ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca2 + טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים
Summary
מוצגת סדרה של פרוטוקולים המתארים את מדידת פונקציית ההתכווצות באמצעות זיהוי אורך סרקומר יחד עם מדידת סידן (Ca2+) במיוציטים של חולדות מבודדות. היישום של גישה זו למחקרים במודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב נכלל גם הוא.
Abstract
תפקוד לקוי של התכווצויות ו-Ca2+ מנותחים לעתים קרובות ברמה התאית כחלק מהערכה מקיפה של פגיעה הנגרמת על ידי הלב ו / או שיפוץ. גישה אחת להערכת שינויים תפקודיים אלה משתמשת בקיצור פרוק ובניתוחים חולפים של Ca2+ במיוציטים לבביים בוגרים ראשוניים. לצורך גישה זו, מיוציטים בוגרים מבודדים על ידי עיכול קולגן, הופכים את Ca2+ לסובלני, ולאחר מכן נדבקים לכיסויים מצופים למינין, ולאחר מכן לקצב חשמלי במדיה נטולת סרום. הפרוטוקול הכללי משתמש במיוציטים לבביים של חולדות בוגרות, אך ניתן להתאים אותו בקלות למיוציטים ראשוניים ממינים אחרים. ניתן להשוות שינויים תפקודיים במיוציטים מלבבות פגועים למיוציטים ו/או לטיפולים במבחנה . המתודולוגיה כוללת את המרכיבים החיוניים הדרושים לקצב מיוציטים, יחד עם מרכיבי תא התא והפלטפורמה. הפרוטוקול המפורט לגישה זו משלב את השלבים למדידת התקצרות נפרקת על ידי זיהוי אורך סרקומר וטרנזיינטים סלולריים Ca2+ שנמדדו באמצעות מחוון היחס Fura-2 AM, כמו גם לניתוח נתונים גולמיים.
Introduction
ניתוח תפקוד משאבת הלב דורש לעתים קרובות מגוון גישות כדי לקבל תובנה מספקת, במיוחד עבור מודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב (HF). אקוקרדיוגרפיה או מדידות המודינמיות מספקות תובנה לגבי תפקוד לב in vivo 1, בעוד שגישות in vitro משמשות לעתים קרובות כדי לזהות אם תפקוד לקוי נובע משינויים במיופילמנט ו/או ב-Ca2+ חולף האחראי על עירור צימוד, או פוטנציאל הפעולה, עם פונקציית התכווצות (למשל, צימוד עירור-כיווץ [E-C]). גישות במבחנה מספקות גם הזדמנות לסנן את התגובה התפקודית לנוירוהורמונים, שינויים גנטיים הנגרמים על ידי וקטורים, כמו גם סוכנים טיפוליים פוטנציאליים2 לפני נקיטת אסטרטגיות טיפול in vivo יקרות ו / או מייגעות.
מספר גישות זמינות כדי לחקור את תפקוד ההתכווצות במבחנה, כולל מדידות כוח בטרבקולה3 שלמה או מיוציטים מחלחלים4, כמו גם קיצור לא טעון ו- Ca2+ טרנזיינטים במיוציטים שלמים בנוכחות והיעדר HF 5,6. כל אחת מהגישות הללו מתמקדת בתפקוד התכווצות המיוציטים הלבביים, האחראי ישירות על תפקוד משאבת הלב 2,7. עם זאת, הניתוח של התכווצות וצימוד E-C יחד מבוצע לרוב על ידי מדידת קיצור אורך השריר ו- Ca 2+ חולפים במיוציטים בוגרים מבודדים, Ca2+ סובלניים. המעבדה משתמשת בפרוטוקול מפורט שפורסם כדי לבודד מיוציטים מלבבות חולדות עבור שלב8 זה.
גם Ca2+ חולף וגם מיופילמנטים תורמים לקיצור והארכה מחדש של מיוציטים שלמים ויכולים לתרום לתפקוד לקוי של התכווצות 2,7. לפיכך, גישה זו מומלצת כאשר ניתוח פונקציונלי במבחנה דורש מיוציט שלם המכיל את מכונות המחזור Ca2+ בתוספת המיופילמנטים. לדוגמה, מיוציטים מבודדים שלמים רצויים לחקר תפקוד התכווצות לאחר שינוי תפקוד המיופילמנט או Ca2+ מחזורי באמצעות העברת גנים9. בנוסף, גישת מיוציטים שלמים מוצעת לניתוח ההשפעה התפקודית של נוירוהורמונים כאשר חוקרים את ההשפעה של מסלולי איתות שליח שני במורד הזרם ו / או תגובה לסוכנים טיפוליים2. מדידה חלופית של כוח תלוי עומס במיוציטים בודדים מבוצעת לרוב לאחר חדירת ממברנה (או עור) בטמפרטורות נמוכות (≤15 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את התרומה החולפת Ca2+ ולהתמקד בפונקציית מיופילמנט10. מדידת כוח תלוי עומס בתוספת Ca2+ חולפים במיוציטים שלמים היא נדירה בעיקר בשל האתגר המורכב והטכני של גישה11, במיוחד כאשר יש צורך בתפוקה גבוהה יותר, כגון למדידת תגובות לאיתות נוירוהורמונים או כמסך לסוכנים טיפוליים. הניתוח של טרבקולה לבבית מתגבר על אתגרים טכניים אלה, אך עשוי להיות מושפע גם משינויים שאינם מיוציטים, פיברוזיס ו/או מטריצה חוץ-תאית2. כל אחת מהגישות שתוארו לעיל דורשת תכשיר המכיל מיוציטים בוגרים מכיוון שמיוציטים ילודים ומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs) עדיין אינם מבטאים את ההשלמה המלאה של חלבוני מיופילמנט בוגרים ובדרך כלל חסרים את רמת ארגון המיופילמנט הקיימת במיוציטים בצורת מוט בוגר2. נכון להיום, עדויות ב- iPSCs מצביעות על כך שהמעבר המלא לאיזופורמים בוגרים עולה על יותר מ -134 ימים בתרבית12.
בהתחשב בהתמקדות של אוסף זה ב- HF, הפרוטוקולים כוללים גישות וניתוח כדי להבדיל בין תפקוד התכווצות במיוציטים שלמים כושלים לעומת מיוציטים שלמים שאינם נכשלים. דוגמאות מייצגות מסופקות ממיוציטים של חולדות שנחקרו 18-20 שבועות לאחר כריתה על-כלייתית, שתוארה קודםלכן 5,13. לאחר מכן נעשות השוואות למיוציטים מחולדות שטופלו בבושה.
הפרוטוקול ופלטפורמת ההדמיה המתוארים כאן משמשים לניתוח וניטור שינויים בקיצור ו- Ca2+ חולפים במיוציטים לבביים בצורת מוט במהלך התפתחות HF. לצורך ניתוח זה, 2 x 104 Ca 2+-סובלניים, מיוציטים בצורת מוט מצופים על22 מ”מ 2 מ“מ 2 כיסויי זכוכית מצופים למינין (CSs) ומתורבתים לילה, כפי שתואר קודםלכן 8. הרכיבים שהורכבו עבור פלטפורמת הדמיה זו, יחד עם המדיה והמאגרים המשמשים להדמיה אופטימלית, מסופקים בטבלת החומרים. מדריך לניתוח נתונים באמצעות תוכנה והתוצאות המייצגות מסופקים גם כאן. הפרוטוקול הכולל מחולק לתתי-סעיפים נפרדים, כאשר שלושת החלקים הראשונים מתמקדים במיוציטים של חולדות מבודדות ובניתוח נתונים, ולאחר מכן ניסויים ארעיים של Ca2+ וניתוח נתונים במיוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול הקצב הכרוני המתואר בשלב 1 מאריך את הזמן השימושי לחקר מיוציטים מבודדים ולהערכת ההשפעה של טיפולים ארוכים יותר. במעבדה שלנו, תוצאות עקביות התקבלו עד 4 ימים לאחר הבידוד בעת מדידת תפקוד התכווצות באמצעות אורך סרקומר על מיוציטים בקצב כרוני. עם זאת, תפקוד התכווצות המיוציטים מתדרדר במהירו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R01 HL144777 (MVW).
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling’s law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
