Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR'ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR'lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Abstract

Lizofosfolipitler (LPL'ler), sfengozin 1-fosfat (S1P), lizofosfatidik asit vb. İçeren biyoaktif lipitlerdir. Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan S1P, sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin (S1PR'ler) aracılık ettiği sinyal yolları aracılığıyla çeşitli hücresel fizyolojik yanıtları düzenleyen en iyi karakterize LPL'lerden biridir. Bu, S1P-S1PR sinyal sisteminin, multipl skleroz (MS), otoimmün bozukluklar, kanser, inflamasyon ve hatta COVID-19 dahil olmak üzere bozukluklar için dikkate değer bir potansiyel terapötik hedef olduğunu göstermektedir. A sınıfı G-protein eşleşmiş reseptör (GPCR) ailesinin küçük bir alt kümesi olan S1PR'ler beş alt tipten oluşur: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ve S1PR5. Bununla birlikte, ayrıntılı yapısal bilgi eksikliği, S1PR'leri hedef alan ilaç keşfini engellemektedir. Burada, S1P-S1PR kompleksinin yapısını çözmek için kriyo-elektron mikroskobu yöntemini uyguladık ve hücre bazlı fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon, seçici ilaç tanıma ve G-protein eşleşmesi mekanizmasını aydınlattık. Diğer lizofosfolipid reseptörleri (LPLR'ler) ve GPCR'ler de bu strateji kullanılarak incelenebilir.

Introduction

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler 4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhibe eden Gi proteini ile birleştirilir; S1PR2 ve S1PR3, Gi, Gq ve G12/13 ile birleştirilir ve S1PR4 ve S1PR5, Gi ve G12/136 üzerinden sinyal dönüştürür.

S1P-S1PR sinyalizasyonu, otoimmün bozukluklar7, inflamasyon8, kanser 9 ve hatta COVID-1910 dahil olmak üzere birçok hastalık için kritik bir terapötik hedeftir. 2010 yılında, fingolimod (FTY720), nüks multipl sklerozu (MS) 11'i tedavi etmek için S1PR'leri hedefleyen birinci sınıf bir ilaç olarak lisanslanmıştır. Bununla birlikte, S1PR2 hariç tüm S1PR'lere bağlanabilirken, S1PR3'e spesifik olmayan bağlanma, serebral korteksin ödemi, vasküler ve bronşiyal daralma ve akciğer epitel sızıntısı12 ile sonuçlanır. Terapötik seçiciliği arttırmak için alternatif bir strateji olarak, reseptör için alt tipe özgü ligandlar üretilmiştir. Siponimod (BAF312) 2019 yılında nüks MS tedavisi için onaylanmıştır13; S1PR1 ve S1PR5'i etkili bir şekilde hedeflerken, S1PR3 için afinitesi yoktur, klinik uygulamada daha az yan etki gösterir14. 2020 yılında, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, MS tedavisi için ozanimod'u yetkilendirdi15. Ozanimod'un S1PR1 için S1PR516'dan 25 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Özellikle, mevcut COVID-19 pandemisi bağlamında, S1PR'leri hedef alan agonist ilaçların, immünomodülatör tedavi teknikleri kullanılarak COVID-19'u tedavi etmek için kullanılabileceği keşfedilmiştir17. Fingolimod ile karşılaştırıldığında, ozanimod COVID-19 hastalarında semptomları azaltmada üstünlük göstermiştir ve şimdi klinik çalışmalardan geçmektedir10. S1PR'lerin yapısal temelini ve işlevini anlamak, S1PR'ler18'i seçici olarak hedefleyen bir ilaç geliştirmek için önemli bir temel oluşturur.

X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve elektron mikroskobu (EM) dahil olmak üzere biyomakromoleküllerin yapısal bilgilerini araştırmak için birçok teknik kullanılmaktadır. Mart 2022 itibariyle, Protein Veri Bankası'na (PDB) yatırılan 180.000'den fazla yapı var ve bunların çoğu X-ışını kristalografisi ile çözüldü. Bununla birlikte, Yifan Cheng ve David Julius tarafından 201319'da bildirilen TPRV1'in ilk atomik çözünürlüğe yakın yapısı (3.4 şçözünürlük) ile, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) protein yapıları için ana akım bir teknik haline gelmiştir ve EM PDB yapılarının toplam sayısı 10.000'den fazlaydı. Kritik atılım alanları, doğrudan elektron algılama kameraları ve yeni görüntü işleme algoritmaları olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesidir. Cryo-EM, son on yılda yapı biyolojisinde ve yapı tabanlı ilaç keşfinde devrim yarattı20. Makromoleküler komplekslerin canlı hücredeki karmaşık rollerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak, biyolojik bilimlerde merkezi bir tema olduğundan, kriyo-EM, özellikle transmembran proteinleri için dinamik moleküler komplekslerin konformasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir21. G-protein eşleşmiş reseptörleri (GPCR'ler), transmembran proteinlerinin en büyük süper ailesidir ve şu anda pazarlanan ilaçların% 30'undan fazlasının hedefleridir22. Kriyo-EM'nin gelişimi, GPCR-G protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının patlamasına katkıda bulunarak, ilaç tasarımında X-ışını kristalografik analizi için hala erişilemeyen 'inatçı' hedefler için yapısal belirlemeyi mümkün kılmıştır23. Bu nedenle, kriyo-EM uygulaması, GPCR'lerin üç boyutlu yapısını, atomik çözünürlük24'e yakın doğal koşullarda belirleme şansı sağlar. Kriyo-EM'deki ilerlemeler, GPCR stimülasyonunun veya inhibisyonunun mekanik temellerini görselleştirmeyi mümkün kılmakta ve GPCR hedefli ilaç üretimi için yeni bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağlamaktadır25.

Kriyo-EM teknolojisinin muazzam adımlarına dayanarak, son zamanlarda26,27 olan acı çeken S1PR1-, S1PR3- ve S1PR5-Gi sinyal komplekslerinin yapılarını belirledik. İnsanlarda, S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri 4,5 için benzersiz tercihler sergiler. S1PR1 öncelikle Gi proteini ile birleştirilir ve bu da daha sonra 3′,5′-siklik adenozin monofosfat (cAMP) üretimini inhibe eder. S1PR3 ve S1PR5 ayrıca Gi 6,28 ile birleşebilir. Gi-kuplajlı reseptör aktivasyonu cAMP29'un üretimini azalttığından, fonksiyonel değişiklikleri yakalamak için cAMP inhibisyon etkilerini ölçmek için bir Gi-inhibisyon cAMP testi tanıtıldı26,27. Bir cAMP bağlayıcı protein parçasının yerleştirildiği Photinus pyralis luciferase'in mutant bir versiyonunu kullanarak, bu cAMP testi, hücre içi cAMP konsantrasyonundaki değişiklikler yoluyla GPCR aktivitesini izlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sunar30. Hassas ve radyoaktif olmayan fonksiyonel bir testtir ve ilaç keşfi amacıyla çok çeşitli GPCR'lerin gerçek zamanlı aşağı akış sinyalizasyonunu izlemek için uygulanabilir31.

Burada, öncelikle kriyo-EM manipülasyonları ve bir Gi-inhibisyon cAMP testi dahil olmak üzere, S1PR'lerin aktivasyon ve ilaç tanıma modlarının çözümünde kritik yöntemlerin bir özeti verilmiştir. Bu makale, GPCR'lerin yapı ve işlevlerine yönelik daha ileri araştırmalar için kapsamlı deneysel rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S1PRs-G protein kompleksinin saflaştırılması

  1. İnsan S1PR'leri-G protein kompleksini saflaştırmak için, C-terminal kalıntıları 338-382'den yoksun olan S1PR1'in cDNA'larını, C-terminus'ta 345-398 ile kesilmiş vahşi tip S1PR3, S1PR5'i ve vahşi tip Gi1'i pFastBac1 vektörüne ve vahşi tip Gβ1 ve Gγ2'nin cDNA'larını pFastBacdual vektörüne (Malzeme Tablosu) klonlayın.
    NOT: S1PR'ler için tüm yapılar ayrıca haemagglutinin (HA) sinyal dizisini ve ardından N-terminusunda bir Flag epitop etiketi ve C-terminus'ta 10x onun etiketini içerir. Ayrıca, T4 lizozimini (T4L) çevirmek için sentetik bir DNA dizisi (Malzeme Tablosu), reseptör ekspresyonunu ve saflaştırmasını kolaylaştırmak için S1PR'lerin N-terminüsüne yerleştirildi.
  2. S1PR'ler, Gi1 ve Gβ1γ2 kodlayan bakülovirüs kodlamasının hazırlanması
    1. Rekombinant vektörleri, -80 ° C'de 1,5 mL'lik bir tüpte depolanan 50 μL DH5α yetkili Escherichia coli'ye (E. coli) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    2. Hücreleri 42 ° C'de 90 sn boyunca ısıl şoka sokun, hemen buza aktarın ve 2 dakika soğutun.
    3. 300 μL lizojen et suyu (LB) ortamı ile takviye ettikten sonra tüpü 37 ° C'de 3-5 saat çalkalayın. LB agar plakasına 100 μL hücre plakası ve 48 saat karanlıkta tutarak 37 °C'de inkübe edin.
    4. Beyaz koloniyi, 50 μg / mL kanamisin, 10 μg / mL tetrasiklin ve 7 μg / mL gentamisinin içeren 5 mL LB ortamına ve 16 saat boyunca 37 ° C'de kültüre aşılayın.
    5. P0 bakülovirüsünü üretmek için üreticinin talimatlarını izleyerek rekombinant bacmid'i plazmid miniprep kiti (Malzeme Tablosu) ile izole edin.
      NOT: Kullanmadan önce, saflaştırılmış bacmid, pUC / M13 ileri ve geri primerleri ile PCR ile analiz edildi. PCR için, döngü sayısı = 30 döngü, erime sıcaklığı = 58 °C ve uzatma süresi = 1 Kb başına 1 dakika.
    6. P0 bakülovirüsünü daha önceki bir protokol32'de açıklandığı gibi hazırlayın.
      1. Sf9 hücrelerini (ESF921 ortamı) altı delikli plakalarda kültürleyin ve hücrelerin log fazında (1.0-1.5 x 106 hücre / mL) olduğunu doğrulayın.
      2. 8 μL bakülovirüs transfeksiyon reaktifini 100 μL Grace ortamında seyreltin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Rekombinant bacmidin 10 μg'ını Grace'in ortamının 100 μL'sinde seyreltin ve yavaşça karıştırın. Seyreltilmiş bacmid'i seyreltilmiş bakülovirüs transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
      3. Karışımı (bacmid ve reaktif) hücrelere ekleyin (Adım 1.2.6.1) ve 3 saat boyunca 27 ° C'de tabaklayın.
      4. Grace'in ortamını çıkarın ve 2 mL ESF921 hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Altı kuyucuklu plakaları 27 ° C'de plakalayın ve transfeksiyondan 5 gün sonra ESF921 hücre kültürü ortamını toplayın.
      5. Hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için 10 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı 2 mL tüplere aktarın. Bu P0 bakülovirüs stoğudur.
    7. P1 virüs stoğunu izole edin
      1. 30 mL sf9 hücrelerini konik bir şişeye aktarın, 270 rpm'de sallanarak 27 ° C'de kültür yapın ve hücrelerin bir günlük fazına (1.0-1.5 x 106 hücre / mL) ulaştığını doğrulayın.
      2. Şişeye 2 mL P0 virüs stoğu ekleyin ve 27 ° C'de 4 gün boyunca 270 rpm'de çalkalayın.
      3. Hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın, hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı 50 mL tüplere aktarın. Bu P1 bakülovirüs stoğudur.
    8. Baküloviral stoğu güçlendirin
      1. Günlük aşamasında 50 mL sf9 hücresi (1,0-1,5 x 106 hücre/mL) ve 1 mL P1 stoğu kullanarak adım 1.2.7'yi tekrarlayın.
      2. Elde edilen P2 bakülovirüs stoğunu 4 °C'de saklayın ve ışıktan koruyun.
        NOT: Bakülovirüsü süresiz olarak büyütmeyin, çünkü zararlı mutantlar her geçişte üretilir.
  3. S1PRs-G protein kompleksinin ekspresyonu
    1. Kültür sf9 böcek hücreleri 2.5 x 106 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak, P2 bakülovirüs kodlama S1PR'ler, Gi1 ve Gβ1γ2 ile 1: 2: 1 hacim oranında birlikte enfekte olmak ve 48 saat boyunca tekrar 27 ° C'de kültür.
    2. 15 dakika boyunca 4 °C'de 700 x g'de santrifüj yaparak hücreleri toplayın, sıvı azotta dondurun ve kullanım için -80 °C'de saklayın.
  4. Protein saflaştırma
    1. Adım 1.3'te elde edilen hücre peletini oda sıcaklığında çözün ve daha sonra 100 μg / mL benzamidin, 100 μg / mL leupeptin, 100 μg / mL aprotinin,25 mU / mL apiraz ve 10 μM agonisti ile desteklenmiş lizis tamponunda (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl 2) yeniden askıya alın. S1PRs-G protein kompleksinin oluşumunu indüklemek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
      NOT: Apiraz bir ATP difosfohidrolazdır. Gama fosfatının ATP'den ve beta fosfatın ADP'den uzaklaştırılmasını katalize eder.
    2. Çözeltiyi tüplere aktarın, 10 dakika boyunca 70.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Peletin çözünür tamponda (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2, %0.5 (w/v) LMNG, %0.1 (w/v) CHS, %1 (w/v) sodyum kolat, %10 (v/v) gliserol) içinde yeniden askıya alın.
    3. Süspansiyonu bir cam sıçramasına aktarın ve peleti tamamen homojenize edin. Süspansiyona 10 μM agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/mL benzamidin, 100 μg/mL leupeptin, 100 μg/mL Aprotinin ve 25 mU/mL apiraz ekleyin ve 2 saat boyunca 4 °C'de karıştırın.
      NOT: Peletlerin homojenize edilmesi adımları, GPCR-G protein kompleksinin üretimi için çok önemlidir.
    4. Çözeltiyi tüplere aktarın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 100.000 x g'de santrifüj yapın.
    5. Bayrak reçinesini yıkama tamponu ile önceden dengeleyin (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 5 mM CaCl2, 10 μM agonist,% 0.0375 (w/v) LMNG, 0.0125% (w/v) GDN, 0.01% (w/v) CHS).
    6. Süpernatantı tüplere aktarın ve bayrak reçinesi ile 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    7. Yukarıdaki karışımı cam kolona yükleyin ve kolonu 100 μg / mL benzamidin, 100 μg / mL leupeptin ve 100 μg / mL aprotinin ile desteklenmiş 50 mL yıkama tamponu ile yıkayın.
    8. 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/mL Bayrak peptidi, 10 μM agonist, %0.0375 (w/v) LMNG, %0.0125 (w/v) GDN, %0.01 (w/v) CHS, 100 μg/mL benzamidin, 100 μg/mL leupeptin ve 100 μg/mL aprotinin içeren 10 mL elüsyon tamponu ile sütunu süzün.
    9. S1PRs-G protein kompleksini toplayın ve 4 ° C'de 1.300 x g'de 100 kDa kesme yoğunlaştırıcı kullanarak 1 mL'ye konsantre olun. 0,22 μM filtreden süzün ve agregaları çıkarmak için 13.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    10. S1PRs-G protein kompleksini, 4 °C'de 0,5 mL / dak akış hızında 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM TCEP,% 0,00375 (w / v) LMNG,% 0,00125 (w / v) GDN ve% 0,001 (w / v) CHS içeren SEC tamponu ile önceden dengelenmiş bir boyut hariç tutma kromatografisi (SEC) jel filtrasyon kolonuna yükleyin.
    11. Tepe fraksiyonlarını toplayın ve kriyo-EM için 4 ° C'de 1.300 x g'da 100 kDa kesme yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre olun.

2. S1PR'lerin yapısını çözmek için elektron mikroskobu

  1. Veri toplama
    1. Kriyo-EM ızgaralarını hazırlamak için, 10 s için 300 mesh Au R1.2/1.3 ızgaraları tutun ve bir kızdırma deşarj temizleme sistemi kullanarak 15 mA'da 60 s için kızdırma deşarjı yapın.
    2. Daha önce açıklandığı gibi numune vitrifikasyonu gerçekleştirin33,34. Dalma dondurma konsolunda, oda çalışma ortamı için sıcaklığı 4 °C'ye ve bağıl nemi %100'e ayarlayın. 0 için leke kuvveti, 0 s bekleme süresi, 2 veya 3 s leke süresi ve 0 s boşaltma süresi kullanın. Genellikle tek vitrifikasyon için 5-10 mg / mL konsantrasyonlarında numunenin sadece 3 μL'sini gerektirir.
    3. Izgaraları otomatik ızgara montajına klipsleyin ve yükleyin, otomatik ızgara montajını Nanocab'a yükleyin ve Nanocab'ı daha önce açıklandığı gibi otomatik yükleyici ile mikroskopa yükleyin35. EPU2 yazılımı ile ekran örneği kalitesi34. Genellikle, uygun buz kalınlığına sahip alanlarda toplanan veriler daha iyiydi.
    4. Daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kriyo-EM verilerini toplayın35. S1P reseptörü için, 50-65 e-/Å2 maruz kalma elektron dozu ile bulanıklaştırma ofsetini -1.0 μm ile -1.8 μm arasında ayarlayın. S1PR1-Gi kompleksleri için, K2 dedektörü ile sayma modunda EPU2 yazılımını kullanarak film yığınını otomatik olarak toplayın, toplam 2 sn pozlama süresinde, saniyede beş ham kare kayıt hızında ve yığın başına 35 kare üretmek için toplam 56 e-/Å2 dozunda.
      NOT: Genellikle, reseptör yapısını yeniden oluşturmak için 5.000'den fazla filme ihtiyaç vardır.
  2. RELION'un bir kombinasyonunu kullanarak verileri işleme36 ve kriyoSPARC37 ideal bir kriyo-EM yoğunluk haritası elde etmek için. Daha önce açıklandığı gibi benzer işlemleri içeren verileri başlangıçta işlemek için RELION-3.1_gpu_ompi4 kullanın34.
    1. Linux sistem terminalinde, veri depolama dizininin üst dizinini girin.
    2. RELION grafik kullanıcı arabirimini (GUI) açmak için terminale relion komutunu girin.
      NOT: Bu dizinde ilk kez bir RELION GUI açılıyorsa, bir istem penceresi açılır; Evet'e tıklayın.
    3. Ham verileri RELION'a aktarmak için RELION GUI'sinin sağ tarafındaki işlev çubuğunda İçe Aktar'a tıklayın.
      1. Filmler/mikrofonlar seçeneğinde, Ham filmleri/mikrografları içeri aktar için Evet'i seçin, Ham giriş dosyaları alanına veri yolunu girin (joker karakterler önerilir) ve Bunlar çok kareli filmler mi? için Evet'i seçin. Piksel boyutu (Angstrom) alanına filmlerin piksel boyutunu, Gerilim (kV) alanına mikroskop çalışma voltajını (kV cinsinden) ve Küresel sapma (mm) alanına mikroskobun küresel sapmasını girin. Bunlar, veri toplama sırasında kaydedilen parametrelerdir.
      2. Çalışıyor seçeneğinde, Sıra adını programın çalıştığı sunucuya göre değiştirin (diğer işlevlerin de bu parametreyi değiştirmesi gerekir). Diğer parametreleri RELION tarafından ayarlanan varsayılan değerlerde bırakın. Son olarak, tüm parametreler doğru algılandığında, programı çalıştırmak için RUN! öğesine tıklayın.
    4. Tüm karelerin hizalanması için Hareket düzeltme işlevini kullanın38.
      1. G / Ç seçeneğinde, Gözat'a tıklayın ve Giriş filmleri STAR dosyasının girişi olarak movies.star adlı İçe Aktar işlevinin çıktısını seçin. Kare başına doz (e/A2) alanına, toplam dozun kare sayısına bölünmesiyle elde edilen kare başına dozu girin. Güç spektrumlarının toplamından tasarruf etmek için Hayır'ı seçin.
      2. Hareket seçeneğinde, B faktörü için 250, X,Y yama sayısı için 5,5 ve Grup kareleri için 2 girin (grup >3'ün dozunu sağlayın). Toplama döneminde verilere kazanç referansı verilmemişse, boş bir ızgara alanı elde edilerek elde edilebilecek bir kazanç referans görüntüsüne ihtiyaç vardır. RELION'un kendi uygulamasını kullan? için Hayır'ı seçin ve MOTIONCOR2 yürütülebilir dosyasını içeren dizini MOTIONCOR2 yürütülebilir alanına girin.
      3. Çalışıyor seçeneğinde, sunucunun bilgi işlem gücüne göre uygun MPI ve iş parçacığı numarasını seçin; burada MPI = 8 ve iş parçacıkları = 3 kullanılmıştır.
    5. Vitrifiye numune40'ın kriyo-EM görüntüsünü modüle etmek için CTF tahmin fonksiyonunu kullanın. G/Ç seçeneğinde, Gözat'a tıklayın ve Giriş filmleri STAR dosyasının girişi olarak düzeltilmiş micrographs.star adlı Motion cor çıktısını seçin. Gctf seçeneğinde, bunun yerine UseGctf için Evet'i seçin.
    6. rlnCtfMaxResolutin >4 değerine sahip mikrografları kaldırmak için Alt Küme seçim işlevini kullanın.
      1. G/Ç seçeneğinde, Gözat'a tıklayın VEYA micrographs.star'dan seçin ve giriş olarak micrographs_ctf.star adlı CtfFind çıktısını seçin. Alt Küme seçeneğinde, Meta veri değerlerine göre seç? için Evet'i seçin ve hatalı verileri kaldırmak üzere maksimum meta veri değeri için 4 girin.
    7. Manuel toplama: Ön toplama ve sınıflandırma için bazı görüntüleri manuel olarak seçin.
      1. G/Ç seçeneğinde, Gözat'a tıklayın ve giriş olarak önceki Seç dizininden (Adım 2.2.6) micrographs_selected.star'ı seçin.
      2. RUN! üzerine tıklayın (bir pencere açılır). Yeni pencerenin sol üst köşesindeki Dosya'ya tıklayın ve tüm görüntülerin seçimini iptal etmek için Seçimi tersine çevir'e tıklayın. Her girişin ilgili satırındaki en soldaki seçim kutusunu işaretleyin ve görüntüleri kontrol etmek için seç'e tıklayın ve ~ 500 iyi görüntü seçin. Seçilen görüntüleri kaydetmek ve pencereyi kapatmak için Dosya > Kaydet seçimine tıklayın.
    8. Otomatik toplama: Otomatik partikül toplama yazılım paketleri kullanışlı ve güçlüdür41.
      1. G/Ç seçeneğinde, otomatik seçim için Giriş mikrografları'nın sağındaki Gözat'a tıklayın ve giriş olarak önceki ManualPick dizininden (Adım 2.2.7) micrographs_selected.star'ı seçin. Başlangıçta Laplacian-of-Gauss algoritması kullanılır, bu nedenle OR için Evet'i seçin: Laplacian-of-Gaussian'ı kullanın.
      2. Laplacian seçeneğinde, LoG filtresi (A) için Min.diameter'ı 80 ve LoG filtresi (A) için Max.diameter'ı 130 olarak ayarlayın. Otomatik Toplama seçeneğinde, Minimum parçacıklar arası mesafe (A) değerini 65 olarak ayarlayın ve GPU'ya erişilebiliyorsa GPU hızlandırmayı kullan için Evet'i seçin.
    9. Sonraki adımlar için parçacıkları çıkarın.
      1. G / Ç seçeneğinde, mikrograf STAR dosyasının sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.6'dan micrographs_selected.star'ı seçin. Giriş koordinatları'nın sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.8'den cords_suffix_autopick.yıldızını seçin.
      2. Ayıklama seçeneğinde, Parçacıkları yeniden ölçeklendirmek için Evet'i seçin ve sonraki adımları hızlandırmak için Yeniden ölçeklendirilmiş boyutu (piksel) 128 olarak ayarlayın.
    10. Parçacıkların ön sınıflandırması için 2D sınıflandırma
      1. G/Ç seçeneğinde, Giriş görüntüleri STAR dosyasının sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.9'dan particles.star'ı seçin. Optimizasyon seçeneğinde, Sınıf sayısı değerini 100 ve Maske çapı (A) değerini 140 olarak ayarlayın.
      2. İşlem seçeneğinde, Havuza alınan parçacık sayısı öğesini 10 olarak ayarlayın, parçacığı çizilmeye kopyala dizini alanına hızlı bir yerel sürücüde (ör. SSD sürücüsü) bulunan dizini girin ve daha hızlı işlem hızı için GPU hızlandırma kullan? için Evet'i seçin.
    11. Parçacıkları seçmek için şablon olarak iyi 2D sonuçları seçmek için alt küme seçimi
      1. G/Ç seçeneğinde, Model.star'dan sınıf seç'in sağındaki Gözat'a tıklayın ve giriş olarak run_it025_model.star adlı Adım 2.2.10'un çıktısını seçin. ÇALIŞTIR!'a tıklayın. Açılır pencerede, Görüntüleri sırala ve Ters sıralama? seçeneğini işaretleyin ve Ekran!'a tıklayın.
      2. Otomatik toplama işlevinin Referansı için referans olarak iyi temsili 2B sonuçları seçin.
        NOT: Seçilen sonuçlar kırmızı kutuludur. İyi ve kötü 2D sınıflandırma sonuçları daha sonra gösterilmiştir.
      3. Sağ tıklayın ve Seçilen sınıfları kaydet'i seçin.
    12. Otomatik toplamanın ikinci turu için şablonu kullanın. G/Ç seçeneğinde, Otomatik seçim için Giriş mikrografları'nın sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.6'dan micrographs_selected.star'ı seçin. 2B referansların sağındaki Gözat'a tıklayın, Adım 2.2.11'den class_averages.star'ı seçin ve VEYA için Hayır'ı seçin: Laplacian-of-Gaussia n'yi kullanın.
    13. Adım 2.2.12'den coord_suffix_autopick.star'ı ve Adım 2.2.6'dan micrographs_selected.star'ı kullanarak parçacık ekstraksiyonunu tekrar gerçekleştirin.
    14. Adım 2.2.13'teki particles.star'ı kullanarak 2B sınıflandırmayı tekrar gerçekleştirin.
    15. Adım 2.2.14'teki run_it025_optimiser.star'ı kullanarak alt küme seçimini yeniden gerçekleştirin.
      NOT: Net konturlara ve doğru şekillere sahip tüm 2D görüntülerin seçilmesi gerekir.
    16. Aşağıdaki gibi parçacık ekstraksiyonu gerçekleştirin. G/Ç seçeneğinde, mikrograf STAR dosyasının sağındaki Gözat'a tıklayın, Adım 2.2.6'dan micrographs_selected.star'ı seçin ve OR rafine edilmiş parçacıkları yeniden ayıklayın? Rafine parçacıklar STAR dosyasının sağına Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.15'ten particles.star'ı seçin.
    17. 3B başlangıç modeli ve referans haritası oluşturma: G/Ç seçeneğinde, Giriş görüntüleri STAR dosyasının sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.16'dan particles.star'ı seçin. Optimizasyon seçeneğinde Sınıf sayısı'nı 1 ve Maske çapı (A) değerini 140 olarak ayarlayın.
    18. 3B sınıflandırma ve bir ön 3B harita oluşturma: G/Ç seçeneğinde, Giriş görüntüleri STAR dosyasının sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.16'dan particles.star'ı seçin. Referans haritasının sağındaki Gözat'a tıklayın ve Adım 2.2.17'den initial_model.mrc dosyasını seçin. Optimizasyon seçeneğinde Sınıf sayısı'nı 4-6 ve Maske çapı'nı (A) 140 olarak ayarlayın.
    19. Maske oluşturma: G/Ç seçeneğinde giriş olarak Adım 2.2.17'den iyi 3B haritaları seçin. İlk bağlama eşiğini 0,05 olarak ayarlayın (çıktıya göre ayarlayın), İkili eşlemeyi bu kadar pikseli 3'e genişlet ve Maske seçeneğinde Bu sayıda pikselin yumuşak kenarını 8'e ekle.
    20. Bir sonraki işlem için cryoSPARC kullanın.
    21. Yeni bir çalışma alanı oluşturun ve ilk iş için İş Oluşturucu'ya tıklayın.
    22. Parçacık yığınını içe aktarmak için, Parçacık meta yolu alanına parçacık yolunu (Adım 2.2.16) ve Parçacık veri yolu alanına filmin yolunu (Adım 2.2.16) girin.
      NOT: Hızlanan Gerilim (kV), Küresel Sapma (mm) ve Piksel Boyutu (Angstrom) parametreleri öncekiyle aynıdır. Genlik Kontrastı (fraksiyon) değeri 0.1'dir.
    23. Birim veri yolundaki Adım 2.2.18'de en iyi 3B birimin yolunu girerek ve İçe aktarılan birimin türü için Eşle'yi seçerek 3B birimleri içe aktarın.
    24. Birim veri yoluna maske yolunu (Adım 2.2.19) girip İçe aktarılan birimin türü için Maske'yi seçerek maskeyi içe aktarın.
    25. Tekdüze Olmayan İyileştirme: 2.2.22, 2.2.23 ve 2.2.24 adımlarının çıktılarını girdi olarak alın.
      NOT: Bu fonksiyon membran proteinleri için çok yararlıdır.
      1. Adım 2.2.22'nin (imported_particles) çıktısını Üniforma Olmayan Arıtma'nın parçacıklarının (parçacık) girdisi olarak, Adım 2.2.23'ün (imported_volume_1) çıktısını Tekdüze Olmayan İyileştirme'nin hacminin (hacim) girdisi olarak ve Adım 2.2.24'ün ( imported_mask_1) çıktısını Düzgün Olmayan Arıtma'nın maskesinin (maske) girdisi olarak sürükleyin.
        NOT: Bazen maskesiz daha iyi sonuçlar elde edilebilir.
      2. İşlemi başlatmak için Kuyruk'u tıklatın.
    26. Daha iyi sonuçlar için Adım 2.2.18-2.2.25'i çalıştırın. Yukarıdaki işlem serisi sayesinde, iyi çözünürlüklü bir S1PR-Gi 3D haritası elde edilebilir.

3. S1PRs-Gi aracılı cAMP inhibisyon testi

NOT: S1PRs-Gi aracılı cAMP inhibisyon deneyi birkaç bölüme ayrılmıştır ve aşağıdakiler ayrıntılı deneysel prosedürlerdir. Deney prensibi ve genel deney süreci Şekil 1'de bir akış şeması şeklinde gösterilmiştir.

  1. Plazmid yapımı
    1. Vahşi tip S1PR1, S1PR3 ve S1PR5'in cDNA'larını pcDNA3.1+ vektörüne bir HA sinyal dizisi ve ardından N-terminusunda (Malzeme Tablosu) bir Bayrak etiketi ile alt klonlayın.
      NOT: Tüm reseptörler için mutasyonlar, mutagenez kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak üretildi.
  2. Plazmidin hazırlanması
    1. Rekombinant pcDNA3.1+ vektörlerini veya Sensör plazmidini (Malzeme Tablosu) -80 °C'de 1,5 mL'lik bir tüpte ayrı ayrı saklanan 50 μL DH5α yetkin Escherichia coli'ye (E. coli) ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri 42 ° C'de 90 sn boyunca ısıl şoka sokun, hemen buza aktarın ve 2 dakika soğutun.
      NOT: Gi-inhibisyon cAMP tahlil kiti (Malzeme Tablosu) tarafından sağlanan Sensör plazmid, bir cAMP bağlanma alanı ile kaynaşmış modifiye edilmiş bir lusiferaz genini ifade eder ve cAMP bağlandığında lüminesans aktivitesini arttırır.
    2. 300 μL lizojen et suyu (LB) ortamı ile takviye ettikten sonra tüpü 37 ° C'de 1 saat çalkalayın. LB agar plakasına 100 μL hücre plakası ve 48 saat karanlıkta tutarak 37 °C'de inkübe edin. Beyaz koloniyi, 100 μg / mL Ampisilin içeren 5 mL LB ortamına ve 16 saat boyunca 37 ° C'de kültüre aşılayın.
    3. Üreticinin talimatlarını izleyerek plazmid miniprep kitini (Malzeme Tablosu) kullanarak DNA'yı izole edin; plazmid, 1.7 ile 1.9 arasında A260 / A280 değeri ile 350 ng / μL'nin üzerinde bir konsantrasyondaydı.
  3. Hücre kültürü
    1. CHO-K1 hücrelerini 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin,% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin ve tek katman% 80 -% 90 birleştiğinde hasat edin.
    2. CHO-K1 hücreleri büyüme ortamını aspire edin, Petri kabına nazikçe 37 ° C'de önceden ısıtılmış 4 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve 15 s için inkübe edin. Ardından, F12 ortamı +% 10 FBS'den oluşan 4 mL büyüme ortamı ekleyin.
    3. Petri kabının yan tarafına hafifçe sallanarak ve dokunarak hücreleri Petri kabı yüzeyinden çıkarın. Konik bir tüpü hücre süspansiyonu ile doldurun. Hücre kümelerini nazikçe çıkarmak için yavaşça karıştırın ve pipet çekin.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'da hücreleri santrifüj yapın, süpernatan aspire edin ve 3 mL PBS ile yeniden canlandırın. Bu adımı tekrarlayın.
    5. Hemasitometre ile hücre sayısını belirleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın.
    6. PBS tamponunu aspire edin ve F12 ortamı ve% 10 FBS'den oluşan 3 mL büyüme ortamı ile CHO-K1 hücrelerini yeniden askıya alın.
    7. Altı delikli plakanın her bir kuyucuğuna F12 ortamı ve% 10 FBS'den oluşan 2 mL büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri 1.5 x 10 5 hücre / mL yoğunluğunda tutmak için her bir kuyucuğa150 μL hücre süspansiyonu tohumlayın. Altı kuyucuklu plakayı 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatöründe yaklaşık24 saat boyunca% 5 CO 2 ile inkübe edin.
  4. Geçici transfeksiyon
    1. 2 μg DNA'yı (Adım 3.2.3) 200 μL transfeksiyon reaktif tamponuna (Malzeme Tablosu) seyreltin. Kullanmadan önce 10 s vorteks ile karıştırın ve kısa bir süre eğirin.
      NOT: Burada, 2 μg DNA, 0.5 μg reseptör vektörü (S1PR1, S1PR3 veya S1PR5) ve 1.5 μg Sensör plazmidi içerir.
    2. Transfeksiyon reaktifinden 4 μL (Malzeme Tablosu), 10 sn vorteks ekleyin ve kullanmadan önce kısa bir süre döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Eşit olarak dağıtmak için 200 μL transfeksiyon karışımını her bir oyuğa (CHO-K1 hücreleri içeren) yavaşça bırakın. Tam karıştırmayı sağlamak için altı delikli plakayı yavaşça sallayın.
    4. Transfeksiyon ortamını 4-6 saat sonra F12 ortamı +% 10 FBS'den oluşan hücre büyüme ortamı ile değiştirin ve altı delikli plakayı inkübatöre geri koyun.
    5. Transfeksiyon sonrası hücreleri 24-48 saat hasat edin.
      1. Kuyudaki CHO-K1 hücrelerini 15 s için 500 μL% 0.05 tripsin-EDTA (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ile sindirin ve F12 orta +% 10 FBS'den oluşan 1 mL büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri kuyu yüzeyinden sallayarak ve kuyunun kenarına hafifçe dokunarak yerinden çıkarın.
      2. Hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dökün ve transfekte hücreleri toplayın.
        NOT: Floresan sinyali belirlemeden önce, daha önce açıklandığı gibi ELISA tarafından reseptörlerin hücre yüzey ekspresyon seviyelerini kontrol edin26.
  5. D-Luciferin-potasyum tuzu ile denge (Malzeme Tablosu)
    1. Hasat edilen hücreleri (transfeksiyon sonrası 24-48 saat) derhal 3 mL tahlil tamponu ile askıya alın (yani, 10 mM HEPES pH 7.4 içeren Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), D-Luciferin-potasyum tuzunun ilave %3 v / v seyreltilmesiyle.
    2. Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 90 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve yavaşça karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
  6. Floresan sinyal tayini
    1. DMSO'da çözünmüş Siponimod'un 10 mM stok çözeltilerini önceden hazırlayın ve ligand stimülasyonundan önce 25 μM forskolin içeren HBSS tamponunu kullanarak seri seyreltme yapın.
      NOT: Ligandsız kontrol grubu hariç, geri kalanlar 10-11-10-5 mol/L konsantrasyon gradyan aralığına sahiptir.
    2. 30 dakika boyunca farklı konsantrasyonlarda 10 μL (kuyucuk başına) agonist çözeltisi ile uyarın.
    3. İlgili yazılım (Malzeme Tablosu) parametrelerini kullanarak bir mikroplaka okuyucudaki lüminesans sinyallerini aşağıdaki gibi sayın. Algılama Yöntemi için Lüminesans, Okuma Türü için Uç Nokta ve Optik Türü için Lüminesans Fiber'i seçin. Optik kazancını 255 olarak ayarlayın.
      NOT: Her ölçüm, her biri üçlü olarak en az üç bağımsız deneyde tekrarlanmıştır.
    4. Floresan sinyalinin değerlerini elde edin, verileri bir elektronik tablo programına aktarın ve doğrusal olmayan regresyon (eğriye uyma) doz-yanıt işlevini kullanarak verileri işleyin.

Figure 1
Şekil 1: Deneyin şematik gösterimi. Deneysel kurulum ve yürütme için ayrıntılı bir adım adım kılavuz. Kısacası, reseptör ve modifiye lusiferaz, reseptör ve Sensör plazmidinin transfeksiyon reaktifi ile hücrelere transfeksiyonu yapılarak CHO-K1 hücrelerinde geçici olarak birlikte eksprese edildi. Hücreler, HBSS çözeltisinde D-Luciferin-potasyum tuzu, lusiferaz substratı ile askıya alındı ve 24 saat sonra 96 kuyucuklu bir plakaya tohumlandı. Hücrelere nüfuz etmesine izin vermek için, D-luciferin hücrelerle önceden dengelenmelidir. Oksidatif enzim lusiferaz, lusiferini oksilusiferine dönüştürür ve ışık yayar. Öte yandan, modifiye lusiferaz, yalnızca cAMP'ye bağlandığında kimyasal bir reaksiyon yoluyla ışık üretir ve ışığın yoğunluğu, hücrelerdeki cAMP seviyeleri ile pozitif bir ilişkiye sahiptir. cAMP düzeyleri agonist tarafından aktive edilen GPCR ile düzenlendi. Gi-kuplajlı reseptörler cAMP seviyelerini düşürdü ve Gi-inhibisyon cAMP deneyinde adenilil siklazı aktive etmek için forskolin eklenmesini gerektirdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

S1PRs-Gi kompleksinin numunesini dondurmadan önce, saflaştırılmış numunenin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrılması ve jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmesi gerekir. Şekil 2 , örnek olarak S1PR3-Gi kompleksini göstermektedir. Homojen GPCR-G protein kompleksinin tepe fraksiyonu genellikle boyut dışlama kromatografisinin ~ 10.5 mL'sinde bulunuyordu (Şekil 2A). S1PR3-Gi kompleksinin SDS sayfası analizi (Şekil 2B), S1PR3, Gαi, Gβ ve scFv16'nın teorik bantlarına karşılık gelen dört bandı ortaya koymakta ve böylece kompleksin başarıyla saflaştırıldığını göstermektedir. Reseptör bandı sıklıkla farklı modifikasyon dereceleri (glikozilasyon veya palmitoilasyon) nedeniyle dağınık bulundu ve Gγ bandı bulunamadı.

Figure 2
Şekil 2: Protein saflaştırma sonuçlarının analizi (A) Proteine karşılık gelen tepe fraksiyonunu gösteren jel filtrasyon kromatogramı. (B) SDS sayfalı jel elektroforez deseni. Bu şekil referans27'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S1PR3-Gi kompleksinin kompleks fraksiyonları toplandı ve elektron mikroskobu için konsantre edildi. Izgara vitrifikasyonu ve numune taramasının prosedürleri ve temsili sonuçları daha önce tartışılmıştı34. İki farklı işleme platformu kullanılarak S1PRs-G protein kompleksinin yüksek çözünürlüklü bir yapısını elde etmek için bir akış şeması (Şekil 3) sunulmuştur: RELION-3 ve cryoSPARC v3.

Figure 3
Şekil 3: pFTY720'ye bağlı S1PR3-Gi-scFv16 komplekslerinin veri işleme iş akışı. pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16 kompleksinin Cryo-EM veri işleme akış şeması gösterilmiştir. Temsili kriyo-EM mikrograf otomatik toplama, 2D sınıflandırma ortalamaları, 3D rekonstrüksiyonlar ve pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16 kompleksinin tekdüze olmayan İyileştirilmesi şekilde gösterilmiştir. Bu şekil referans27'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Filmler önce RELION-3'e aktarıldı ve daha sonra ortalama mikrograflar oluşturmak için hareket düzeltme ve CTF tahmini yapıldı. Parçacıkları toplayarak ve yinelemeli 2D sınıflandırmayla, daha ileri işlemler için daha iyi parçacıklar elde edildi. S1PR3-Gi kompleksinin ikincil yapısal bilgisini açıkça temsil eden iyi tanımlanmış 2D sınıflarına sahip parçacıkların seçilmesi çok önemlidir (Şekil 4A), çünkü düşük kaliteli parçacıklar sonraki işleme aşamalarını engelleyebilir (Şekil 4B), bu da daha düşük çözünürlüklü bir yeniden yapılanma ile sonuçlanır. 3D sınıflandırma kullanılarak, parçacıklar gürültü parçacıklarını dışlamak, farklı olası konformasyonları ayırt etmek ve birden fazla 3D rekonstrüksiyon sağlamak için daha da sınıflandırıldı. Sonunda, bir S1PR3-Gi kompleks EM haritası (Şekil 5A), Fourier Kabuk Korelasyonu (FSC) (Şekil 5B) aracılığıyla , Tekdüze Olmayan İyileştirme yoluyla iyi çözünürlükte üretildi.

Figure 4
Şekil 4: 2B sınıfların seçilmesi. (A,B) 2B sınıflandırmadan elde edilen sonuçlar. (A) Daha sonraki işlemler için iyi tanımlanmış sınıflar içeren 2B sınıf ortalamalarını seçin ve (B) kısmi parçacıkları veya düşük çözünürlüklü ve gürültülü parçacıkları ayırın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: pFTY720'ye bağlı S1PR3-Gi-scFv16 komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapısı. (A) pFTY720'ye bağlı S1PR3 kompleksinin yüksek çözünürlüklü yapısı, S1PR3 ve Gi protein yapı elemanlarını temsil eden iyi tanımlanmış kriyo-EM yoğunluğunu gösterir. (B) pFTY720'ye bağlı S1PR3-Gi kompleksi için altın standart Fourier kabuk korelasyonu (FSC) eğrisi. Bu şekil referans27'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S1PRs-G protein kompleksinin yapılarını kriyo-EM ile çözerek, hücrede fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon mekanizmasını, seçici ilaç tanımayı ve G-protein eşleşmesini aydınlattık. Gi-inhibisyon cAMP testi, hücrelerdeki cAMP konsantrasyonu seviyesindeki değişiklikleri ölçer (Şekil 1) ve Gs veya Gi ile birlikte reseptörlerin aktivasyon gücünü doğrulamak için sıklıkla kullanılmıştır.

Deney sistemindeki reseptörün Sensör plazmidine konsantrasyon oranı, deneysel canlılık için çok önemlidir. Bu nedenle, fonksiyonel analizi etkili ve kesin bir şekilde gerçekleştirmek için, maksimum Emaksimum değerine sahip bir plazmid konsantrasyon oranı seçilmelidir. Bu deneyde, reseptörün Sensör plazmidine üç konsantrasyon oranı (1: 1, 1: 3 ve 1: 9) araştırılmıştır. Sonuçlar, reseptörün Sensör plazmidine konsantrasyon oranı 1:3 olduğunda maksimum Emax değerinin elde edildiğini göstermiştir (Şekil 6).

Figure 6
Şekil 6: S1PR3'ün Sensör plazmidine farklı konsantrasyon oranlarının pencere periyodu üzerindeki etkisi CHO-K1 hücre hattında araştırılmıştır. Veriler, üçlü olarak gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin SEM'± aracı olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reseptörün Sensör plazmidine konsantrasyon oranının yanı sıra, bu deneyde kullanılan hücre hatları da önemliydi. Çoğu reseptör için HEK293 ve CHO-K1 hücre hatları arasında önemli bir fark yoktu. Öte yandan, CHO-K1 hücre çizgileri, S1PR3 için HEK293 hücrelerinden daha gerçekçi bir genel eğriye sahipti (Şekil 7). Bu nedenle, S1PR3'ün fonksiyonel deney doğrulaması için CHO-K1 hücreleri seçildi.

Figure 7
Şekil 7: S1PR3'ün Sensör plazmidine farklı konsantrasyon oranlarının pencere periyodu üzerindeki etkisi HEK293 hücre hattında araştırılmıştır. Veriler, üçlü olarak gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin SEM'± aracı olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, S1PR'lerin yapılarını kriyo-EM ile belirlemek ve Gi-aracılı cAMP inhibisyon testi ile S1PR'lerin aktivasyon gücünü ölçmek için birincil bir boru hattını açıklamaktadır. Bazı adımlar deneyin başarısı için çok önemlidir.

S1PRs-Gi kompleksini saflaştırmak için, virüsün kalitesine ve sf9 hücrelerinin sağlığına daha fazla dikkat edilmelidir. Reseptörün ekspresyonu, zayıf sf9 hücrelerinde önemli ölçüde azalır. Sf9 hücrelerinin sağlığı, çapları ölçülerek değerlendirildi. Sağlıklı sf9 hücresi kabaca 15 μm çapa sahiptir. S1PRs-Gi kompleksinin verimi, S1PRs-G protein kompleksinin in vitro42 birleştirilmesiyle üstesinden gelinebilen reseptör, Gi ve Gβγ virüslerinin hacim oranından etkilenir. Ek olarak, GPCR-G protein kompleksleri her zaman kararlı değildir ve bu nedenle NanoBiT stratejisi geliştirilmiştir ve kompleks43'ü stabilize etmek için sıklıkla uygulanmıştır.

Numunenin kalitesi, kriyo-EM deneyindeki her şeyin temelidir. Numune taramasında sıklıkla bir agregasyon veya ayrışma fenomeni gözlenmiştir. GPCR-G-protein kompleksi stabilizasyonunda bazı yaklaşımlar yardımcı olabilir. S1PR'lerin C-terminus kalıntıları, S1PRs-Gi karmaşık projesi26'da numune toplanmasına neden olabilir. Sinyal yolu testi, S1PRs26,27 için kabul edilebilir bir C-terminal ucu seçmek için kullanılmalıdır. LMNG'nin konsantrasyonu ikinci en önemli faktördür; Aşırı deterjan konsantrasyonları GPCR-G protein kompleksini stabilize edebilir, ancak düşük konsantrasyonlar tam tersini yapabilirken, çözünürlüğünü de azaltabilir. Kompleksin stabilize edilmesinde en önemli husus, mümkün olduğunca düşük olan optimum deterjan konsantrasyonudur. Ayrıca, numunenin konsantrasyonu zaman zaman toplanan veri miktarını etkileyebilir. Bir numuneyi vitrifiye ederken, sıklıkla bir gradyan yaparız. Veri işlemede, parçacık seçiminde algoritmaların seçimi ve 2D veya 3D sınıflandırma, özellikle ligandların ve ECL'lerin modellenmesi için S1PR'ler-G protein komplekslerinin çözülmesi için önemlidir; ECL'lerin yoğunluğu, Shian Liu ve ark.42 tarafından tanımlanan literatürde çözümlenen S1PR1 yapısında sürekli olarak bulunmuş ve S1PR5 yapılarında süreksiz bulunmuştur26. Tüm GPCR kompleksleri için bu soruna evrensel bir çözüm bulunmamakla birlikte, EM yoğunluk haritasını geliştiren herhangi bir strateji denenmelidir. Vitrifikasyon, veri toplama ve görüntü işleme için önemli adımlar daha önce34,44 olarak tanımlanmıştı.

S1PR'lerin yapıları kriyo-EM tarafından belirlendikten sonra S1PR ligandlarının aktivasyon veya inhibisyon gücünü değerlendirmek için bir tahlil gereklidir. Çok sayıda yaklaşım kullanılabilir. Gi-inhibisyon cAMP testi, agonistlerin neden olduğu hücrelerdeki cAMP seviyelerindeki değişiklikleri düzenli olarak izleyerek reseptör aktivasyon potensini değerlendirir. a) Hücre kültürü, b) transfeksiyon, c) plazmid reseptörü (veya mutasyonları) ve Sensör plazmidinin mol oranı ve d) hücre tipi seçimi başarılı bir deney için çok önemlidir. Hücrelerin sağlığı, transfeksiyon verimliliğini ve reseptör veya Sensör ekspresyonunu etkileyebilir ve bu da deneyin sinyal-gürültü oranı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Hücreler genellikle 20 kuşaktan sonra sağlıklıdır, ancak bu her zaman böyle değildir. Hücrelerin durumuna her zaman göz kulak olmak çok önemlidir. Hücre geçişi sırasında tripsin sindirim süresi sıkı bir şekilde yönetilmelidir, çünkü hücrenin durumu zaman içinde önemli bir etkiye sahiptir. Transfeksiyon reaktifleri çeşitli hücre tiplerinde reseptör ekspresyonunu etkiler ve uygun bir hücre markası seçilmelidir. Gi-inhibisyon cAMP testinde plazmid reseptörünün Sensör plazmidine mol oranı optimize edilmelidir. Genellikle reseptör ve Sensör plazmidi arasında bir dizi mol oranı seçiyoruz ve reseptör mutantları ile Gi-inhibisyon cAMP testi için veri doğruluğunu sağlamak için floresan yoğunluğunun en yüksek varyasyonunu belirliyoruz.

Diğer bazı tahliller, ELISA testi45 ve NanoBiT46 gibi çeşitli numune türlerinde hücresel cAMP seviyelerini izlemek için kullanılır. cAMP ELISA testi, spesifik antikorla bağlanan cAMP miktarını ölçmek için kullanılır. cAMP'ye özgü antikor bir mikrotitre plakasına sabitlenir ve peroksidaz cAMP izleyici, antikor ile bağlanmak için cAMP ile rekabet eder. Plakaya bağlı peroksidaz cAMP izleyici miktarı, cAMP miktarı ile ters orantılı olan florometrik testler kullanılarak ölçülür. 2007 yılında Jiang ve ark., Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) teknolojisini (YFP-Epac-RLuc kullanan cAMP sensörü) kullanarak cAMP seviyelerini in vivo ve hızlı bir şekilde izlemek için bir yöntem geliştirdiler46. NanoBiT tabanlı cAMP testi, YFP ve Rluc yerine sırasıyla LgBiT ve SmBiT koyan cAMP sensörü LgBiT-Epac-SmBiT'yi uygular ve G-protein heterotrimerinin ayrışmasını veya reseptör ile G-protein heterotrimer arasındaki eşleşmeyi ölçmek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

S1PRs-Gi kompleksinin verileri, Sichuan Üniversitesi'ndeki Batı Çin Cryo-EM Merkezi'nde ve Güney Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'ndeki (SUSTech) Cryo-EM Merkezi'nde toplandı ve Sichuan Üniversitesi'ndeki Duyu Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi'nde işlendi. Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (32100965 L.C.'ye, 32100988 W.Y.'ye, 31972916 Z.S.'ye) ve Sichuan Üniversitesi tam zamanlı Doktora Sonrası Araştırma Fonu (2021SCU12003'ten L.C.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Biyokimya Sayı 184
Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter