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Medicine

कृंतक मायोसाइट्स में कार्डियक सिकुड़ा हुआ डिसफंक्शन और सीए2 + ट्रांसिएंट्स का विश्लेषण

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/64055
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cardiac Surgery, Michigan Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

प्रोटोकॉल का एक सेट प्रस्तुत किया जाता है जो पृथक चूहे मायोसाइट्स में कैल्शियम (सीए2+) क्षणिक माप के साथ-साथ सरकोमेरे लंबाई का पता लगाने के माध्यम से सिकुड़ा हुआ कार्य के माप का वर्णन करता है। दिल की विफलता के पशु मॉडल में अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण का अनुप्रयोग भी शामिल है।

Abstract

संकुचनशील शिथिलता और सीए2 + क्षणिक ों का अक्सर हृदय-प्रेरित चोट और / या रीमॉडेलिंग के व्यापक मूल्यांकन के हिस्से के रूप में सेलुलर स्तर पर विश्लेषण किया जाता है। इन कार्यात्मक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्राथमिक वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स में अनलोडेड शॉर्टनिंग और सीए2 + क्षणिक विश्लेषण का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण के लिए, वयस्क मायोसाइट्स को कोलेजनेज पाचन द्वारा अलग किया जाता है, सीए2 + सहिष्णु बनाया जाता है, और फिर सीरम-मुक्त मीडिया में विद्युत पेसिंग के बाद लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स का पालन किया जाता है। सामान्य प्रोटोकॉल वयस्क चूहे कार्डियक मायोसाइट्स का उपयोग करता है लेकिन अन्य प्रजातियों से प्राथमिक मायोसाइट्स के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है। घायल दिलों से मायोसाइट्स में कार्यात्मक परिवर्तन की तुलना शाम मायोसाइट्स और / या इन विट्रो चिकित्सीय उपचारों से की जा सकती है। कार्यप्रणाली में सेल चैंबर और प्लेटफॉर्म घटकों के साथ मायोसाइट पेसिंग के लिए आवश्यक आवश्यक तत्व शामिल हैं। इस दृष्टिकोण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल में सरकोमेरे लंबाई का पता लगाने और सेलुलर सीए2 + ट्रांसिएंट्स द्वारा अनलोडेड शॉर्टिंग को मापने के लिए चरणों को शामिल किया गया है, जिसे अनुपातमीट्रिक संकेतक फुरा -2 एएम के साथ मापा जाता है, साथ ही साथ कच्चे डेटा विश्लेषण के लिए भी।

Introduction

कार्डियक पंप फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए अक्सर पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है, खासकर दिल की विफलता (एचएफ) के पशु मॉडल के लिए। इकोकार्डियोग्राफी या हेमोडायनामिक माप विवो कार्डियक डिसफंक्शन1 में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जबकि इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर यह पहचानने के लिए नियोजित किए जाते हैं कि क्या शिथिलता मायोफिलामेंट और / या सीए2 + क्षणिक में परिवर्तन से उत्पन्न होती है जो युग्मन उत्तेजना के लिए जिम्मेदार है, या संकुचन फ़ंक्शन (जैसे, उत्तेजना-संकुचन [ई-सी] युग्मन) के साथ कार्रवाई क्षमता। इन विट्रो दृष्टिकोण विवो उपचार रणनीतियों में महंगे और / या श्रमसाध्य का पीछा करने से पहले न्यूरोहार्मोन, वेक्टर-प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ-साथ संभावित चिकित्सीयएजेंटों के लिए कार्यात्मक प्रतिक्रिया को स्क्रीन करने का अवसर भी प्रदान करते हैं।

इन विट्रो सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन की जांच करने के लिए कई दृष्टिकोण उपलब्ध हैं, जिसमें बरकरार ट्रेबेक्यूले3 या परमेबिलाइज्ड मायोसाइट्स4 में बल माप शामिल हैं, साथ ही एचएफ 5,6 की उपस्थिति और अनुपस्थिति में बरकरार मायोसाइट्स में अनलोडेड शॉर्टनिंग और सीए2 + ट्रांसिएंट्स शामिल हैं। इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण कार्डियक मायोसाइट सिकुड़ा हुआ कार्य पर केंद्रित है, जो कार्डियक पंप फ़ंक्शन 2,7 के लिए सीधे जिम्मेदार है। हालांकि, संकुचन और ई-सी युग्मन दोनों का विश्लेषण अक्सर मांसपेशियों की लंबाई को छोटा करके और अलग,सीए2 + सहिष्णु वयस्क मायोसाइट्स में सीए2 + क्षणिक को मापकर किया जाता है। प्रयोगशाला इस चरण 8 के लिए चूहे के दिल से मायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग करतीहै।

सीए2 + क्षणिक और मायोफिलामेंट्स दोनों बरकरार मायोसाइट्स में छोटे और फिर से लंबे होने में योगदान करते हैं और सिकुड़ा हुआ शिथिलता 2,7 में योगदान कर सकते हैं। इस प्रकार, इस दृष्टिकोण की सिफारिश की जाती है जब इन विट्रो कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सीए2 + साइकिलिंग मशीनरी और मायोफिलामेंट्स युक्त एक बरकरार मायोसाइट की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, जीन ट्रांसफर9 के माध्यम से मायोफिलामेंट या सीए2 + साइक्लिंग फ़ंक्शन को संशोधित करने के बाद सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए बरकरार पृथक मायोसाइट्स वांछनीय हैं। इसके अलावा, डाउनस्ट्रीम सेकंड मैसेंजर सिग्नलिंग मार्गों और / या चिकित्सीय एजेंटों की प्रतिक्रिया के प्रभाव का अध्ययन करते समय न्यूरोहार्मोन के कार्यात्मक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक बरकरार मायोसाइट दृष्टिकोण का सुझाव दियाजाता है। एकल मायोसाइट्स में लोड-निर्भर बल का एक वैकल्पिक माप अक्सर कम तापमान (≤15 डिग्री सेल्सियस) पर झिल्ली परमेबिलाइजेशन (या खाल) के बाद किया जाता है ताकि सीए2 + क्षणिक योगदान को दूर किया जा सके और मायोफिलामेंट फ़ंक्शन10 पर ध्यान केंद्रित किया जा सके। बरकरार मायोसाइट्स में लोड-निर्भर बल प्लस सीए2 + ट्रांसिएंट्स का माप काफी हद तक दृष्टिकोण11 की जटिल और तकनीकी चुनौती के कारण दुर्लभ है, खासकर जब उच्च थ्रूपुट की आवश्यकता होती है, जैसे कि न्यूरोहार्मोन सिग्नलिंग के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए या चिकित्सीय एजेंटों के लिए स्क्रीन के रूप में। कार्डियक ट्रेबेक्यूले का विश्लेषण इन तकनीकी चुनौतियों को दूर करता है लेकिन गैर-मायोसाइट्स, फाइब्रोसिस और / या बाह्य मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग 2 से भी प्रभावित हो सकताहै। ऊपर वर्णित प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए वयस्क मायोसाइट्स युक्त तैयारी की आवश्यकता होती है क्योंकि इंड्यूसेबल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से प्राप्त नवजात मायोसाइट्स और मायोसाइट्स अभी तक वयस्क मायोफिलामेंट प्रोटीन के पूर्ण पूरक को व्यक्त नहीं करते हैं और आमतौर पर वयस्क रॉड के आकार के मायोसाइट्स2 में मौजूद मायोफिलामेंट संगठन के स्तर की कमी होती है। आज तक, आईपीएससी में साक्ष्य इंगित करता है कि वयस्क आइसोफॉर्म में पूर्ण संक्रमण संस्कृति12 में 134 दिनों से अधिक है।

एचएफ पर इस संग्रह के फोकस को देखते हुए, प्रोटोकॉल में असफल बनाम गैर-असफल बरकरार मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन अलग करने के लिए दृष्टिकोण और विश्लेषण शामिल हैं। 5,13 से पहले वर्णित सुप्रा-रीनल कोआर्केशन के 18-20 सप्ताह बाद अध्ययन किए गए चूहे के मायोसाइट्स से प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान किए जाते हैं। फिर शाम-उपचारित चूहों से मायोसाइट्स की तुलना की जाती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल और इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग एचएफ के विकास के दौरान रॉड के आकार के कार्डियक मायोसाइट्स में शॉर्टिंग और सीए2 + ट्रांसिएंट्स में परिवर्तन का विश्लेषण और निगरानी करने के लिए किया जाता है। इस विश्लेषण के लिए, 2 x 104 Ca2+-सहिष्णु, रॉड के आकार के मायोसाइट्स को 22 मिमी2 लैमिनिन-लेपित ग्लास कवरलिप्स (CS) पर चढ़ाया जाता है और रात भर सुसंस्कृत किया जाता है, जैसा कि पहलेवर्णित है। इष्टतम इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर के साथ इस इमेजिंग प्लेटफॉर्म के लिए इकट्ठे किए गए घटक सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं। एक सॉफ्टवेयर और प्रतिनिधि परिणामों का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के लिए एक गाइड भी यहां प्रदान किया गया है। समग्र प्रोटोकॉल को अलग-अलग उप-वर्गों में विभाजित किया गया है, जिसमें पहले तीन खंड पृथक चूहे मायोसाइट्स और डेटा विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इसके बाद सेलुलर सीए2 + क्षणिक प्रयोग और मायोसाइट्स में डेटा विश्लेषण होता है।

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Protocol

कृन्तकों पर किए गए अध्ययनों ने प्रयोगशाला जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति का पालन किया और मिशिगन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया। इस अध्ययन के लिए, मायोसाइट्स को 3-34 महीने के स्प्राग-डॉवले और एफ 344 बीएन चूहों से अलग किया गया था, जिनका वजन 200 ग्राम5 ≥ था। पुरुष और महिला दोनों दरों का उपयोग किया गया था।

1. सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन अध्ययन के लिए मायोसाइट पेसिंग

  1. पृथक मायोसाइट्स (सामग्री की तालिका) के प्रत्येक सेट के लिए ताजा एम 199-आधारित मीडिया बनाएं। पेसिंग से 1 दिन पहले, प्लेट 2 x 104 Ca2 +-सहिष्णु, रॉड के आकार के मायोसाइट्स 22 मिमी2 लैमिनिन-लेपित ग्लास कवरलिप्स (CSs) पर, जैसा कि पहले वर्णितहै।
  2. कक्ष तैयार करने के लिए, प्रत्येक कक्ष को 10% ब्लीच में 1 घंटे के लिए भिगोदें। फिर, कक्षों को 30-45 मिनट के लिए बहते नल के पानी के साथ फ्लश करें, इसके बाद 30 मिनट के लिए हर 5 मिनट में आसुत जल को प्रतिस्थापित किया जाता है, इसके बाद 30 मिनट के लिए हर 5 मिनट में विआयनीकृत पानी को प्रतिस्थापित किया जाता है, और विआयनीकृत पानी में अंतिम कुल्ला किया जाता है।
  3. कक्षों को 20-30 मिनट के लिए एक साफ सतह पर सुखाएं (पूरक चित्रा 1 ए-सी)। इसके बाद, यूवी प्रत्येक दिशा में 5 मिनट के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में कक्षों का इलाज करता है (कुल = 20 मिनट)। पूर्व-निष्फल कक्षों के लिए इस कदम की आवश्यकता नहीं है।
    सावधानी: यूवी जोखिम को कम करने के लिए क्षेत्र छोड़ दें।
  4. कक्ष से कवर निकालें, प्रत्येक कुएं में 3 एमएल एम 199-आधारित मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें (पूरक चित्र 1 बी), कवर को बदलें, और 5% सीओ2 और 20 % ओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कक्ष को प्रीहीटकरें।
  5. 20-25 सेकंड के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म मोती स्टरलाइज़र में बल को निष्फल करें। इनक्यूबेटर से प्रीहीट उत्तेजना कक्ष को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
  6. कार्डियक मायोसाइट्स युक्त प्रत्येक कवरस्लिप (सीएस) को बाँझ बल का उपयोग करके उत्तेजना कक्ष में अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करें। मीडिया तापमान को बनाए रखने के लिए शेष चार सीएस के स्थानांतरण से पहले एक समय में चार सीएस स्थानांतरित करें, इसके बाद 10 मिनट के लिए हीटिंग करें।
  7. केले के जैक को एक छोर पर उत्तेजना कक्ष (पूरक चित्रा 1 सी) और दूसरे छोर पर उत्तेजक (पूरक चित्रा 1 डी) से संलग्न करें।
  8. उत्तेजक आवृत्ति को 0.2 हर्ट्ज पर सेट करें और एक कुएं के भीतर सभी रॉड के आकार के कार्डियक मायोसाइट्स के ~ 10% -20% में संकुचन प्राप्त करने के लिए वोल्टेज (~ 12 वी) सेट करें। अनुबंध मायोसाइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए, कक्ष को 4x से 10x आवर्धन के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  9. उत्तेजना कक्ष को एक इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 (पूरक चित्रा 1 ई) में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 20-25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में पहले से गर्म मीडिया का उपयोग करके हर 12 घंटे में मीडिया बदलें। हर 12 घंटे में मीडिया बदलने के साथ 3 दिनों तक विद्युत उत्तेजना जारी रखें।

2. वयस्क चूहे कार्डियक मायोसाइट्स का सिकुड़ा हुआ कार्य विश्लेषण

  1. प्रयोग से पहले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक जेल पैक और मीडिया को गर्म करें।
  2. सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन प्लेटफ़ॉर्म घटक चालू करें और पूरक चित्र 2 में दिखाए गए हैं, प्रमुख घटकों पर विशेष ध्यान देने के साथ, जिसमें गहरे लाल (590 एनएम) फिल्टर (पूरक चित्रा 2 ए -2,3) के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ एक एंटी-कंपन टेबल (पूरक चित्रा 2 ए -1) और सीसीडी नियंत्रक से जुड़ा सीसीडी कैमरा (पूरक चित्रा 2 ए -4) शामिल है (पूरक चित्रा 2 ए -5 और पूरक चित्रा 2 ए -5 और पूरक चित्रा 2 सी -5) और एक पीसी कंप्यूटर (पूरक चित्रा 2 बी -14) के साथ एकीकृत।
  3. पेरिस्टालिक पंप में ट्यूबिंग को इकट्ठा करें (पूरक चित्रा 2 ए -8; पूरक चित्रा 2 ए -8), प्रीहीट जेल पैक को ट्यूब धारक (पूरक चित्रा 2 ए -9) में स्थानांतरित करें, और वैक्यूम (पूरक चित्रा 2 ए -11) और सेल उत्तेजक (पूरक चित्रा 2 बी -13) को बिजली चालू करें।
  4. इंसुलेटेड ट्यूब होल्डर (पूरक चित्रा 2 ए -9) में मीडिया के साथ 50 एमएल ट्यूब रखें और पेरिस्टालिक पंप ट्यूबिंग (पूरक चित्रा 2 ई -8) के माध्यम से ~ 0.5 एमएल / मिनट पर छिड़काव शुरू करें।
  5. एक छोटी वजन नाव (~ 2 एमएल) में प्रीहीटेड मीडिया की एक छोटी मात्रा जोड़ें। उत्तेजना कक्ष से वजन नाव में मायोसाइट्स युक्त एक सीएस स्थानांतरित करें। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में उत्तेजना कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस करें।
  6. तौल नाव से सीएस को हटा दें और धीरे से नीचे की ओर पोंछें। सीएस को एक ताजा चिकना सीएस कक्ष (पूरक चित्रा 2 ए, एफ -10; काला तीर) में स्थानांतरित करें और धीरे से सीएस पर मीडिया (~ 200 μL) की एक बूंद जोड़ें।
  7. सीएस (पूरक चित्रा 2 एफ; ग्रे तीर) के ऊपर एक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड माउंट रखें और फोर्सप्स का उपयोग करके शीर्ष पर एक नया सीएस बिछाएं। सीएस सैंडविच के ऊपर एक शीर्ष माउंट (पूरक चित्र 2 एफ; सफेद तीर) रखें और फिर कक्ष को इकट्ठा करने के लिए दो या चार # 0 पैन-हेड स्क्रू स्थापित करें।
  8. एक बार जब मीडिया पंप ट्यूबिंग में मौजूद होता है, तो ट्यूबिंग को प्रीहीटर से संलग्न करें, और फिर प्रीहीटर को चरण 2.7 में इकट्ठे सीएस कक्ष से कनेक्ट करें। 0.5 एमएल / मिनट पर छिड़काव शुरू करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कक्ष के नीचे एक ऊतक पोंछा रखें कि कोई रिसाव नहीं है।
  9. स्टेज एडाप्टर में सीएस कक्ष रखें। संक्रमित मीडिया को वैक्यूम सिस्टम से जुड़े ट्यूबिंग के साथ कक्ष के विपरीत छोर पर एकत्र किया जाता है। हीटिंग सिस्टम (पूरक चित्रा 2 ए, डी -7) चालू करें और 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर मीडिया तापमान को प्राप्त करने के लिए ~ 5-10 मिनट के लिए कक्ष, उद्देश्य और प्रीहीटर को बराबर करें। इस संतुलन समय के दौरान माइक्रोस्कोप पर 40x जल विसर्जन उद्देश्य के साथ मायोसाइट्स की कल्पना करें।
  10. रॉड के आकार की कोशिकाओं के 80% संकुचन के लिए आवश्यक सेटिंग को 1.5 गुना पर सेट करके पेसिंग उत्तेजक (पूरक चित्रा 2 बी -13) को सक्रिय करें, जो आमतौर पर 35-40 वी है। सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन और मायोसाइट अस्तित्व को अनुकूलित करने के लिए उत्तेजना आवृत्ति को 0.2 हर्ट्ज पर सेट करें।
  11. लगातार प्रभावित और तेज मायोसाइट्स से सिकुड़ा हुआ छोटा और फिर से लंबा निशान इकट्ठा करें। छोटे माप एकत्र करने के लिए, सीसीडी नियंत्रक (पूरक चित्रा 2 बी -5, सी) से जुड़े सीसीडी कैमरा (पूरक चित्रा 2 ए -4) और आई / ओ नियंत्रक बोर्ड (पूरक चित्रा 2 बी -14; सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक समर्पित कंप्यूटर का उपयोग करें। मंच चूहे के मायोसाइट्स में सरकोमेरे शॉर्टिंग को मापता है, हालांकि इसी तरह के परिणाम मायोसाइट्स के अनुदैर्ध्य किनारों से एकत्र किए गए मायोसाइट माप से प्राप्त होते हैं (देखें एक्लेरल एट अल.14)।
  12. Sarcomere शॉर्टिंग निशान एकत्र करने के लिए, कंप्यूटर पर सॉफ़्टवेयर खोलें, OK का चयन करें, और फिर नया फ़ाइल >. निशान का चयन करके एक स्क्रीन टेम्पलेट तैयार करें > सरकोमेरे लंबाई > उपयोगकर्ता सीमा संपादित करें और फिर अधिकतम और न्यूनतम मान सेट करें, जो आमतौर पर 2.0 μm और 1.5 μm के बीच होते हैं। मायोसाइट्स (चित्रा 1 डी) में माप करने से पहले 0.01 मिमी ग्रैटिक्यूल के साथ सीसीडी कैमरे को कैलिब्रेट करें।
  13. सरकोमेरे लंबाई के निशान रिकॉर्ड करने के लिए, फ़ाइल > नया का चयन करें. एक अनुबंधित मायोसाइट की पहचान करें और कैमरे के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ मायोसाइट को स्थान दें ताकि स्ट्राइक पैटर्न ऊर्ध्वाधर हो (चित्रा 1 बी)।
  14. मायोसाइट्स (चित्रा 1 सी) पर रुचि के क्षेत्र (ROI) बॉक्स (गुलाबी बॉक्स) रखने के लिए कंप्यूटर माउस का उपयोग करें। सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन एकत्रित करें और रिकॉर्ड करना प्रारंभ करें का चयन करें. कम उत्तेजना आवृत्तियों (≤0.5 हर्ट्ज) पर प्रत्येक मायोसाइट से 60 सेकंड के लिए रिकॉर्ड शॉर्टिंग।
  15. यदि अध्ययनों में एगोनिस्ट/विरोधी के साथ उपचार शामिल है, तो 1 सेल/सीएस पर माप करें। एक मल्टी-चैनल पेरिस्टाल्टिक पंप में लोड किए गए अलग-अलग प्री-वार्मेड मीडिया और छिड़काव ट्यूबिंग का एक अलग, समर्पित टुकड़ा तैयार करें और चरण 2.9.-2.14 का पालन करें। मायोसाइट्स सिकुड़ा हुआ कार्य पर दवा या न्यूरोहार्मोन वितरण के प्रभाव को मापने के लिए।
  16. आवृत्तियों की एक श्रृंखला पर शॉर्टिंग को मापने के लिए,रिकॉर्डिंग से पहले स्थिर-अवस्था शॉर्टिंग प्राप्त करने के लिए प्रत्येक आवृत्ति पर मायोसाइट्स को गति दें। इन अध्ययनों के लिए, छिड़काव दर को दोगुना करें और 0.2 हर्ट्ज और 2 हर्ट्ज की सीमा में आवृत्तियों के लिए लगातार स्थिर-राज्य सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए एक नई आवृत्ति पर उत्तेजना के बाद 15-20 सेकंड रिकॉर्ड करना शुरू करें।
  17. रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करते समय विश्वसनीय सिग्नल-औसत डेटा प्राप्त करने के लिए कम से कम 7 संकुचन / सेल रिकॉर्ड करें (चरण 3 देखें)।

3. पृथक मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ कार्य का डेटा विश्लेषण

  1. प्रारंभ करने के लिए, फ़ाइल का चयन करें, रिकॉर्ड किए गए ट्रेस का चयन करें, और तब खोलें का चयन करें. बेस ट्रेस के टैब 1 (बाईं ओर) का चयन करें और फिर ट्रेस के शीर्ष पर पीले पैनल को सारक-लंबाई पर सेट करें। चरण 2.12 में तैयार किए गए निशान और स्क्रीन टेम्पलेट का चयन करें।
  2. विश्लेषण टेम्पलेट तैयार करने के लिए, t0 बॉक्स की परिभाषा में ऑपरेशन, मोनोटोनिक ट्रांसिएंट विश्लेषण विकल्प, TTL इवेंट मार्क का चयन करें, साथ ही मेनू से निम्नलिखित विकल्प: बेसलाइन (आराम करने वाले सार्कोमेरे की लंबाई), t0 (dep v), पीक (पीक ऊंचाई और % पीक ऊंचाई / बेसलाइन या bl% पीक h), tPeak (ret v) के सापेक्ष वापसी वेग, टी0 का उपयोग करके पीक 50% (टीटीपी50%) और टीपीक का उपयोग करके टाइम टू बेसलाइन 50% (टीटीआर50%)। किसी पहचानकर्ता के साथ टेम्पलेट > विश्लेषण टेम्पलेट सहेजें का चयन करके इन विश्लेषण विकल्पों को सहेजें. प्रत्येक ट्रेस का विश्लेषण करने से पहले इस विश्लेषण टेम्पलेट को लोड करें।
  3. डेटा विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए, चिह्न > गेट का चयन करें > इवेंट मार्क > विश्लेषण श्रेणी से क्षणिक > कनवर्ट जोड़ें. अब 0.2 हर्ट्ज पर गति वाले मायोसाइट्स के लिए -0.01 सेकंड से 1.20 सेकंड तक समय सीमा सेट करें (चित्रा 2 ए, कच्चे निशान के निचले हिस्से पर लाल निशान)। उच्च आवृत्तियों पर उत्तेजित मायोसाइट्स के लिए एक कम समय सीमा का चयन करें।
  4. औसत घटनाओं के संचालन का चयन करके सिग्नल-औसत ट्रेस > उत्पादन करें। एक सिग्नल-औसत रिकॉर्डिंग मूल बेस ट्रेस के नीचे दिखाई देती है।
  5. सिग्नल-औसत ट्रेस (स्क्रीन के बाईं ओर) के टैब 1 का चयन करें, और फिर ऊपरी मेनू पर चिह्नों का चयन करें, इसके बाद क्षणिक जोड़ें। सिग्नल-औसत डिस्प्ले पैनल में बेसलाइन सरकोमेरे लंबाई, पीक ऊंचाई, बीएल% पीक एच, डीईपी वी, रेट वी, टीटीपी50% और टीटीआर 50% के लिए सिग्नल-औसत मान प्रदर्शित करने के लिए शीर्ष मेनू और मोनोटोनिक क्षणिक विश्लेषण से संचालन का चयन करें।
  6. क्लिपबोर्ड करंट के निर्यात > मोनोटोनिक क्षणिक विश्लेषण का चयन करके कई मायोसाइट्स के समग्र विश्लेषण के लिए प्रत्येक सार्कोमेरे क्षणिक विश्लेषण को एक स्प्रेडशीट > स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्रेस के लिए इस डेटा को स्प्रेडशीट में पेस्ट करें।
  7. सिग्नल-औसत ट्रेस की प्रतिलिपि बनाने के लिए, क्लिपबोर्ड > विकल्प > वर्तमान ट्रेस निर्यात > चुनें और दशमलव स्थानों को 5 पर सेट करें, फिर टैब ्स डेलिमीटर का चयन करें, और ठीक क्लिक करें. प्रत्येक मायोसाइट रिकॉर्डिंग के लिए सिग्नल-औसत निशान को दूसरी स्प्रेडशीट में पेस्ट करें।

4. चूहे के वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स में सीए2 + ट्रांसिएंट्स रिकॉर्ड करना

  1. सीए2 + ट्रांसिएंट्स को मापने से पहले, अतिरिक्त फ्लोरेसेंस इमेजिंग घटकों के साथ चरण 2.2 में वर्णित प्लेटफ़ॉर्म घटकों को चालू करें (सामग्री की तालिका में सीए2 + इमेजिंग विश्लेषण के लिए अतिरिक्त घटक देखें; पूरक चित्रा 2 ए -5,6; 2 बी -12)।
  2. डिमेथिलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 1 एमएम फुरा -2 एएम प्लस 0.5 एम प्रोबेनेसिड युक्त फुरा -2 एएम स्टॉक समाधान तैयार करें। प्रोबनेसिड फुरा -2 एएम रिसाव को कम करताहै 15.
  3. स्टॉक समाधान को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में 2.5 एमएल मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) में 5 μM Fura-2AM और 2.5 mM प्रोबनेसिड तक पतला करें। प्लेट में तीन अतिरिक्त कुओं में अकेले 2.5 एमएल मीडिया जोड़ें (कोई फुरा -2 एएम नहीं), प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें, और मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
  4. पेसिंग कक्ष से मायोसाइट्स युक्त सीएस को फुरा -2 एएम वाले कुएं में स्थानांतरित करें, कवर करें, और प्लेट को 4 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें। छिड़काव पंप में माउंट ट्यूबिंग और फुरा -2 एएम लोडिंग अवधि के दौरान मीडिया के साथ फैलता है, जैसा कि चरण 2.4 में वर्णित है।
  5. फ्लोरेसेंस फोटोब्लीचिंग को कम करने और फ्लोरेसेंस सिग्नल को अनुकूलित करने के लिए कमरे की रोशनी को बंद या कम करें। इनक्यूबेटर से 6-वेल प्लेट को हटा दें, और फिर सीएस को अकेले मीडिया वाले तीन कुओं में से प्रत्येक में 10 सेकंड के लिए धो लें। सीएस को एक छोटी वजन वाली नाव में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्व-मीडिया हो (फुरा -2 एएम नहीं जोड़ा गया)।
  6. सीएस के नीचे के हिस्से को धीरे-धीरे पोंछने के बाद सीएस को ताजा चिकना सीएस कक्ष में माउंट करें। धीरे से सीएस में मीडिया की एक बूंद जोड़ें, और फिर सीएस के ऊपर इलेक्ट्रोड माउंट को इकट्ठा करें, इसके बाद एक दूसरा सीएस और शीर्ष माउंट। सेल कक्ष को इकट्ठा करने के लिए # 0 पैन-हेड स्क्रू का उपयोग करें, जैसा कि चरण 2.6.-2.7 में वर्णित है।
  7. मीडिया से भरे पंप टयूबिंग को प्रीहीटर से कनेक्ट करें, प्रीहीटर को सीएस चैंबर से कनेक्ट करें, और चरण 2.8 में वर्णित स्टेज एडाप्टर में रखें। वैक्यूम ट्यूबिंग सिस्टम के साथ मीडिया एकत्र करें और कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करने के लिए हीटिंग सिस्टम (पूरक चित्रा 2 ए, डी -7) चालू करें, जैसा कि चरण 2.8.-2.9 में वर्णित है।
  8. चरण 2.10 में वर्णित 35-40 वी और 0.2 हर्ट्ज पर सेट पेसिंग उत्तेजक (पूरक चित्रा 2 बी -13) को सक्रिय करें।
  9. सीए2 + क्षणिक रिकॉर्ड करने से पहले, कीबोर्ड को देखने में मदद करने के लिए कंप्यूटर कीबोर्ड के पास लगी एक छोटी टॉर्च या बुकलाइट चालू करें। इसके अलावा, कार्डियक मायोसाइट्स के बिना एक क्षेत्र में प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि रिकॉर्ड करें। प्रारंभ करने के लिए, चरण 2.12 में वर्णित के अनुसार, नया प्रारंभ > फ़ाइल > का चयन करें.
  10. एक ROI का चयन करें, और कच्चे प्रगणक के लिए एक टैब (या ट्रेस बार, बाईं ओर) सेट करें और प्रत्येक टैब के ऊपरी-केंद्र में परिभाषित कच्चे भाजक के लिए एक दूसरा टैब सेट करें। 10-20 सेकंड के लिए पृष्ठभूमि रिकॉर्ड करें। माउस पर राइट-क्लिक करें और कच्चे सिग्नल-औसत प्रगणक और भाजक मान प्राप्त करने के लिए एक ट्रेस बार पैनल पर खींचें। संचालन > स्थिरांक का चयन करके इन मानों को दर्ज करें, और कच्चे मान दर्ज करें।
  11. शॉर्टनिंग और सीए2+ ट्रांसिएंट्स दोनों को इकट्ठा करने के लिए एक नया स्क्रीन टेम्पलेट तैयार करें। Sarcomere लंबाई के लिए, टैब 1 का चयन करें और चरण 2.13 में वर्णित समान प्रक्रिया का उपयोग करें। सीए2+ इमेजिंग के लिए, अनुपात के लिए न्यूनतम और अधिकतम स्तर सेट करने के लिए ट्रेस > एडिट यूजर लिमिट्स > टैब 2 > अनुपात (टैब का ऊपरी-केंद्र) का चयन करें, जो आमतौर पर 1 और 5 के बीच सेट होते हैं। टैब 3 और 4 (बाईं ओर) के लिए प्रगणक और भाजक श्रेणियों को परिभाषित करने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें।
  12. चरण 2.14 में वर्णित मायोसाइट्स छवि पर एक आरओआई बॉक्स रखें। नई > एकत्र > फ़ाइल का चयन करें. अब शॉर्टिंग और रेशियोमेट्रिक सीए2+ डेटा एकत्र करने के लिए स्टार्ट का चयन करें। सिग्नल-औसत विश्लेषण के लिए रिकॉर्ड ≥7 संकुचन / सेल।
  13. चरण 4.10 में वर्णित पृष्ठभूमि ट्रेस रिकॉर्डिंग दोहराएँ। 2-4 मायोसाइट्स रिकॉर्ड करने के बाद। आमतौर पर, 4-5 मायोसाइट्स / सीएस या कम मायोसाइट्स रिकॉर्ड करें यदि पृष्ठभूमि पढ़ने में महत्वपूर्ण परिवर्तन होते हैं।

5. पृथक मायोसाइट्स में सीए2 + क्षणिकों का डेटा विश्लेषण।

  1. विश्लेषण के लिए वांछित फ़ाइल खोलें और छोटा करने के लिए स्क्रीन टेम्पलेट > टेम्पलेट का चयन करें। इसके बाद, क्रमशः सरकोमेरे लंबाई और सीए 2 + अनुपात दिखाने के लिए टैब 1 और2 (बाएं) का चयन करें। स्थिरांक > संचालन का चयन करें और Ca2+ पृष्ठभूमि ट्रेस से गणक और भाजक मान दर्ज करें।
  2. सीए2 + क्षणिक डेटा को छोटा करने के लिए विश्लेषण टेम्पलेट तैयार करें। टैब 1 (बाईं ओर) का चयन करें और चरण 3.2 में वर्णित समान प्रक्रिया का उपयोग करें। सरकोमेरे लंबाई विश्लेषण टेम्पलेट सेट करने के लिए।
  3. टैब 2 (बाईं ओर) का चयन करें, और t0 बॉक्स की परिभाषा में संचालन, मोनोटोनिक क्षणिक विश्लेषण विकल्प, TTL इवेंट मार्क का चयन करें, और मेनू से निम्नलिखित विकल्प: बेसलाइन (बेसल अनुपात), t0 के सापेक्ष प्रस्थान वेग (dep v), पीक (पीक ऊंचाई और % पीक ऊंचाई / बेसलाइन या bl%पीक h), tPeak (ret v) के सापेक्ष क्षय वेग, टी0 का उपयोग करके पीक 50% (टीटीपी50%) और टीपीक का उपयोग करके टाइम टू बेसलाइन 50% (टीटीआर50%)। इन विश्लेषण विकल्पों को टेम्पलेट्स का चयन करके सहेजें और किसी नए पहचानकर्ता नाम का उपयोग करके विश्लेषण टेम्पलेट सहेजें . प्रत्येक ट्रेस का विश्लेषण करने से पहले इस विश्लेषण टेम्पलेट को लोड करें।
  4. चरण 3.3.-3.6 में वर्णित उसी प्रक्रिया का उपयोग करें। सिग्नल का औसत निकालने के लिए और फिर सार्कोमेरे की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए, इसके बाद सीए2 + ट्रांसिएंट्स के लिए समान चरण हैं। सरकोमेरे लंबाई के लिए और सीए2 + क्षणिक अनुपात ट्रेस के लिए अलग-अलग अंक सेट करें।

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Representative Results

सिकुड़ा हुआ कार्य अध्ययन चूहे के मायोसाइट्स पर किया जाता है जो अलगाव के बाद (दिन 2) के बाद 4 दिनों तक शुरू होता है। यद्यपि मायोसाइट्स को अलगाव के बाद दिन (यानी, दिन 2) दर्ज किया जा सकता है, लेकिन सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन 8 को संशोधित करने के लिए जीन स्थानांतरण या उपचारके बाद अक्सर लंबे समय तक संस्कृति समय की आवश्यकता होती है। अलगाव के बाद 18 घंटे से अधिक समय तक संवर्धित मायोसाइट्स के लिए, अनुभाग 1 में वर्णित पेसिंग प्रोटोकॉल टी-नलिकाओं को बनाए रखने और लगातार छोटा करने और फिर से लंबा करने वाले परिणामों को बनाए रखने में मदद करता है।

अध्ययन को छोटा करने के लिए मायोसाइट्स युक्त सीएस का एक प्रतिनिधि हिस्सा चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, साथ ही आरओआई (चित्रा 1 बी) स्थापित करने से पहले उचित रूप से तैनात मायोसाइट के साथ। एक बार आरओआई की पहचान हो जाने के बाद (चित्रा 1 सी; गुलाबी बॉक्स), मायोसाइट के नीचे दिखाई गई एल्गोरिदम जानकारी रिकॉर्डिंग से पहले मायोसाइट पोजिशनिंग को अनुकूलित करने में भी मदद करती है। विशेष रूप से, रैखिक ऑप्टिकल घनत्व (एलओडी; ब्लैक लाइन) सरकोमेरेस की संख्या और रिक्ति के लिए एक संकेतक है, और तेजी से फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रेस (एफएफटी, लाल रेखा) में एक तेज पावर स्पेक्ट्रम छोटा करने और फिर से लंबा करने की रिकॉर्डिंग के लिए इष्टतम संरेखण प्राप्त करने में मदद करता है। सरकोमेरे लंबाई (और किनारे का पता लगाने) के अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्रैटिक्यूल पैटर्न को चित्रा 1 डी में दिखाया गया है। सरकोमेरे लंबाई छोटा करने की एक विशिष्ट संरेखित रिकॉर्डिंग चित्रा 2 ए (शीर्ष पैनल) में दिखाई गई है, साथ ही खंड 3 (निचले पैनल) में वर्णित सिग्नल-औसत विश्लेषण भी है।

पशु मॉडल में विवो डिसफंक्शन होने पर अक्सर मायोसाइट्स में शिथिलता का पता लगाया जाता है। उदाहरण के लिए, दबाव अधिभार (पीओ) 13 के जवाब में इकोकार्डियोग्राफी द्वारा देखी गई सिस्टोलिक शिथिलता भी मायोसाइट शॉर्टिंग अध्ययन5 में पाई जाती है। डेटा निशान को स्पष्ट करने के लिए, प्रतिनिधि कच्चे (चित्रा 2; ऊपरी पैनल) और सिग्नल-औसत (चित्रा 2; निचला पैनल) 0.2 हर्ट्ज पर प्राप्त निशान शाम- (चित्रा 2 ए) और पीओ-उपचारित (चित्रा 2 बी) चूहों से मायोसाइट्स के लिए दिखाए गए हैं। यह जांचने के लिए कि क्या पीओ के बाद मायोसाइट फ़ंक्शन को बचाया जा सकता है, मायोसाइट अलगाव के समय वायरल-मध्यस्थता जीन स्थानांतरण का उपयोग सरकोमेरे16 में फॉस्फो-मिमेटिक सीटीएनआई टी 144 डी प्रतिस्थापन (टी 144 डी) के साथ अंतर्जात कार्डियक ट्रोपोनिन आई (सीटीएनआई) को बदलने के लिए भी किया गया था। प्रारंभिक विश्लेषण से पता चलता है कि सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन (तालिका 1, ऊपरी पैनल) में पीओ-प्रेरित कमी सीटीएनआईटी 144 डी (तालिका 1; निचला पैनल) के जीन हस्तांतरण के 4 दिन बाद पीओ मायोसाइट्स में शाम के स्तर की ओर लौट आई।

इस मंच का उपयोग अलग-थलग मायोसाइट्स में छोटा होने के साथ-साथ सीए2 + ट्रांसिएंट्स को मापने के लिए भी किया जा सकता है। पीओ के बाद शॉर्टिंग और सीए2 + दर्ज नहीं किए गए थे क्योंकि पीओ लैमिनिन13 के लिए चूहे के मायोसाइट्स के पालन को कम करता है, और एक तुलनीय मॉडल ने पहले दिखाया था कि सीए2 + हैंडलिंग एक ही समय बिंदु17 पर विकसित होता है। इसके बजाय, 2-3 महीने के चूहों से अलग फुरा -2 एएम-लोडेड मायोसाइट्स में प्रतिनिधि प्रयोग किए गए थे। तालिका 2 में डेटा विश्लेषण के साथ, एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग और सिग्नल-औसत निशान चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। प्रयोगों के इस सेट के लिए, वयस्क चूहों से अलग मायोसाइट्स का अध्ययन सीटीएनआईटी 144 डी या वाइल्ड-टाइप सीटीएनआई के एडेनोवायरल-मध्यस्थता जीन ट्रांसफर (संक्रमण की बहुलता = 100) के 4 दिन बाद किया गया था। फुरा -2 एएम के साथ मायोसाइट्स लोड करने के बाद सरकोमेर शॉर्टनिंग और सीए 2+ ट्रांसिएंट्स दोनों को मापा गया था। सीटीएनआईटी 144 डी के जीन स्थानांतरण ने इन प्रारंभिक अध्ययनों में सीटीएनआई की तुलना में पीक शॉर्टिंग और ऊंचा डायस्टोलिक सीए2 + स्तर को बढ़ाया (तालिका 2)। जबकि अधिक व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है, प्रारंभिक परिणाम बताते हैं कि सीटीएनआईटी 144 डी के साथ विवो प्रतिस्थापन में समय के साथ सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन और सीए2 + हैंडलिंग दोनों में परिवर्तन के कारण एक जटिल कार्डियक फेनोटाइप का उत्पादन हो सकता है।

Figure 1
चित्र 1: वयस्क चूहे कार्डियक मायोसाइट्स कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किए जाते हैं। (A) प्रतिनिधि ने एक वयस्क चूहे से कार्डियक मायोसाइट्स को अलग किया (स्केल बार = 50 μm)। एरो सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए चित्रित एक प्रतिनिधि मायोसाइट को इंगित करता है। (बी) एक आरओआई (गुलाबी) के साथ प्रतिनिधि मायोसाइट साइड में स्थित है (स्केल बार = 20 μm)। (सी) आरओआई (ऊपरी पैनल) के साथ प्रतिनिधि मायोसाइट, इस मायोसाइट के लिए सरकोमेरे पैटर्न (निचला पैनल, नीला; स्केल बार = 20 μm), और पावर स्पेक्ट्रम का तेज शिखर (निचला पैनल, लाल)। (डी) छोटे माप को कैलिब्रेट करने के लिए 0.01 मिमी ग्रेटिक्यूल का स्क्रीन कैप्चर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चूहे मायोसाइट्स से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। (ए) शाम- और (बी) प्रेशर ओवरलोड (पीओ) -उपचारित चूहों से मायोसाइट्स में 0.2 हर्ट्ज पर एक कच्ची रिकॉर्डिंग (ऊपरी पैनल) और सिग्नल-औसत (निचला पैनल) ट्रेस दर्ज किया गया। मायोसाइट्स को सर्जरी के 18-20 सप्ताह बाद अलग किया गया था, जिसमें पीओ सुप्रा-रीनल कोआर्केशन13 द्वारा उत्पादित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: फुरा-2एएम-लोडेड वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स से सरकोमेरे लंबाई (SL) और Ca2+ क्षणिकों की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग और विश्लेषण। (A) SL के लिए कच्चे निशान, Ca2+ क्षणिक अनुपात (अनुपात), और Ca2+ क्षणिक अनुपात का उत्पादन करने के लिए प्रगणक और भाजक निशान का उपयोग किया जाता है। (बी) एसएल (ऊपरी ट्रेस) और सीए2 + क्षणिक अनुपात (निचले ट्रेस) के लिए सिग्नल-औसत निशान का एक उदाहरण। (सी) मोनोटोनिक ट्रेस एल्गोरिदम का उपयोग करके सरकोमेरे लंबाई (एसएल) और सीए2 + क्षणिक अनुपात के लिए निशान का विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चूहे का समूह शाम (n = 30) PO (n = 32)
आराम करने वाले सरकोमेरे की लंबाई (मिमी; एसएल) 1.761 + 0.006 1.748 + 0.004
शिखर ऊंचाई (बेसलाइन का%) 9.003 + 0.409 6.680 + 0.552*
पीक आयाम (मिमी) 0.159 + 0.007 0.117 + 0.010*
शॉर्टनिंग दर (mm/s) -4.674 + 0.285 -4.143 + 0.335
पुन: लंबी करने की दर (mm/s) 3.251 + 0.223 2.706 + 0.273
चरम पर पहुंचने का समय (एमएस; टीटीपी) 60 + 2 59 + 3
50% पुन: लंबा करने का समय (एमएस; टीटीआर 50% 35 + 2 37 + 3
चूहे का समूह शाम + cTnIT144D (n = 14) PO + cTnIT144D (n = 17)
आराम करने वाले सरकोमेरे की लंबाई (मिमी; एसएल) 1.768 + 0.009 1.776 + 0.004
शिखर ऊंचाई (बेसलाइन का%) 9.038 + 1.339 8.414 + 0.960
पीक आयाम (मिमी) 0.160 + 0.023 0.149 + 0.016
शॉर्टनिंग दर (mm/s) -5.972 + 0.711 -4.173 + 0.726
पुन: लंबी करने की दर (mm/s) 3.925 + 0.577 3.055 + 0.403
चरम पर पहुंचने का समय (एमएस; टीटीपी) 51 + 5 59 + 2
50% पुन: लंबा करने का समय (एमएस; टीटीआर 50% 31 + 3 32 + 2

तालिका 1: दबाव अधिभार (पीओ) और जीन हस्तांतरण के जवाब में कार्डियक मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ कार्य की तुलना। मायोसाइट्स शॉर्टिंग के परिणाम सर्जरी के 18-20 सप्ताह बाद शाम और पीओ चूहे के दिल (ऊपरी पैनल) 5,13 और शाम और पीओ चूहों से मायोसाइट्स सीटीएनआईटी 144 डी जीन ट्रांसफर (निचले पैनल) के 4 दिन बाद होते हैं। सभी समूहों में मायोसाइट्स अलगाव / जीन स्थानांतरण के 4 दिन बाद सिकुड़ा हुआ कार्य मापा जाता है। परिणाम एसईएम (एन = मायोसाइट्स की संख्या) ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। शाम और पीओ डेटा के प्रत्येक सेट की तुलना छात्र के टी-टेस्ट द्वारा की जाती है, जिसमें * पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है। अकेले शाम और पीओ मायोसाइट्स के लिए पीक आयाम परिणाम पहले रविचंद्रन एट अल.5 में रिपोर्ट किए गए थे।

सरकोमेरे लंबाई विश्लेषण
जीन स्थानांतरण समूह cTNI (n = 21) cTnIT144D (n = 16)
आराम करने वाले सरकोमेरे की लंबाई (मिमी; एसएल) 1.81 + 0.01 1.81 + 0.01
पीक आयाम (मिमी) 0.11 + 0.01 0.14 + 0.02*
शॉर्टनिंग दर (mm/s) -4.29 + 0.42 -4.67 + 0.77
पुन: लंबी करने की दर (mm/s) 2.92 + 0.43 3.71 + 0.64
चरम पर पहुंचने का समय (एमएस; टीटीपी) 50 + 4 84 + 28
50% पुन: लंबा करने का समय (एमएस; टीटीआर50%) 37 + 4 35 + 6
सीए2 + क्षणिक विश्लेषण
जीन स्थानांतरण समूह cTNI (n = 21) cTnIT144D (n = 19)
सीए2 + अनुपात को आराम देना 0.89 + 0.02 1.04 + 0.04*
पीक सीए2 + अनुपात 0.50 + 0.05 0.42 + 0.07
Ca2+ क्षणिक दर (D/sec) 45.24 + 5.85 40.53 + 10.95
Ca2+ क्षय दर (D/s) -4.91 + 0.99 -2.87 + 0.57
सीए2 + (एमएस) को चोटी बनाने का समय; टीटीपी) 34 + 2 41 + 3
50% सीए2 + क्षय (एमएस) के लिए समय; टीटीडी50%) 101 + 8 117 + 6

तालिका 2: सीटीएनआईटी 144 डी जीन स्थानांतरण के 4 दिन बाद वयस्क चूहे मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन और सीए2 + क्षणिक। जंगली प्रकार के सीटीएनआई की तुलना में सीटीएनआईटी 144 डी के जीन हस्तांतरण के बाद मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन (ऊपरी पैनल) और सीए2 + ट्रांसिएंट्स (निचला पैनल) का विश्लेषण दिखाया गया है। मायोसाइट्स को 2-3 महीने के वयस्क चूहों से अलग किया जाता है, और डेटा को एसईएम (एन = मायोसाइट्स की संख्या) ± के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन (बाएं) और सीए2 + ट्रांसिएंट्स (दाएं) की सांख्यिकीय तुलना एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की जाती है, जिसका महत्व *पी < 0.05 होता है।

पूरक चित्रा 1: लैमिनिन-लेपित सीएस पर चढ़ाए गए मायोसाइट्स के लिए पेसिंग सिस्टम के घटक। (ए) कस्टम पेसिंग चैंबर जिसमें प्रत्येक कक्ष में प्लैटिनम इलेक्ट्रोड होते हैं। (बी) मीडिया से भरे पहले चार कक्षों के साथ पेसिंग कक्ष। (सी) केले-जैक केबलों से जुड़े पेसिंग चैंबर, जो कक्ष से जुड़े होते हैं और (डी) उत्तेजक। (ई) उत्तेजक (दाएं) और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (बाएं) के बीच संबंध। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: मायोसाइट सिकुड़ा हुआ कार्य और / या सीए2 + क्षणिक माप के लिए आवश्यक घटक। (ए) अनुबंधित फ़ंक्शन प्लेटफॉर्म प्रत्येक घटक को दर्शाता है, जिसमें क्रमांकित वस्तुओं को सामग्री की तालिका में अधिक विस्तार से समझाया गया है। प्लेटफ़ॉर्म के घटकों में एक एंटी-वाइब्रेशन टेबल (# 1), उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (# 2,3), सीसीडी कैमरा (# 4), सीसीडी कंट्रोलर और ज़ेनॉन पावर सप्लाई (# 5), दोहरे उत्सर्जन प्रकाश स्रोत (# 6), तापमान नियंत्रक (# 7), पेरिस्टालिक पंप (# 8), इंसुलेटेड ट्यूब होल्डर (# 9), कवरस्लिप-माउंटेड छिड़काव कक्ष (# 10), और वैक्यूम सिस्टम (# 11) शामिल हैं। (बी) अतिरिक्त घटकों में फ्लोरेसेंस इंटरफ़ेस (# 12), चैंबर उत्तेजक (# 13), और पीसी कंप्यूटर (# 14) शामिल हैं, जिन्हें सामग्री की तालिका में अधिक विस्तार से समझाया गया है। पैनल ए में क्रमांकित आइटम्स के क्लोज-अप दृश्य सी-एफ में दिखाए गए हैं। (सी) क्सीनन पावर सप्लाई (बाएं) और सीसीडी कंट्रोलर (दाएं) का दृश्य। (डी) तापमान नियंत्रक। (ई) पेरिस्टाल्टिक पंप। (एफ) सीएस छिड़काव कक्ष (काला तीर), प्लैटिनम इलेक्ट्रोड माउंट (ग्रे तीर), और # 0 पैन-हेड स्क्रू के साथ शीर्ष माउंट (सफेद तीर) के लिए आधार का दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चरण 1 में उल्लिखित क्रोनिक पेसिंग प्रोटोकॉल पृथक मायोसाइट्स का अध्ययन करने और लंबे समय तक उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी समय बढ़ाता है। हमारी प्रयोगशाला में, क्रोनिक रूप से विकसित मायोसाइट्स पर सार्कोमेरे लंबाई का उपयोग करके सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन मापते समय अलगाव के 4 दिनों के बाद तक लगातार परिणाम प्राप्त किए गए थे। हालांकि, मायोसाइट्स को गति देने के लिए 1 सप्ताह से अधिक पुराने मीडिया का उपयोग करते समय मायोसाइट सिकुड़ा हुआ कार्य जल्दी से बिगड़ जाता है।

सिकुड़ा हुआ कार्य अध्ययन के लिए, डेटा 37 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किया जाता है, जो चूहों के लिए शरीर के तापमान के पास है। मायोसाइट व्यवहार्यता को अनुकूलित करने और प्रत्येक मायोसाइट के लिए लगातार निशान प्राप्त करने के लिए, इन प्रयोगों को चूहों में ~ 5 हर्ट्ज की शारीरिक हृदय गति से कम पेसिंग आवृत्ति पर किया जाता है। ये सेटिंग्स लगातार सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन डेटा उत्पन्न करती हैं, लेकिन कक्ष तापमान और / या पेसिंग आवृत्ति को समायोजित किया जा सकता है यदि छोटे निशान मायोसाइट्स के एक ही उपचार समूह वाले कई सीएस में सुसंगत रहते हैं। इसके अलावा, इष्टतम परिणाम मायोसाइट्स को चुनकर प्राप्त किए जाते हैं जिनमें ब्लीब्स की कमी होती है, सीएस का पूरी तरह से पालन किया जाता है, और रॉड के आकार की कोशिका के दोनों सिरों पर अनुबंध किया जाता है। केवल एक छोर पर जुड़ी कोशिकाएं, जिनमें कई ब्लीब्स होते हैं, और / या मायोसाइट्स केवल एक छोर पर अनुबंधित होते हैं, वांछनीय नहीं होते हैं और अक्सर पृष्ठभूमि आंदोलन के कारण रिकॉर्ड करना अधिक कठिन होता है। इन अध्ययनों के लिए, ≥20 सरकोमेरेस को आरओआई में एक तेज पावर स्पेक्ट्रम पीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आराम करने वाले सरकोमेरे लंबाई और शॉर्टिंग ट्रेस के लिए एक इष्टतम सिग्नल / शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए शामिल किया गया है। यदि पावर स्पेक्ट्रम पीक तेज रहता है तो कम से कम सात सार्कोमेयर के साथ आरओआई का उपयोग किया जा सकता है। पृथक चूहे मायोसाइट्स में आराम करने वाले सरकोमेरे की लंबाई आमतौर पर 2.00-1.80 μm तक होती है। यदि आराम करने वाले सरकोमेरे की लंबाई 1.5 μm से कम है, तो एक सक्रिय संकुचन सरकोमेरे आर्किटेक्चर18 की हमारी समझ के आधार पर यथार्थवादी नहीं है और आमतौर पर उप-इष्टतम मायोसाइट्स अभिविन्यास का परिणाम है।

बरकरार मायोसाइट्स में सीए2 + क्षणिक माप के साथ या उसके बिना सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन का माप एक उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण है जिसमें बरकरारएकल कोशिकाओं में बल माप के लिए आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता विकसित करने में कम निवेश की आवश्यकता होती है। बरकरार मायोसाइट अध्ययन भी बहु-सेलुलरतैयारी में अन्य सेल प्रकारों के योगदान के बिना, विशेष रूप से मायोसाइट फ़ंक्शन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस क्षेत्र में एक उभरता हुआ क्षेत्र विवो विश्लेषण में अधिक व्यापक होने से पहले सेलुलर स्तर पर चिकित्सीय एजेंटों की स्क्रीनिंग में तेजी लाने के लिए कई बरकरार मायोसाइट्स में छोटे और / या सीए2 + क्षणिक को एक साथ मापकर उच्च थ्रूपुट विश्लेषण का विकास है।

चूहों जैसे अन्य कृंतक मॉडल से अलग बरकरार मायोसाइट्स में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन और सीए2 + क्षणिक माप भी संभव हैं, हालांकि चूहे के मायोसाइट्स की तुलना में कुछ महत्वपूर्ण विचार और अंतर हैं। माउस मायोसाइट्स 24-36 घंटे के लिए संस्कृति में व्यवहार्य हैं, लेकिन 48 घंटे 19 से अधिक के लिए सुसंस्कृत मायोसाइट्स में व्यवहार्यता उत्तरोत्तर कम होजाती है। वेक्टर-आधारित जीन स्थानांतरण का उपयोग करते समय इस कटे हुए संस्कृति अंतराल पर विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से मायोफिलामेंट प्रोटीन के लिए जिनके पास घंटों20 के बजाय दिनों में आधा जीवन होता है। चूहे के मायोसाइट्स के विपरीत, माउस मायोसाइट्स का सफल अलगाव और संस्कृति भी मायोसिन एटीपीस इनहिबिटर के अलावा निर्भर करती है, जैसे कि 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोक्सीम या ब्लेबिस्टैटिन, कल्चर मीडिया19 के लिए। नतीजतन, माउस मायोसाइट्स संस्कृतियों में क्रोनिक पेसिंग एक व्यवहार्य विकल्प नहीं है। पृथक माउस मायोसाइट्स पर इन मायोसिन अवरोधकों के कार्यात्मक प्रभाव को हटाने के लिए 15-20 मिनट के लंबे संतुलन समय की भी आवश्यकता होती है। अंत में, चूहे के मायोसाइट्स के लिए उपयोग किए जाने वाले 0.2 हर्ट्ज की तुलना में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छोटे निशान प्राप्त करने के लिए माउस मायोसाइट्स को 0.5 हर्ट्ज पर बेहतर रूप से गति दी जाती है।

पीओ-उपचारित चूहों पर अध्ययन में, चूहे के मायोसाइट्स में कम आवृत्ति पेसिंग के साथ सिकुड़ा हुआ शिथिलता लगातार पता लगाया जाता है। विवो सिकुड़ा हुआ शिथिलता 5,13 होने पर शाम चूहों की तुलना में पीओ के बाद मायोसाइट्स में शॉर्टिंग में अधिक आवृत्ति-निर्भर कमी का भी पता चला है। आवृत्तियों की एक श्रृंखला का उपयोग करते हुए एक अध्ययन के दौरान, पर्याप्त मीडिया प्रदान करने के लिए पंप की गति को दोगुना करने से 0.2 और 2 हर्ट्ज के बीच उत्तेजना आवृत्ति को बदलने के बाद 15-20 सेकंड के भीतर स्थिर-अवस्था छोटा हो जाता है। कुल मिलाकर, मायोसाइट सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन चूहे के मॉडल में विवो कार्डियक डिसफंक्शन की पुष्टि या सत्यापन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण साबित हुआ है, जैसे कि पीओ- शाम-इलाज वाले चूहों की तुलना में (तालिका 1; देखें किम एट अल.13)। इसके अलावा, यह प्लेटफ़ॉर्म परीक्षण कर सकता है कि क्या मायोसाइट्स को लक्षित करने वाला उपचार विवो दृष्टिकोणों में अधिक महंगे और / या श्रमसाध्य का पीछा करने से पहले सिकुड़ा हुआ कार्य को पुनर्स्थापित या बाधित करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके तीव्र वितरण और चिकित्सीय एजेंटों के लिए लंबे समय तक संपर्क और / या प्राथमिक संस्कृति के दौरान जीन वितरण के बाद दोनों संभव हैं। उदाहरण के लिए, अंतर्जात सीटीएनआई को सीटीएनआईटी 144 डी के साथ बदलने के लिए जीन स्थानांतरण प्रयोगों से शाम चूहों से मायोसाइट्स में आयाम को छोटा करने में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं होता है। इसके विपरीत, cTnIT144D PO-उपचारित चूहों (तालिका 1) से मायोसाइट्स में शाम मूल्यों की ओर चरम छोटा आयाम पुनर्स्थापित करता है। इस दृष्टिकोण की एक अंतर्निहित कमजोरी विवो स्थितियों में मायोसाइट्स में मौजूद विशिष्ट भार की अनुपस्थिति है। नतीजतन, प्रतिक्रियाएं लोड-निर्भर कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं से भिन्न हो सकती हैं, और उदाहरण प्रयोग इंगित करता है कि विवो दृष्टिकोण में आगे की जांच करने की आवश्यकता है कि क्या सीटीएनआईटी 144 डी पीओ के दौरान कार्डियक प्रदर्शन में सुधार करता है।

एक ही मायोसाइट में शॉर्टिंग और सीए2 + ट्रांसिएंट्स दोनों का माप इस प्लेटफॉर्म का एक लाभ है। उदाहरण के लिए, संकुचन फ़ंक्शन की तुलना में सीए2 + ट्रांसिएंट्स के लिए परिवर्तन की दिशा भिन्न हो सकती है। जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है, 2-3 महीने के चूहों से मायोसाइट्स में सीटीएनआईटी 144 डी के जीन हस्तांतरण के बाद पीक शॉर्टिंग काफी बढ़ जाती है। यह परिणाम पुराने, शाम-उपचारित मायोसाइट्स (तालिका 1) में प्राप्त डेटा से भिन्न होता है और चूहे की उम्र 5 से संबंधित हो सकताहै। हालांकि, इस व्याख्या को साबित करने के लिए आगे के परीक्षण की आवश्यकता है। तालिका 2 के आंकड़ों से यह भी पता चलता है कि cTnIT144D पीक Ca2+ आयाम को नहीं बदलता है और इसके बजाय, Ca2+ क्षय दर को धीमा कर देता है औरCa2+ को आराम देता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सीटीएनआईटी 144 डी अभिव्यक्ति सिकुड़ा हुआ कार्य को बढ़ाती है, जबकि सीए2 + साइकिलिंग मशीनरी इस प्रभाव को कम करने की भरपाई करती है। ये परिणाम सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन और सीए2 + साइकिलिंग में परिवर्तन के बीच अंतर करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता को उजागर करते हैं। हालांकि यहां प्रस्तुत विशिष्ट परिणाम अभी तक निश्चित नहीं हैं, वे मायोकार्डियल सीटीएनआईटी 144 डी को व्यक्त करने के लिए एक आनुवंशिक पशु मॉडल विकसित करने के लिए एक ठोस तर्क प्रदान करते हैं और मूल्यांकन करते हैं कि क्या इसकी अभिव्यक्ति भविष्य में पीओ के कारण होने वाली शिथिलता को कुंद करती है। सीए2 + क्षणिक डेटा से एक अंतिम अवलोकन यह है कि फुरा -2 एएम जैसे फ्लोरोसेंट रंजक मायोसाइट्स21 में सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन कैनेटीक्स को बदलते हैं। यद्यपि किसी दिए गए उपचार या पशु मॉडल द्वारा उत्पादित सापेक्ष प्रतिक्रिया फुरा -2-लोडेड मायोसाइट्स के भीतर तुलनीय है, इन परिणामों को फुरा -2 एएम की अनुपस्थिति में किए गए छोटे माप के साथ नहीं जोड़ा जाना चाहिए। सीए 2 + क्षणिक विश्लेषण के लिए फुरा -2 एएम के उपयोग को अनुकूलित करने के लिए, प्रयोगशाला अक्सर फुरा -2 एएम की अनुपस्थिति में शॉर्टिंग को मापती है और सीए2 + ट्रांसिएंट्स को मापने के लिए प्रयोगों का एक उप-समूह करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों के अन्य टकराव नहीं हैं।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान आर01 एचएल 144777 (एमवीडब्ल्यू) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEDIA
Bovine serum albumin Sigma (Roche) 3117057001 Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione Sigma G-6529 Final concentration = 10 mM
HEPES Sigma H-7006 Final concentration = 15 mM
M199 Sigma M-2520 1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3 Sigma S-8875 Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin Fisher 15140122 Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma  D2650
Fura-2AM Invitrogen (Molecular Probes) F1221 50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid Invitrogen (Fisher) P36400 Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips Corning 2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks Pomona Electronics B-36-2 Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2  Forma 3110 Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp Forma 1286 Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45 Fine Science Tools 11251-35
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 1800-45
Low magnification inverted microscope Leica DM-IL  Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber Custom Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator Ionoptix Myopacer Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis Ionoptix Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface  - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s) Ionoptix  Myocam with CCD controller  Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).                                                                                               
 Chamber stimulator Ionoptix  Myopacer Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F) Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients Ionoptix PC with Ionwizard PC board and software Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes.
- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI Fine Science Tools 11252-40 Panel F
Insulated tube holder for media Custom Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope Nikon TE-2000S Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table TMC Vibration Control 30 x 36 inches Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding  
Microscope eyepieces & objective Nikon 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.  
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 Panel A #8 and panel E
small weigh boat Fisher  08-732-112
Temperature controller Cell MicroControls TC2BIP Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor  Sylvania #72423 LED light Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter Fisher Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90 Panel A #11

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References

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चिकित्सा अंक 183
कृंतक मायोसाइट्स में कार्डियक सिकुड़ा हुआ डिसफंक्शन और सीए<sup>2 + ट्रांसिएंट्स</sup> का विश्लेषण
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Lavey, E. A., Westfall, M. V.… More

Lavey, E. A., Westfall, M. V. Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes. J. Vis. Exp. (183), e64055, doi:10.3791/64055 (2022).

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