Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En pipeline för att undersöka strukturer och signalvägar för sfingosin 1-fosfatreceptorer

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
* These authors contributed equally

Summary

S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom underfamiljen S1P-receptorer (S1PR). Här beskrivs en pipeline för att förklara strukturerna och funktionen hos S1PR.

Abstract

Lysofosfolipider (LPL) är bioaktiva lipider som inkluderar sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyra etc. S1P, en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en av de bäst karakteriserade LPL: erna som reglerar en mängd olika cellulära fysiologiska svar via signalvägar medierade av sfingosin 1-fosfatreceptorer (S1PRs). Detta innebar att S1P-S1PRs signalsystem är ett anmärkningsvärt potentiellt terapeutiskt mål för störningar, inklusive multipel skleros (MS), autoimmuna störningar, cancer, inflammation och till och med COVID-19. S1PR, en liten delmängd av klass A G-proteinkopplad receptor (GPCR) -familjen, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 och S1PR5. Bristen på detaljerad strukturell information hindrar dock läkemedelsupptäckten riktad mot S1PR. Här tillämpade vi kryoelektronmikroskopimetoden för att lösa strukturen hos S1P-S1PRs-komplexet och belyste aktiveringsmekanismen, selektiv läkemedelsigenkänning och G-proteinkoppling genom att använda cellbaserade funktionella analyser. Andra lysofosfolipidreceptorer (LPLR) och GPCR kan också studeras med hjälp av denna strategi.

Introduction

Sfingosin-1-fosfat (S1P), en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en allestädes närvarande lysofosfatidisk signalmolekyl som involverar olika biologiska aktiviteter, inklusive lymfocythandel, vaskulär utveckling, endotelintegritet och hjärtfrekvens 1,2,3. S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom fem S1P-receptorsubtyper (S1PRs 1-5); S1PR finns i en mängd olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner 4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar cAMP-produktionen; S1PR2 och S1PR3 är kopplade till Gi, Gq och G12/13, och S1PR4 och S1PR5 transducerar signal genom Gi och G12/136.

S1P-S1PR-signalering är ett kritiskt terapeutiskt mål för flera sjukdomar, inklusive autoimmuna störningar7, inflammation8, cancer9 och till och med COVID-1910. År 2010 licensierades fingolimod (FTY720) som ett first-in-class-läkemedel riktat mot S1PR för att behandla skovvis multipel skleros (MS)11. Det kan emellertid binda till alla S1PR utom S1PR2, medan ospecifik bindning till S1PR3 resulterar i ödem i hjärnbarken, vaskulär och bronkial förträngning och lungepitelläckage12. Som en alternativ strategi för att öka terapeutisk selektivitet har subtypspecifika ligander för receptorn producerats. Siponimod (BAF312) godkändes 2019 för återfall MS-behandling13; det riktar sig effektivt till S1PR1 och S1PR5, medan det inte har någon affinitet för S1PR3, vilket uppvisar färre biverkningar i klinisk praxis14. År 2020 godkände US Food and Drug Administration ozanimod för MS-terapi15. Det har rapporterats att ozanimod har en 25-faldigt större selektivitet för S1PR1 än för S1PR516. I synnerhet i samband med den nuvarande COVID-19-pandemin har det upptäckts att agonistläkemedel riktade mot S1PR kan användas för att behandla COVID-19 genom att använda immunmodulerande terapitekniker17. I jämförelse med fingolimod har ozanimod visat överlägsenhet när det gäller att sänka symtomen hos COVID-19-patienter och genomgår nu kliniska prövningar10. Att förstå den strukturella grunden och funktionen hos S1PR lägger en viktig grund för att utveckla ett läkemedel som selektivt riktar sig motS1PRs 18.

Många tekniker används för att undersöka den strukturella informationen om biomakromolekyler, inklusive röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och elektronmikroskopi (EM). Från och med mars 2022 finns det mer än 180 000 strukturer deponerade på Protein Databank (PDB), och de flesta av dem har lösts genom röntgenkristallografi. Men med den första nästan atomära upplösningsstrukturen för TPRV1 (3.4 Å-upplösning) rapporterad av Yifan Cheng och David Julius 2013 19, har kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) blivit en vanlig teknik för proteinstrukturer, och det totala antalet EM PDB-strukturer var mer än10 000. De kritiska genombrottsområdena är utvecklingen av nya kameror för avbildning som kallas direkta elektrondetekteringskameror och nya bildbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutionerat strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsupptäckt under det senaste decenniet20. Eftersom förståelse för hur makromolekylära komplex uppfyller sina komplicerade roller i den levande cellen är ett centralt tema inom biologiska vetenskaper, har kryo-EM potential att avslöja konformationer av dynamiska molekylära komplex, särskilt för transmembranproteiner21. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är den största superfamiljen av transmembranproteiner och målen för mer än 30% av de för närvarande marknadsförda läkemedlen22. Utvecklingen av kryo-EM har bidragit till en explosion av högupplösta strukturer av GPCR-G-proteinkomplex, vilket möjliggör strukturell bestämning för "svårhanterliga" mål som fortfarande inte är tillgängliga för röntgenkristallografisk analys i läkemedelsdesign23. Därför ger kryo-EM-applikationen en chans att bestämma den tredimensionella strukturen hos GPCR i nästan inbyggda förhållanden vid nära atomupplösning24. Framsteg inom kryo-EM gör det möjligt att visualisera mekanistiska underlag för GPCR-stimulering eller hämning, och ytterligare fördelar med att avslöja de nya bindningsställena för GPCR-riktad läkemedelsskapande25.

Genom att förlita oss på de enorma framstegen med kryo-EM-teknik har vi identifierat strukturer av agoniserade S1PR1-, S1PR3- och S1PR5-Gi-signalkomplex nyligen26,27. Hos människor finns S1PR i olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner 4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar 3′,5′-cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) produktion. S1PR3 och S1PR5 kan också kopplas till Gi 6,28. Eftersom Gi-kopplad receptoraktivering minskar produktionen av cAMP29 introducerades en Gi-hämning cAMP-analys för att mäta cAMP-hämningseffekter för att fånga funktionella förändringar26,27. Med hjälp av en mutantversion av Photinus pyralis luciferas där en cAMP-bindande proteindel har infogats, erbjuder denna cAMP-analys en enkel och pålitlig metod för att övervaka GPCR-aktivitet genom förändringar i intracellulär cAMP-koncentration30. Det är en känslig och icke-radioaktiv funktionell analys och kan tillämpas för att övervaka realtidssignalering nedströms av ett brett spektrum av GPCR för läkemedelsupptäcktsändamål31.

Här ges en sammanfattning av de kritiska metoderna för att lösa aktiverings- och läkemedelsigenkänningslägena för S1PR, främst inklusive kryo-EM-manipulationer och en Gi-hämning cAMP-analys. Denna artikel syftar till att ge omfattande experimentell vägledning för ytterligare utforskningar av GPCR: s strukturer och funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rening av S1PRs-G-proteinkomplex

  1. För att rena det mänskliga S1PRs-G-proteinkomplexet, klona cDNA: erna av S1PR1 som saknar C-terminala rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 stympad med 345-398 vid C-terminalen och vildtypen Gi1 i pFastBac1-vektorn och cDNA: erna av vildtyp Gβ1 och Gγ2 till pFastBacdual-vektorn (materialtabell).
    OBS: Alla konstruktioner för S1PR innehåller också haemagglutinin (HA) signalsekvensen följt av en flaggepitoptagg vid N-terminalen och en 10x hans tagg vid C-terminalen. Dessutom infördes en syntetisk DNA-sekvens (materialtabell) för översättning av T4-lysozym (T4L) i N-änden av S1PR för att underlätta receptoruttryck och rening.
  2. Beredning av baculovirus som kodar för S1PR, Gi1 och Gβ1γ2
    1. Tillsätt de rekombinanta vektorerna till 50 μl DH5α kompetent Escherichia coli (E. coli) som förvaras i ett 1,5 ml rör vid -80 °C och inkubera på is i 30 minuter.
    2. Värmechocka cellerna vid 42 °C i 90 s, överför dem omedelbart till isen och kyl dem i 2 minuter.
    3. Skaka röret vid 37 °C i 3–5 timmar efter komplettering med 300 μl lysogenibuljong (LB). Platta 100 μl celler till LB-agarplattan och inkubera vid 37 °C genom att hålla det mörkt i 48 timmar.
    4. Inokulera den vita kolonin till 5 ml LB-medium innehållande 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin och 7 μg/ml gentamicin och odla vid 37 °C i 16 timmar.
    5. Isolera den rekombinanta bacmiden med plasmiden miniprep kit (Materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner, för att producera P0 baculovirus.
      OBS: Före användning analyserades den renade bacmiden med PCR med pUC / M13 framåt och bakåt primers. För PCR är antalet cykler = 30 cykler, smälttemperatur = 58 °C och förlängningstid = 1 min per 1 Kb.
    6. Förbered P0-baculovirus enligt beskrivningen i ett tidigare protokoll32.
      1. Odla sf9-cellerna (ESF921-medium) i sexbrunnsplattor och verifiera att cellerna är i loggfasen (1,0-1,5 x 106 celler / ml).
      2. Späd 8 μl bakulovirustransfektreagens i 100 μl av Graces medium och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Späd 10 μg av den rekombinanta bacmiden i 100 μl av Graces medium och blanda försiktigt. Kombinera den utspädda bacmiden med utspätt baculovirustransfektionsreagens, blanda försiktigt och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
      3. Tillsätt blandningen (bacmid och reagens) på cellerna (steg 1.2.6.1) och platta dem vid 27 °C i 3 timmar.
      4. Ta bort Graces medium och ersätt det med 2 ml ESF921 cellodlingsmedium. Platta de sex brunnsplattorna vid 27 °C och samla upp ESF921-cellodlingsmediet efter 5 dagar efter transfektionen.
      5. Centrifugera vid 500 x g vid 4 °C i 10 minuter för att avlägsna cellerna och skräpet. Överför supernatanten till 2 ml rör. Detta är P0 baculovirus-beståndet.
    7. Isolera P1-viruslagret
      1. Överför 30 ml sf9-celler till en konisk flaska, odla vid 27 ° C med skakning vid 270 rpm och verifiera att cellerna når en loggfas (1,0-1,5 x 106 celler / ml).
      2. Tillsätt 2 ml P0-virusbuljong på flaskan och skaka vid 270 rpm i 4 dagar vid 27 °C.
      3. Överför cellerna till ett 50 ml rör, centrifugera vid 1 800 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna cellerna och skräpet och överför supernatanten till 50 ml rör. Detta är P1 baculovirus-beståndet.
    8. Förstärka baculoviralt lager
      1. Upprepa steg 1.2.7 med 50 ml sf9-celler i loggfasen (1,0-1,5 x 106 celler/ml) och 1 ml P1-stam.
      2. Förvara det resulterande P2-baculovirusbeståndet vid 4 °C och skydda det från ljus.
        OBS: Förstärk inte baculoviruset på obestämd tid, eftersom de skadliga mutanterna producerades med varje passage.
  3. Uttryck av S1PRs-G-proteinkomplex
    1. Odla sf9-insektsceller för att nå 2,5 x 106 celler / ml densitet, saminfektera med P2-baculoviruset som kodar för S1PR, Gi1 och Gβ1γ2 vid ett volymförhållande på 1: 2: 1 och odla igen vid 27 ° C i 48 timmar.
    2. Samla upp cellerna genom att centrifugera vid 700 x g vid 4 °C i 15 minuter, frys dem i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C för användning.
  4. Proteinrening
    1. Tina cellpelleten som erhållits i steg 1.3 vid rumstemperatur och suspendera den sedan i lysbuffert (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) kompletterat med 100 μg/ml bensamidin, 100 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml aprotinin, 25 mU/ml apyras och 10 μM-agonist. Rör om cellsuspensionen vid rumstemperatur i 2 timmar för att inducera bildandet av S1PRs-G-proteinkomplexet.
      OBS: Apyras är en ATP-difosfohydrolas. Det katalyserar avlägsnandet av gammafosfatet från ATP och betafosfatet från ADP.
    2. Överför lösningen till rören, centrifugera vid 70 000 x g i 10 minuter och ta bort supernatanten försiktigt. Återsuspendera pelleten i solubiliserande buffert (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) natriumkolat, 10% (v/v) glycerol).
    3. Överför suspensionen till ett glas Dounce och homogenisera pelleten helt. Tillsätt 10 μM-agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/ml bensamidin, 100 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml Aprotinin och 25 mU/ml apyras till suspensionen och rör om vid 4 °C i 2 timmar.
      OBS: Stegen för homogenisering av pellets är avgörande för produktionen av GPCR-G-proteinkomplexet.
    4. Överför lösningen till rören och centrifugera vid 100 000 x g i 30 minuter vid 4 °C.
    5. Förutjämna flagghartset med tvättbufferten (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 μM-agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN,0,01% (w/v) CHS).
    6. Överför supernatanten till rören och inkubera med flagghartset vid 4 °C i 2 timmar.
    7. Fyll på ovanstående blandning på glaskolonnen och tvätta kolonnen med 50 ml tvättbuffert kompletterad med 100 μg/ml bensamidin, 100 μg/ml leupeptin och 100 μg/ml aprotinin.
    8. Eluera kolonnen med 10 ml av elueringsbufferten innehållande 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/ml Flaggpeptid, 10 μM-agonist, 0,0375 % (w/v) LMNG, 0,0125 % (w/v) GDN, 0,01 % (w/v) CHS, 100 μg/ml bensamidin, 100 μg/ml leupeptin och 100 μg/ml aprotinin.
    9. Samla upp proteinkomplexet S1PRs-G och koncentrera till 1 ml med hjälp av en 100 kDa avskuren koncentrator vid 1 300 x g vid 4 °C. Filtrera genom ett 0,22 μM-filter och centrifugera vid 13 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna ballasten.
    10. Ladda S1PRs-G-proteinkomplexet på en storleksuteslutningskromatografi (SEC) gelfiltreringskolonn som är förutjämnad med SEC-bufferten innehållande 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM-agonist, 100 Μm TCEP, 0,00375% (w/v) LMNG, 0,00125% (w/v) GDN och 0,001% (w/v) CHS vid en flödeshastighet på 0,5 ml/min vid 4 °C.
    11. Samla upp de högsta fraktionerna och koncentrera med hjälp av en 100 kDa avskuren koncentrator vid 1 300 x g vid 4 °C för kryo-EM.

2. Elektronmikroskopi för att lösa S1PR-strukturen

  1. Datainsamling
    1. För att förbereda kryo-EM-gallren, håll 300-mesh Au R1.2 / 1.3-galler i 10 s och glödurladdning i 60 s vid 15 mA med ett glödurladdningsrengöringssystem.
    2. Utför provförglasning enligt beskrivningen tidigare33,34. I doppfrysningskonsolen ställer du in temperaturen på 4 °C och den relativa luftfuktigheten på 100 % för kammarens arbetsmiljö. Använd fläckkraft för 0, väntetid på 0 s, fläcktid på 2 eller 3 s och dräneringstid på 0 s. Det kräver vanligtvis bara 3 μl av provet i koncentrationer på 5-10 mg / ml för enkel förglasning.
    3. Klipp och ladda galler i automatisk nätmontering, ladda automatisk nätmontering i Nanocab och ladda Nanocab i mikroskopet med autoloader som beskrivits tidigare35. Skärmprovkvalitet med EPU2-programvara34. Vanligtvis var de data som samlades in i områdena med lämplig istjocklek bättre.
    4. Samla in kryo-EM-data som beskrivits i detalj tidigare35. För S1P-receptorn ställer du in defokusförskjutningen mellan -1,0 μm och -1,8 μm med exponeringselektrondosen 50-65 e-2. För S1PR1-Gi-komplexen, samla in filmstacken automatiskt med EPU2-programvaran i räkningsläge med K2-detektorn vid en total exponeringstid på 2 s, en inspelningshastighet på fem råbilder per sekund och en total dos på 56 e-2 för att producera 35 bilder per stapel.
      OBS: Vanligtvis behövs mer än 5 000 filmer för att bygga om receptorstrukturen.
  2. Bearbeta data med en kombination av RELION36 och cryoSPARC37 för att få en idealisk kryo-EM-densitetskarta. Använd RELION-3.1_gpu_ompi4 för att bearbeta data initialt som involverar liknande åtgärder som beskrivits tidigare34.
    1. I Linux-systemterminalen anger du den överordnade katalogen för datalagringskatalogen.
    2. Ange kommandot relion i terminalen för att öppna det grafiska användargränssnittet RELION (GUI).
      OBS: Om det här är första gången ett RELION GUI har öppnats i den här katalogen kommer ett snabbt fönster att dyka upp; klicka på Ja.
    3. Klicka på Importera i funktionsfältet till höger om RELION GUI för att importera rådata till RELION.
      1. I alternativet Filmer/mikrofoner väljer du Ja för Importera råa filmer/mikrografer?, anger datasökvägen i fältet Råa indatafiler (jokertecken rekommenderas) och väljer Ja för Är dessa filmer med flera bildrutor?. Ange pixelstorleken för filmer i fältet Pixelstorlek (Ångström), mikroskopets driftspänning (i kV) i fältet Spänning (kV) och mikroskopets sfäriska aberration i fältet Sfärisk aberration (mm). Dessa är de parametrar som registrerades vid tidpunkten för datainsamlingen.
      2. I alternativet Kör ändrar du könamnet enligt servern där programmet körs (andra funktioner måste också ändra den här parametern). Lämna de andra parametrarna vid de standardvärden som angetts av RELION. Slutligen, när alla parametrar upptäcks korrekt, klicka på KÖR! för att köra programmet.
    4. Använd funktionen Rörelsekorrigering för justering av alla bildrutor38.
      1. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra och väljer utgången från Import-funktionen med namnet movies.star som ingång till Input-filmer STAR-fil. Ange dos per bildruta i fältet Dos per bildruta (e/A2) som är lika med den totala dosen dividerat med antalet bildrutor. Välj Nej för Spara summan av effektspektra?.
      2. I alternativet Rörelse anger du 250 för B-faktor, 5,5 för Antal patchar X,Y och 2 för Gruppramar (se till att dosen av grupp >3). Om data inte refererades till vinst under insamlingsperioden behövs en förstärkningsreferensbild som kan erhållas genom att förvärva ett tomt rutnätsområde. Välj Nej för Använd RELION:s egen implementering? och mata in katalogen som innehåller den körbara filen för MOTIONCOR2 39i fältet MOTIONCOR2 körbar fil.
      3. I alternativet Kör väljer du lämpligt MPI- och trådnummer enligt serverns datorkraft; här användes MPI = 8 och trådar = 3.
    5. Använd CTF-uppskattningsfunktionen för att modulera kryo-EM-bilden av förglasat prov40. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra och väljer utgången från Motion cor med namnet korrigerade micrographs.star som indata för Input movies STAR-fil. I alternativet Gctf väljer du Ja för UseGctf i stället?.
    6. Använd urvalsfunktionen Delmängd för att ta bort mikrografer med värdet rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om ELLER välj från micrographs.star och välj utgången från CtfFind med namnet micrographs_ctf.star som ingång. I alternativet Delmängd väljer du Ja för Välj baserat på metadatavärden? och anger 4 för värdet Maximalt metadata för att ta bort felaktiga data.
    7. Manuell plockning: välj några bilder manuellt för det preliminära valet och klassificeringen.
      1. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra och väljer micrographs_selected.star från föregående Välj katalog (Steg 2.2.6) som ingång.
      2. Klicka på RUN! (ett fönster dyker upp). Klicka på Arkiv i det övre vänstra hörnet av det nya fönstret och klicka på Invertera val för att avbryta valet av alla bilder. Markera den vänstra valrutan i motsvarande rad för varje post och klicka på välj för att kontrollera bilderna och välj ~ 500 bra bilder. Klicka på Arkiv > Spara val för att spara de valda bilderna och stänga fönstret.
    8. Automatisk plockning: automatiserade programvarupaket för partikelplockning är användbara och kraftfulla41.
      1. I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Ingångsmikrografer för autopick och välj micrographs_selected.star från föregående ManualPick-katalog (Steg 2.2.7) som ingång. Laplacian-of-Gaussian-algoritmen används i början, så välj Ja för ELLER: använd Laplacian-of-Gaussian.
      2. I alternativet Laplacian anger du Min.diameter för LoG-filter (A) till 80 och Max.diameter för LoG-filter (A) till 130. I alternativet Autopicking anger du Minsta avstånd mellan partiklar (A) till 65 och väljer Ja för Använd GPU-acceleration om GPU kan nås.
    9. Extrahera partiklar för nästa steg.
      1. I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om mikrografen STAR-fil och väljer micrographs_selected.star från steg 2.2.6. Klicka på Bläddra till höger om Inmatningskoordinater och välj cords_suffix_autopick.star från steg 2.2.8.
      2. I alternativet Extrahera väljer du Ja för Skala om partiklar och anger storleken Omskalad (pixlar) till 128 för att påskynda senare steg.
    10. 2D-klassificering för preliminär klassificering av partiklar
      1. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Mata in bilder STAR-fil och välj particles.star från steg 2.2.9. I alternativet Optimering anger du Antal klasser till 100 och Maskdiameter (A) till 140.
      2. I alternativet Beräkna anger du Antal poolade partiklar till 10, anger katalogen som finns på en snabb lokal enhet (t.ex. en SSD-enhet) i fältet Kopiera partikel till scratch-katalogen och väljer Ja för Använd GPU-acceleration? för snabbare bearbetningshastighet.
    11. Delmängdsval för att välja bra 2D-resultat som mallar för att välja partiklar
      1. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Välj klasser från model.star och välj utgången från steg 2.2.10 med namnet run_it025_model.star som ingång. Klicka på RUN!. I popup-fönstret markerar du Sortera bilder på och Omvänd sortering? och klickar på Visa !.
      2. Välj bra representativa 2D-resultat som referens för funktionen Auto-picking.
        De valda resultaten är rutade i rött. De bra och dåliga 2D-klassificeringsresultaten visas senare.
      3. Högerklicka och välj Spara valda klasser.
    12. Använd mallen för den andra omgången av automatisk plockning. I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Ingångsmikrografer för autopick och väljer micrographs_selected.star från steg 2.2.6. Klicka på Bläddra till höger om 2D-referenser, välj class_averages.star från steg 2.2.11 och välj Nej för ELLER: använd Laplacian-of-Gaussian.
    13. Utför partikelextraktion igen med coord_suffix_autopick.star från steg 2.2.12 och micrographs_selected.star från steg 2.2.6.
    14. Utför 2D-klassificering igen med particles.star från steg 2.2.13.
    15. Utför delmängdsval igen med run_it025_optimiser.star från steg 2.2.14.
      OBS: Alla 2D-bilder med tydliga konturer och korrekta former måste väljas.
    16. Utför partikelextraktion enligt följande. I I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om mikrograf STAR-filen, väljer micrographs_selected.star från steg 2.2.6 och väljer Ja för ELLER extraherar raffinerade partiklar igen?. Klicka på Bläddra till höger om Refined particles STAR-filen och välj particles.star från steg 2.2.15.
    17. 3D-initial modell och generera en referenskarta: I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Mata in bilder STAR-fil och välj particles.star från steg 2.2.16. Ange Antal klasser till 1 och Maskdiameter (A) till 140 i alternativet Optimering.
    18. 3D-klassificering och generering av en preliminär 3D-karta: I / O-alternativet klickar du på Bläddra till höger om Mata in bilder STAR-fil och välj particles.star från steg 2.2.16. Klicka på Bläddra till höger om Referenskarta och välj initial_model.mrc från steg 2.2.17. Ange Antal klasser till 4–6 och Maskdiameter (A) till 140 i alternativet Optimering .
    19. Maskgenerering: Välj bra 3D-mappningar från steg 2.2.17 som indata i I /O-alternativet . Ställ in tröskelvärdet för inledande binarisering till 0,05 (justera baserat på utdata), utöka binär mappning så många pixlar till 3 och Lägg till mjuk kant av så många pixlar till 8 i alternativet Mask .
    20. Använd cryoSPARC för nästa bearbetning.
    21. Skapa en ny arbetsyta och klicka på Jobbbyggare för det första jobbet.
    22. Om du vill importera partikelstacken anger du partikelsökvägen (steg 2.2.16) i fältet Partikelmetasökväg och filmens sökväg (steg 2.2.16) i fältet Partikeldatasökväg .
      OBS: Parametrarna Accelererande spänning (kV), Sfärisk avvikelse (mm) och Pixelstorlek (Ångström) är desamma som tidigare. Amplitudkontrast (bråk) värde är 0,1.
    23. Importera 3D-volymer genom att ange sökvägen för den bästa 3D-volymen i steg 2.2.18 i volymdatasökvägen och välja Mappa för Typ av volym som importeras.
    24. Importera mask genom att ange masksökvägen (steg 2.2.19) i volymdatasökvägen och välja Mask för Typ av volym som importeras.
    25. Ej enhetlig förfining: Ta utdata från steg 2.2.22, 2.2.23 och 2.2.24 som indata.
      OBS: Denna funktion är mycket användbar för membranproteiner.
      1. Dra utdata från steg 2.2.22 (imported_particles) som indata från Non-uniform Refinements partiklar (partikel), utgången från steg 2.2.23 (imported_volume_1) som indata för Non-uniform Refinements volym (volym) och utdata från steg 2.2.24 (imported_mask_1) som indata för Non-uniform Refinements mask (mask).
        OBS: Ibland kan bättre resultat uppnås utan mask.
      2. Klicka på för att börja bearbeta.
    26. Kör steg 2.2.18-2.2.25 för bättre resultat. Genom ovanstående serie bearbetning kan en bra upplösning S1PR-Gi 3D-karta erhållas.

3. S1PRs-Gi-medierad cAMP-hämningsanalys

OBS: Det S1PRs-Gi-medierade cAMP-hämningsexperimentet delades upp i flera delar, och följande är detaljerade experimentella procedurer. Den experimentella principen och den allmänna experimentella processen visas i form av ett flödesschema i figur 1.

  1. Plasmider konstruktion
    1. Subklona cDNA av vildtyp S1PR1, S1PR3 och S1PR5 till vektorn pcDNA3.1+ med en HA-signalsekvens följt av en flaggtagg vid N-terminalen (materialtabell).
      OBS: Mutationer för alla receptorer genererades med hjälp av mutagenessatsen (Materialtabell).
  2. Framställning av plasmiden
    1. Tillsätt de rekombinanta pcDNA3.1+ vektorerna eller sensorplasmiden (materialtabellen) till 50 μl DH5α kompetent Escherichia coli (E. coli) som förvaras i ett 1,5 ml rör vid -80 °C separat och inkubera på is i 30 minuter. Värmechocka cellerna vid 42 °C i 90 s, överför dem omedelbart till isen och kyl dem i 2 minuter.
      OBS: Sensorplasmiden som tillhandahålls av Gi-hämning cAMP-analyssatsen (Materialtabell) uttrycker en modifierad luciferasgen smält med en cAMP-bindande domän och ökar luminiscensaktiviteten när cAMP är bunden.
    2. Skaka röret vid 37 °C i 1 timme efter komplettering med 300 μl lysogenibuljong (LB). Platta 100 μl celler till LB-agarplattan och inkubera vid 37 °C genom att hålla i mörker i 48 timmar. Inokulera den vita kolonin till 5 ml LB-medium som innehåller 100 μg/ml Ampicillin och odla vid 37 °C i 16 timmar.
    3. Isolera DNA med hjälp av plasmid miniprep-satsen (materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner; plasmiden hade en koncentration på över 350 ng/μL med värdet A260/A280 mellan 1,7 och 1,9.
  3. Cellodling
    1. Platta CHO-K1-cellerna i en 10 cm petriskål, odla dem i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, och skörda dem när monolagret är vid 80% -90% sammanflöde.
    2. Aspirera CHO-K1-cellernas tillväxtmedium, tillsätt 4 ml 0,05% trypsin-EDTA förvärmd vid 37 ° C på petriskålen försiktigt och inkubera i 15 s. Tillsätt sedan 4 ml tillväxtmedium bestående av F12-medium + 10% FBS.
    3. Lossa cellerna från petriskålens yta genom att försiktigt svänga och knacka på sidan av petriskålen. Fyll ett koniskt rör med cellsuspension. Rör om och pipettera långsamt för att försiktigt ta bort cellklumpar.
    4. Centrifugera celler vid 250 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatant och återuppliva med 3 ml PBS. Upprepa detta steg.
    5. Bestäm cellnummer med hemacytometern och centrifugera celler vid 250 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    6. Aspiratera PBS-buffert och återsuspendera CHO-K1-celler med 3 ml tillväxtmedium bestående av F12-medium och 10% FBS.
    7. Tillsätt 2 ml av tillväxtmediet bestående av F12-medium och 10% FBS i varje brunn på sexbrunnsplattan och frö 150 μL cellsuspension i varje brunn för att hålla cellerna vid densiteten 1,5 x 105 celler / ml. Inkubera sexbrunnsplattan i en 37 °C vävnadsodlingsinkubator med 5%CO2 i cirka 24 timmar.
  4. Övergående transfektion
    1. Späd 2 μg DNA (steg 3.2.3) till 200 μl transfektionsreagensbuffert (materialtabell). Blanda genom att virvla i 10 s och snurra kort före användning.
      OBS: Här innehåller 2 μg DNA 0,5 μg receptorvektor (S1PR1, S1PR3 eller S1PR5) och 1,5 μg sensorplasmid.
    2. Tillsätt 4 μl av transfektionsreagenset (materialtabell), virvel i 10 s och snurra kort före användning. Inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
    3. Släpp långsamt 200 μL transfektblandning i varje brunn (innehållande CHO-K1-celler) för att fördela jämnt. Skaka försiktigt plattan med sex brunnar för att säkerställa noggrann blandning.
    4. Byt ut transfektionsmediet efter 4-6 timmar med celltillväxtmediet bestående av F12-medium + 10% FBS och återför sexbrunnsplattan till inkubatorn.
    5. Skörda celler 24-48 h efter transfektion.
      1. Röta CHO-K1-cellerna på brunnen med 500 μl 0,05 % trypsin-EDTA (förvärmd vid 37 °C) i 15 s ochtillsätt 1 ml tillväxtmedium bestående av F12-medium + 10 % FBS. Lossa cellerna från brunnsytan genom att gunga och försiktigt knacka på sidan av brunnen.
      2. Överför cellsuspensionen till ett koniskt rör och centrifugera vid 250 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Häll av supernatanten och skörda de transfekterade cellerna.
        OBS: Innan fluorescenssignalbestämningen, kontrollera cellytans uttrycksnivåer för receptorer med ELISA som beskrivits tidigare26.
  5. Jämvikt med D-Luciferin-kaliumsalt (materialtabell)
    1. Suspendera de skördade cellerna (24-48 timmar efter transfektionen) med 3 ml analysbuffert omedelbart (dvs. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) innehållande 10 mM HEPES pH 7,4), med ytterligare 3% v/v utspädning av D-Luciferin-kaliumsaltet.
    2. Tillsätt 90 μl cellsuspension per brunn på en 96-brunnsplatta med en flerkanalig pipett och blanda försiktigt.
    3. Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur.
  6. Bestämning av fluorescenssignal
    1. Förbered i förväg 10 mM stamlösningar av Siponimod upplöst i DMSO och gör en seriell utspädning med HBSS-buffert innehållande 25 μM forskolin före ligandstimulering.
      OBS: Förutom kontrollgruppen utan ligand har de återstående ett koncentrationsgradientintervall på 10-11-10-5 mol / L.
    2. Stimulera med 10 μL (per brunn) agonistlösning i olika koncentrationer i 30 min.
    3. Räkna luminiscenssignalerna på en mikroplattläsare med hjälp av tillhörande programvaruparametrar (materialtabell) enligt följande. Välj Luminiscens för detektionsmetod, slutpunkt för lästyp och luminiscensfiber för optiktyp. Ställ in optikförstärkningen255.
      OBS: Varje mätning upprepades i minst tre oberoende experiment, var och en i tre exemplar.
    4. Hämta värdena för fluorescenssignalen, importera data till ett kalkylprogram och bearbeta data med hjälp av den olinjära regressionsfunktionen (kurvpassning).

Figure 1
Bild 1: Schematisk illustration av experimentet. En detaljerad stegvis guide för experimentell installation och körning. I korthet uttrycktes receptorn och modifierat luciferas övergående i CHO-K1-celler genom att transfektera receptorn och sensorplasmiden in i cellerna med transfektionsreagens. Cellerna suspenderades i HBSS-lösning med D-Luciferin-kaliumsalt, luciferassubstratet, och såddes i en 96-brunnsplatta efter 24 timmar. För att tillåta perträngning i cellerna måste D-luciferin vara förbalanserat med cellerna. Det oxidativa enzymet luciferas omvandlar luciferin till oxyluciferin och avger ljus. Det modifierade luciferaset, å andra sidan, genererar ljus via en kemisk reaktion endast när det är bundet till cAMP, och ljusintensiteten har en positiv koppling till cAMP-nivåer i celler. Nivåerna av cAMP reglerades med GPCR aktiverat av agonist. Gi-kopplade receptorer minskade nivåerna av cAMP, vilket krävde tillsats av forskolin för att aktivera adenylylcyklaset i Gi-hämning cAMP-experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan provet av S1PRs-Gi-komplexet fryses måste det renade provet separeras med storleksuteslutningskromatografi (SEC) och analyseras med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 visar S1PR3-Gi-komplexet som ett exempel. Den maximala fraktionen av det homogena GPCR-G-proteinkomplexet var vanligtvis belägen vid ~ 10,5 ml av storleksuteslutningskromatografin (figur 2A). SDS-sidanalys av S1PR3-Gi-komplexet (figur 2B) avslöjar fyra band som motsvarar de teoretiska banden för S1PR3, Gαi, Gβ och scFv16, och föreslår därmed att komplexet framgångsrikt renades. Receptorbandet hittades ofta diffust på grund av olika grader av modifiering (glykosylering eller palmitoylering), och Gγ-bandet hittades inte.

Figure 2
Figur 2: Analys av proteinreningsresultat (A) Gelfiltreringskromatogram som visar den maximala fraktionen som motsvarar proteinet. (B) SDS-sida gelelektroforesmönster. Denna siffra har anpassats från referens27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De komplexa fraktionerna av S1PR3-Gi-komplexet samlades in och koncentrerades för elektronmikroskopi. Förfarandena för och representativa resultat av gallerförglasning och provscreening diskuterades tidigare34. Ett flödesschema (figur 3) presenteras för att erhålla en högupplöst struktur av proteinkomplexet S1PRs-G med hjälp av två olika bearbetningsplattformar: RELION-3 och cryoSPARC v3.

Figure 3
Bild 3: Arbetsflöde för databehandling för de pFTY720-bundna S1PR3-Gi-scFv16-komplexen. Cryo-EM-databehandlingsflödesschema för pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplexet visas. Representativ kryo-EM-mikrograf automatisk plockning, 2D-klassificeringsmedelvärden, 3D-rekonstruktioner och ojämn förfining av pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplexet visas i figuren. Denna siffra har ändrats från referens27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Filmer importerades först till RELION-3, och därefter utfördes rörelsekorrigering och CTF-uppskattning för att generera genomsnittliga mikrografer. Genom att plocka partiklar och iterativ 2D-klassificering erhölls bättre partiklar för vidare bearbetning. Det är viktigt att välja partiklar med väldefinierade 2D-klasser som tydligt representerar den sekundära strukturella informationen för S1PR3-Gi-komplexet (figur 4A), eftersom partiklar av dålig kvalitet kan hindra efterföljande bearbetningssteg (figur 4B), vilket resulterar i en rekonstruktion med lägre upplösning. Med hjälp av 3D-klassificering klassificerades partiklarna ytterligare för att utesluta bruspartiklar, särskilja olika möjliga konformationer och ge flera 3D-rekonstruktioner. Så småningom producerades en S1PR3-Gi komplex EM-karta (figur 5A) med god upplösning via Fourier Shell Correlation (FSC) (Figur 5B), genom ojämn förfining.

Figure 4
Bild 4: Välja 2D-klasser. (A,B) Resultat från 2D-klassificering. (A) Välj medelvärden för 2D-klass som innehåller väldefinierade klasser för vidare bearbetning, och (B) avvisa partiella partiklar eller partiklar med låg upplösning och brus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Högupplöst struktur för de pFTY720-bundna S1PR3-Gi-scFv16-komplexen. (A) Den högupplösta strukturen hos det pFTY720-bundna S1PR3-komplexet visar väldefinierad kryo-EM-densitet som representerar S1PR3- och Gi-proteinstrukturelement. (B) Fourierskalkorrelationskurva (FSC) av guldstandard för pFTY720-bundet S1PR3-Gi-komplex. Denna siffra har anpassats från referens27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Genom att lösa strukturerna i S1PRs-G-proteinkomplexet med kryo-EM belyste vi mekanismen för aktivering, selektiv läkemedelsigenkänning och G-proteinkoppling genom att använda funktionella analyser i cellen. Gi-hämning cAMP-analysen mäter förändringarna i nivån av cAMP-koncentration i celler (figur 1), och den användes ofta för att validera aktiveringsstyrkan hos receptorer i kombination med Gs eller Gi.

Koncentrationsförhållandet mellan receptor och sensorplasmid i experimentsystemet är avgörande för experimentell livskraft. Så för att kunna utföra funktionell analys effektivt och exakt måste man välja ett plasmidkoncentrationsförhållande med ett maximalt E-maxvärde. I detta experiment undersöktes tre koncentrationsförhållanden (1: 1, 1: 3 och 1: 9) mellan receptor och sensorplasmid. Resultaten visade att ett maximalt E-maxvärde erhölls när koncentrationsförhållandet mellan receptor och sensorplasmid var 1:3 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Effekten av olika koncentrationsförhållanden mellan S1PR3 och sensorplasmid på fönsterperioden undersöktes i CHO-K1-cellinjen. Data presenteras som medel ± SEM för tre oberoende experiment som utförs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förutom koncentrationsförhållandet mellan receptorn och sensorplasmiden var cellinjerna som användes i detta experiment också viktiga. Det fanns ingen väsentlig skillnad mellan HEK293 och CHO-K1 cellinjer för de flesta receptorer. CHO-K1-cellinjer, å andra sidan, hade en mer realistisk övergripande kurva än HEK293-celler för S1PR3 (figur 7). Därför valdes CHO-K1-celler för funktionell experimentverifiering av S1PR3.

Figure 7
Figur 7: Effekten av olika koncentrationsförhållanden mellan S1PR3 och sensorplasmid på fönsterperioden undersöktes i HEK293-cellinjen. Data presenteras som medel ± SEM för tre oberoende experiment som utförs i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en primär pipeline för att bestämma strukturerna för S1PR genom kryo-EM och mäta aktiveringsstyrkan hos S1PR med Gi-medierad cAMP-hämningsanalys. Vissa steg är avgörande för experimentets framgång.

För att rena S1PRs-Gi-komplexet bör virusets kvalitet och hälsan hos sf9-celler ägnas mer uppmärksamhet åt. Uttrycket av receptorn reduceras dramatiskt i fattiga sf9-celler . Hälsan hos sf9-celler bedömdes genom att mäta deras diameter. Den friska sf9-cellen har en diameter på ungefär 15 μm. Utbytet av S1PRs-Gi-komplexet påverkas av volymförhållandet mellan receptor-, Gi- och Gβγ-virusen som kan övervinnas genom att montera S1PRs-G-proteinkomplexet in vitro42. Dessutom är GPCR-G-proteinkomplex inte alltid stabila, och därför utvecklades NanoBiT-strategin och har ofta tillämpats för att stabilisera komplexet43.

Provets kvalitet är grunden för allt i kryo-EM-experimentet. Ett aggregerings- eller dissociationsfenomen har ofta observerats vid provscreening. Vissa metoder kan vara till hjälp vid stabilisering av GPCR-G-proteinkomplex. C-terminsresterna av S1PR kan orsaka provaggregering i S1PRs-Gi-komplexprojektet26. Signalvägsanalysen måste användas för att välja en godtagbar C-terminalände för S1PRs26,27. Koncentrationen av LMNG är den näst viktigaste faktorn; överdrivna tvättmedelskoncentrationer kan stabilisera GPCR-G-proteinkomplexet, men de kan också minska dess upplösning, medan låga koncentrationer kan göra motsatsen. Den avgörande aspekten för att stabilisera komplexet är en optimal tvättmedelskoncentration som är så låg som möjligt. Dessutom kan koncentrationen av provet ibland påverka mängden data som samlas in. När vi förglasar ett prov gör vi ofta en lutning. Vid databehandling är valet av algoritmer i partikelval och 2D- eller 3D-klassificering viktigt för att lösa S1PRs-G-proteinkomplexen, särskilt för modellering av ligander och ECL; tätheten av ECL hittades kontinuerlig i S1PR1-strukturen upplöst i litteraturen som beskrivs av Shian Liu et al.42 och hittades diskontinuerlig i S1PR5-strukturer26. Även om det inte finns någon universell lösning på detta problem för alla GPCR-komplex, bör alla strategier som förbättrar EM-densitetskartan provas. De avgörande stegen för förglasning, datainsamling och bildbehandling beskrevs tidigare34,44.

En analys krävs för att utvärdera aktiverings- eller hämningsstyrkan hos S1PR-ligander efter att strukturerna för S1PR har bestämts av kryo-EM. Många tillvägagångssätt kan användas. Gi-hämning cAMP-analys utvärderar receptoraktiveringsstyrkan genom att regelbundet övervaka förändringar i cAMP-nivåer i celler orsakade av agonister. a) Cellodling, b) transfektion, c) molförhållandet mellan plasmidreceptor (eller mutationer) och sensorplasmid, och d) valet av celltyp är alla avgörande för ett framgångsrikt experiment. Cellernas hälsa kan påverka transfektionseffektiviteten och receptor- eller sensoruttrycket, vilket kan ha en betydande inverkan på experimentets signal-brusförhållande. Celler är i allmänhet friska efter 20 generationer, även om detta inte alltid är fallet. Det är viktigt att alltid hålla ett öga på cellernas tillstånd. Trypsindigestionsperioden under cellpassagen måste hanteras tätt eftersom cellens tillstånd har en betydande inverkan över tiden. Transfektionsreagens påverkar receptoruttrycket i flera celltyper, och ett lämpligt cellmärke måste väljas. Mullvadsförhållandet mellan plasmidreceptorn och sensorplasmiden i Gi-hämningsanalysen cAMP måste optimeras. Vi väljer ofta en serie molförhållanden mellan receptor och sensorplasmid och identifierar den högsta variationen av fluorescensintensitet för att säkerställa datanoggrannhet för Gi-hämning cAMP-analys med receptormutanter.

Vissa andra analyser används för att övervaka cellulära cAMP-nivåer i en mängd olika provtyper, såsom ELISA-analys45 och NanoBiT46. cAMP ELISA-analysen används för att mäta mängden cAMP bunden med den specifika antikroppen. Den cAMP-specifika antikroppen förankras på en mikrotiterplatta och peroxidas-cAMP-spårämnet konkurrerar med cAMP om bindning med antikroppen. Mängden peroxidas cAMP-spårämne bundet till plattan mäts med hjälp av fluorometriska tester som är omvänt proportionella mot mängden cAMP. utvecklade 2007 en metod för att övervaka nivåerna av cAMP in vivo kvantitativt och snabbt genom att använda Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) -teknik (cAMP-sensor med YFP-Epac-RLuc)46. NanoBiT-baserad cAMP-analys tillämpar cAMP-sensorn LgBiT-Epac-SmBiT, som ersätter YFP och Rluc med LgBiT respektive SmBiT, och används för att mäta dissociationen av G-protein heterotrimeren eller kopplingen mellan receptorn och G-protein heterotrimer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Data från S1PRs-Gi-komplexet skördades vid West China Cryo-EM Center i Sichuan University och Cryo-EM Center vid Southern University of Science and Technology (SUSTech) och bearbetades vid Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation of China (32100965 till L.C., 32100988 till W.Y., 31972916 till Z.S.) och heltidspostdoktorala forskningsfonden vid Sichuan University (2021SCU12003 till L.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Biokemi utgåva 184
En pipeline för att undersöka strukturer och signalvägar för sfingosin 1-fosfatreceptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter