Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten
Summary
Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.
Abstract
Contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten worden vaak geanalyseerd op cellulair niveau als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van cardiale letsels en / of remodellering. Een benadering voor het beoordelen van deze functionele veranderingen maakt gebruik van onbelaste verkorting en Ca2 + voorbijgaande analyses in primaire volwassen cardiale myocyten. Voor deze aanpak worden volwassen myocyten geïsoleerd door collagenasevertering, Ca2 + tolerant gemaakt en vervolgens gehecht aan laminine-gecoate coverslips, gevolgd door elektrische pacing in serumvrije media. Het algemene protocol maakt gebruik van volwassen cardiale myocyten bij ratten, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor primaire myocyten van andere soorten. Functionele veranderingen in myocyten van gewonde harten kunnen worden vergeleken met sham myocyten en/of met in vitro therapeutische behandelingen. De methodologie omvat de essentiële elementen die nodig zijn voor myocytenpacing, samen met de celkamer en platformcomponenten. Het gedetailleerde protocol voor deze aanpak omvat de stappen voor het meten van onbelaste verkorting door sarcomeerlengtedetectie en cellulaire Ca2 + transiënten gemeten met de ratiometrische indicator Fura-2 AM, evenals voor ruwe gegevensanalyse.
Introduction
De analyse van de hartpompfunctie vereist vaak een reeks benaderingen om voldoende inzicht te krijgen, vooral voor diermodellen van hartfalen (HF). Echocardiografie of hemodynamische metingen geven inzicht in in vivo cardiale disfunctie1, terwijl in vitro benaderingen vaak worden gebruikt om te identificeren of disfunctie ontstaat door veranderingen in het myofilament en/of de Ca2+ transiënt die verantwoordelijk is voor het koppelen van excitatie, of het actiepotentiaal, met contractiele functie (bijv. Excitatie-contractie [E-C] koppeling). In vitro benaderingen bieden ook de mogelijkheid om de functionele respons op neurohormonen, vector-geïnduceerde genetische veranderingen en potentiële therapeutische middelen2 te screenen voordat dure en / of moeizame in vivo behandelingsstrategieën worden nagestreefd.
Er zijn verschillende benaderingen beschikbaar om de in vitro contractiele functie te onderzoeken, waaronder krachtmetingen in intacte trabeculae3 of gepermeabiliseerde myocyten4, evenals onbelaste verkorting en Ca2+ transiënten in intacte myocyten in de aan- en afwezigheid van HF 5,6. Elk van deze benaderingen richt zich op de cardiale myocytencontractiele functie, die direct verantwoordelijk is voor de hartpompfunctie 2,7. De analyse van zowel contractie als E-C-koppeling samen wordt echter meestal uitgevoerd door verkorting van de spierlengte en Ca2+ transiënten in geïsoleerde, Ca2+ tolerante volwassen myocyten te meten. Het laboratorium maakt gebruik van een gedetailleerd gepubliceerd protocol om myocyten uit rattenharten te isoleren voor deze stap8.
Zowel de Ca2+ transiënten als myofilamenten dragen bij aan verkorting en herverlenging in intacte myocyten en kunnen bijdragen aan contractiele disfunctie 2,7. Deze aanpak wordt dus aanbevolen wanneer in vitro functionele analyse een intacte myocyt vereist die de Ca2+ fietsmachines plus de myofilamenten bevat. Intacte geïsoleerde myocyten zijn bijvoorbeeld wenselijk voor het bestuderen van de contractiele functie na het wijzigen van de myofilament- of Ca2+ fietsfunctie via genoverdracht9. Daarnaast wordt een intacte myocytenbenadering voorgesteld voor het analyseren van de functionele impact van neurohormonen bij het bestuderen van de impact van downstream tweede boodschapper signaleringsroutes en /of respons op therapeutische middelen2. Een alternatieve meting van belastingsafhankelijke kracht in enkele myocyten wordt meestal uitgevoerd na membraanpermeabilisatie (of skinning) bij lage temperaturen (≤15 °C) om de Ca2+ voorbijgaande bijdrage te verwijderen en zich te concentreren op myofilamentfunctie10. De meting van belastingsafhankelijke kracht plus Ca2+ transiënten in intacte myocyten is zeldzaam, grotendeels vanwege de complexe en technische uitdaging van de aanpak11, vooral wanneer een hogere doorvoer nodig is, zoals voor het meten van reacties op neurohormone signalering of als een scherm voor therapeutische middelen. De analyse van cardiale trabeculae overwint deze technische uitdagingen, maar kan ook worden beïnvloed door niet-myocyten, fibrose en / of extracellulaire matrixremodellering2. Elk van de hierboven beschreven benaderingen vereist een preparaat dat volwassen myocyten bevat, omdat neonatale myocyten en myocyten afgeleid van induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC’s) nog niet het volledige complement van volwassen myofilamenteiwitten tot expressie brengen en meestal het niveau van myofilamentorganisatie missen dat aanwezig is in de volwassen staafvormige myocyt2. Tot op heden wijst bewijs in iPSC’s erop dat de volledige overgang naar volwassen isovormen meer dan 134 dagen in cultuur12 overschrijdt.
Gezien de focus van deze collectie op HF, omvatten de protocollen benaderingen en analyse om contractiele functie te onderscheiden in falende versus niet-falende intacte myocyten. Representatieve voorbeelden worden gegeven van rattenmyocyten die 18-20 weken na een supra-renale coarctatie zijn bestudeerd, eerder beschreven 5,13. Vervolgens worden vergelijkingen gemaakt met myocyten van met sham behandelde ratten.
Het hier beschreven protocol en beeldvormingsplatform worden gebruikt om veranderingen in verkorting en Ca2+ transiënten in staafvormige hartmyocyten tijdens de ontwikkeling van HF te analyseren en te monitoren. Voor deze analyse worden 2 x 104 Ca2+-tolerante, staafvormige myocyten verguld op 22 mm2 laminine-gecoate glazen coverslips (CSs) en ‘s nachts gekweekt, zoals eerder beschreven8. De componenten die voor dit beeldvormingsplatform zijn geassembleerd, samen met de media en buffers die worden gebruikt voor optimale beeldvorming, zijn opgenomen in de materiaaltabel. Een gids voor data-analyse met behulp van een software en de representatieve resultaten worden hier ook gegeven. Het algemene protocol is onderverdeeld in afzonderlijke subsecties, waarbij de eerste drie secties zich richten op geïsoleerde rattenmyocyten en gegevensanalyse, gevolgd door cellulaire Ca2 + voorbijgaande experimenten en gegevensanalyse in myocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het chronische pacingprotocol dat in stap 1 wordt beschreven, verlengt de nuttige tijd voor het bestuderen van geïsoleerde myocyten en het beoordelen van de impact van langere behandelingen. In ons laboratorium werden consistente resultaten verkregen tot 4 dagen na isolatie bij het meten van de contractiele functie met behulp van sarcomeerlengte op chronisch getemporiseerde myocyten. De contractiele functie van myocyten verslechtert echter snel bij gebruik van media ouder dan 1 week om myocyten te versnellen.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door national institutes of health (NIH) subsidie R01 HL144777 (MVW).
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling’s law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
