируют при 37 °C, выдерживая в темноте в течение 48 ч. Инокулируют белую колонию в 5 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при 37 °C в течение 16 ч.
    3. Изолировать ДНК с помощью плазмидного минипрепа (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя; плазмида находилась в концентрации более 350 нг/мкл со значением А260/А280 между 1,7 и 1,9.
  3. Клеточная культура
    1. Поместите клетки CHO-K1 в чашку Петри размером 10 см, культивируйте их в инкубаторе с температурой 37 ° C с 5% CO2 и соберите их, когда монослой находится на слиянии 80-90%.
    2. Аспирируйте питательную среду клеток CHO-K1, аккуратно добавьте 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, предварительно нагретого при 37 °C, на чашку Петри и инкубируйте в течение 15 с. Затем добавляют 4 мл питательной среды, состоящей из среды F12 + 10% FBS.
    3. Вытесните клетки с поверхности чашки Петри, осторожно покачиваясь и постукивая по боковой стороне чашки Петри. Наполните коническую трубку клеточной суспензией. Медленно перемешайте и медленно выньчите, чтобы аккуратно удалить комочки клеток.
    4. Центрифужные ячейки при 250 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирируют супернатант и реанимируют 3 мл PBS. Повторите этот шаг.
    5. Определяют номер ячейки с помощью гемацитометра и центрифужных ячеек при 250 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Аспират PBS буферные и повторноуспендированные клетки CHO-K1 с 3 мл питательной среды, состоящей из среды F12 и 10% FBS.
    7. Добавьте 2 мл питательной среды, состоящей из среды F12 и 10% FBS, в каждую лунку шестилуночной пластины и посейте 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку, чтобы сохранить ячейки при плотности 1,5 х 105 клеток/мл. Инкубируют шестилуночную пластину в инкубаторе культуры тканей при температуре 37 °C с 5% CO2 в течение примерно 24 ч.
  4. Транзиторная трансфекция
    1. Разбавить 2 мкг ДНК (Стадия 3.2.3) в 200 мкл буфера трансфекционного реагента (Таблица материалов). Перемешайте путем вихря в течение 10 с и ненадолго вращаясь перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 2 мкг ДНК содержат 0,5 мкг рецепторного вектора (S1PR1, S1PR3 или S1PR5) и 1,5 мкг плазмиды датчика.
    2. Добавьте 4 мкл трансфекционного реагента (Таблица материалов), вихрь в течение 10 с и ненадолго вращайте перед использованием. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Медленно капните 200 мкл трансфекционной смеси в каждую лунку (содержащую клетки CHO-K1), чтобы распределить равномерно. Аккуратно встряхните шестилуночную пластину, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
    4. Замените трансфекционную среду через 4-6 ч средой роста клеток, состоящей из среды F12 + 10% FBS, и верните шестилуночную пластину в инкубатор.
    5. Сбор клеток через 24-48 ч после трансфекции.
      1. Переварить клетки CHO-K1 на лунке с 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА (предварительно нагретого при 37 °C) в течение 15 с и добавить 1 мл питательной среды, состоящей из среды F12 + 10% FBS. Выбивайте клетки с поверхности скважины, раскачивая и осторожно постукивая по боковой части скважины.
      2. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку и центрифугу при 250 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Вылейте супернатант и соберите трансфектированные клетки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед определением флуоресцентного сигнала проверьте уровни экспрессии рецепторов на клеточной поверхности с помощью ИФА, как описано ранее26.
  5. Уравновешивание солью D-люциферин-калия (Таблица материалов)
    1. Суспендировать собранные клетки (24-48 ч после трансфекции) с 3 мл буфера анализа немедленно (т.е. сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), содержащий 10 мМ HEPES pH 7,4), с дополнительным 3% v/v разбавления D-люциферин-калиевой соли.
    2. Добавьте 90 мкл клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с помощью многоканальной пипетки и аккуратно перемешайте.
    3. Инкубировать в течение 40 мин при комнатной температуре.
  6. Определение флуоресцентного сигнала
    1. Заранее готовят 10 мМ стоковых растворов Сипонимода, растворенных в ДМСО, и производят серийное разбавление с использованием буфера HBSS, содержащего 25 мкМ форсколина перед стимуляцией лиганда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением контрольной группы без лиганда, остальные имеют диапазон градиента концентрации 10-11-10-5 моль/л.
    2. Стимулируют 10 мкл (на лунку) раствора агониста в различных концентрациях в течение 30 мин.
    3. Подсчитайте люминесцентные сигналы на считывателе микропластин с помощью соответствующих параметров программного обеспечения (Таблица материалов) следующим образом. Выберите Люминесценция для метода обнаружения, Конечная точка для типа считывания и Люминесцентное волокно для типа оптики. Установите коэффициент усиления оптики равным 255.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое измерение повторялось по меньшей мере в трех независимых экспериментах, каждый в трех экземплярах.
    4. Получение значений флуоресцентного сигнала, импорт данных в программу для работы с электронными таблицами и обработка данных с помощью функции нелинейной регрессии (подгонки кривой) «доза-реакция».

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация эксперимента. Подробное пошаговое руководство по экспериментальной настройке и выполнению. Короче говоря, рецептор и модифицированная люцифераза были временно совместно экспрессированы в клетках CHO-K1 путем трансфекции рецептора и сенсорной плазмиды в клетки с помощью трансфекционного реагента. Клетки суспендировали в растворе HBSS с D-люциферин-калиевой солью, субстратом люциферазы, и засевали в 96-луночную пластину через 24 ч. Чтобы обеспечить проникновение в клетки, D-люциферин должен быть предварительно уравновешен с клетками. Окислительный фермент люцифераза превращает люциферин в оксилюциферин и излучает свет. Модифицированная люцифераза, с другой стороны, генерирует свет посредством химической реакции только при связывании с цАМФ, а интенсивность света имеет положительную связь с уровнями цАМФ в клетках. Уровни цАМФ регулировались с помощью GPCR, активированного агонистом. Gi-связанные рецепторы снижали уровни цАМФ, что требовало добавления форсколина для активации аденилилциклазы в эксперименте с Gi-ингибированием цАМФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Перед замораживанием образца комплекса S1PRs-Gi очищенный образец необходимо отделить с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC) и проанализировать с помощью гель-фильтрационной хроматографии. На рисунке 2 показан комплекс S1PR3-Gi в качестве примера. Пиковая фракция однородного белкового комплекса GPCR-G обычно располагалась при ~10,5 мл размерно-эксклюзионной хроматографии (рисунок 2А). SDS-страничный анализ комплекса S1PR3-Gi (рисунок 2B) выявляет четыре полосы, соответствующие теоретическим полосам S1PR3, Gαi, Gβ и scFv16, и, таким образом, предполагает, что комплекс был успешно очищен. Рецепторную полосу часто находили диффузной из-за различной степени модификации (гликозилирование или пальмитоилирование), а полосу Gγ не находили.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ результатов очистки белка (А) Гель-фильтрационная хроматограмма, показывающая пиковую фракцию, соответствующую белку. (B) Схема электрофореза Геля SDS-страницы. Эта цифра была скорректирована из ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Комплексные фракции комплекса S1PR3-Gi были собраны и сконцентрированы для электронной микроскопии. Процедуры и репрезентативные результаты витрификации сетки и отбора проб обсуждались ранее34. Представлена блок-схема (рисунок 3) для получения структуры с высоким разрешением белкового комплекса S1PRs-G с использованием двух различных платформ обработки: RELION-3 и cryoSPARC v3.

Figure 3
Рисунок 3: Рабочий процесс обработки данных pFTY720-связанных комплексов S1PR3-Gi-scFv16. Показана блок-схема обработки крио-ЭМ-данных комплекса pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16. На рисунке показаны репрезентативная автоподбор крио-ЭМ-микросхемы, средние 2D-классификации, 3D-реконструкции и неравномерная доработка комплекса pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16. Этот показатель был изменен по сравнению со ссылкой27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сначала фильмы были импортированы в RELION-3, а затем была выполнена коррекция движения и CTF-оценка для получения усредненных микроснимков. Путем отбора частиц и итеративной 2D-классификации были получены лучшие частицы для дальнейшей обработки. Крайне важно выбрать частицы с четко определенными 2D-классами, которые четко представляют вторичную структурную информацию комплекса S1PR3-Gi (рисунок 4A), поскольку частицы низкого качества могут препятствовать последующим этапам обработки (рисунок 4B), что приводит к реконструкции с более низким разрешением. Используя 3D-классификацию, частицы были дополнительно классифицированы, чтобы исключить шумовые частицы, различить различные возможные конформации и дать несколько 3D-реконструкций. В конце концов, комплексная ЭМ-карта S1PR3-Gi (рисунок 5A) была получена с хорошим разрешением через корреляцию оболочки Фурье (FSC) (рисунок 5B) через неравномерную очистку.

Figure 4
Рисунок 4: Выбор 2D-классов. (A,B) Результаты 2D-классификации. (A) Выбрать средние значения 2D-класса, содержащие четко определенные классы для дальнейшей обработки, и (B) отклонить частичные частицы или частицы с низким разрешением и шумом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Структура высокого разрешения pFTY720-связанных комплексов S1PR3-Gi-scFv16. (A) Структура с высоким разрешением связанного pFTY720 комплекса S1PR3 отображает четко определенную крио-ЭМ плотность, представляющую элементы структуры белка S1PR3 и Gi. (B) Кривая корреляции оболочки Фурье золотого стандарта (FSC) для pFTY720-связанного S1PR3-Gi комплекса. Эта цифра была скорректирована из ссылки27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Разрешая структуры белкового комплекса S1PRs-G с помощью крио-ЭМ, мы выяснили механизм активации, селективного распознавания лекарств и связи G-белка с помощью функциональных анализов в клетке. Анализ Gi-ингибирования цАМФ измеряет изменения уровня концентрации цАМФ в клетках (рисунок 1), и он часто использовался для проверки эффективности активации рецепторов в сочетании с Gs или Gi.

Отношение концентрации рецептора к сенсорной плазмиде в экспериментальной системе имеет решающее значение для экспериментальной жизнеспособности. Итак, чтобы эффективно и точно выполнить функциональный анализ, необходимо выбрать коэффициент концентрации плазмиды с максимальным значением E. В этом эксперименте были исследованы три соотношения концентраций (1:1, 1:3 и 1:9) рецептора к сенсорной плазмиде. Результаты показали, что максимальное значение Emax было получено, когда отношение концентрации рецептора к сенсорной плазмиде составляло 1:3 (рисунок 6).

Figure 6
Рисунок 6: Влияние различных соотношений концентраций S1PR3 к плазмиде датчика на период окна было исследовано в клеточной линии CHO-K1. Данные представлены в виде средств ± SEM трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Помимо отношения концентрации рецептора к плазмиде датчика, клеточные линии, используемые в этом эксперименте, также были важны. Не было существенной разницы между клеточными линиями HEK293 и CHO-K1 для большинства рецепторов. Клеточные линии CHO-K1, с другой стороны, имели более реалистичную общую кривую, чем ячейки HEK293 для S1PR3 (рисунок 7). Поэтому для функциональной экспериментальной верификации S1PR3 были выбраны клетки CHO-K1.

Figure 7
Рисунок 7: Влияние различных соотношений концентраций S1PR3 к плазмиде датчика на период окна было исследовано в клеточной линии HEK293. Данные представлены в виде средств ± SEM трех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает первичный конвейер для определения структур S1RR с помощью крио-ЭМ и измерения эффективности активации S1RR с помощью Gi-опосредованного анализа ингибирования цАМФ. Некоторые шаги имеют решающее значение для успеха эксперимента.

Для очистки комплекса S1PRs-Gi следует уделять больше внимания качеству вируса и здоровью клеток sf9 . Экспрессия рецептора резко снижается в бедных клетках sf9 . Здоровье клеток sf9 оценивали путем измерения их диаметра. Здоровая клетка sf9 имеет диаметр примерно 15 мкм. На выход комплекса S1PRs-Gi влияет объемное соотношение рецепторов, Вирусов Gi и Gβγ, которое может быть преодолено путем сборки белкового комплекса S1PRs-G in vitro42. Кроме того, белковые комплексы GPCR-G не всегда стабильны, и поэтому была разработана стратегия NanoBiT, которая часто применялась для стабилизации комплекса43.

Качество образца является основой для всего в крио-ЭМ-эксперименте. Явление агрегации или диссоциации часто наблюдалось при скрининге образцов. Некоторые подходы могут быть полезны для стабилизации GPCR-G-белкового комплекса. Остатки С-конца S1RR могут вызывать агрегацию образцов в комплексном проекте26 S1PRs-Gi. Анализ сигнального пути должен быть использован для выбора приемлемого конца C-терминала для S1PRs26,27. Концентрация LMNG является вторым наиболее существенным фактором; чрезмерные концентрации моющих средств могут стабилизировать белковый комплекс GPCR-G, но они также могут уменьшить его разрешение, в то время как низкие концентрации могут сделать обратное. Решающим аспектом в стабилизации комплекса является оптимальная концентрация моющего средства, которая является как можно ниже. Кроме того, концентрация выборки может иногда влиять на количество собранных данных. При остекливании образца мы часто делаем градиент. При обработке данных выбор алгоритмов в выборе частиц и 2D или 3D классификации важен для решения белковых комплексов S1PR-G, особенно для моделирования лигандов и ECL; плотность ECL была найдена непрерывной в структуре S1PR1, разрешенной в литературе, описанной Shian Liu et al.42, и найденной прерывистой в структурах S1PR526. Хотя универсального решения этой проблемы для всех комплексов GPCR не существует, следует попробовать любую стратегию, улучшающую карту плотности ЭМ. Важнейшие этапы витрификации, сбора данных и обработки изображений были описаны ранее34,44.

Анализ необходим для оценки эффективности активации или ингибирования лигандов S1PR после того, как структуры S1PR были определены крио-ЭМ. Можно использовать множество подходов. Анализ ги-ингибирования цАМФ оценивает эффективность активации рецепторов путем регулярного мониторинга изменений уровня цАМФ в клетках, вызванных агонистами. а) Клеточная культура, б) трансфекция, в) соотношение родинок плазмидного рецептора (или мутаций) и сенсорной плазмиды и г) выбор типа клетки имеют решающее значение для успешного эксперимента. Здоровье клеток может влиять на эффективность трансфекции и экспрессию рецептора или датчика, что может оказать значительное влияние на соотношение сигнал/шум эксперимента. Клетки, как правило, здоровы после 20 поколений, хотя это не всегда так. Очень важно всегда следить за состоянием клеток. Период переваривания трипсина во время прохождения клеток должен жестко контролироваться, потому что состояние клетки оказывает значительное влияние с течением времени. Трансфекционные реагенты влияют на экспрессию рецепторов в нескольких типах клеток, и должна быть выбрана соответствующая марка клеток. Молярное отношение плазмидного рецептора к сенсорной плазмиде в анализе Gi-ингибирования цАМФ должно быть оптимизировано. Мы часто выбираем серию соотношений родинок между рецептором и сенсорной плазмидой и определяем наибольшее изменение интенсивности флуоресценции, чтобы обеспечить точность данных для анализа Ги-ингибирования цАМФ с рецепторными мутантами.

Некоторые другие анализы используются для мониторинга клеточных уровней цАМФ в различных типах образцов, таких как ИФА-анализ45 и NanoBiT46. Анализ цАМФ-ИФА используется для измерения количества цАМФ, связанного со специфическим антителом. ЦАМФ-специфическое антитело закрепляется на микротитерной пластине, и индикатор пероксидазы цАМФ конкурирует с цАМФ за связывание с антителом. Количество индикатора пероксидазы цАМФ, связанного с пластиной, измеряют с помощью флуорометрических испытаний, которые обратно пропорциональны количеству цАМФ. В 2007 году Jiang et al. разработали метод количественного и быстрого мониторинга уровней цАМФ in vivo с использованием технологии биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) (датчик цАМФ с использованием YFP-Epac-RLuc)46. В анализе цАМФ на основе NanoBiT применяется датчик цАМФ LgBiT-Epac-SmBiT, который заменяет YFP и Rluc на LgBiT и SmBiT соответственно и используется для измерения диссоциации гетеротримера G-белка или связи между рецептором и гетеротримером G-белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Данные комплекса S1PRs-Gi были собраны в Западно-Китайском крио-ЭМ-центре в Сычуаньском университете и Центре крио-ЭМ в Южном университете науки и техники (SUSTech) и обработаны в Центре высокопроизводительных вычислений Duyu в Сычуаньском университете. Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая (32100965 в Лос-Анджелесе, 32100988 в W.Y., 31972916 в Z.S.) и Фондом постдокторских исследований Сычуаньского университета (2021SCU12003 в Лос-Анджелесе).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Биохимия выпуск 184
Конвейер для исследования структур и сигнальных путей рецепторов сфингозин-1-фосфата
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter