Analyse av hjertekontraktil dysfunksjon og Ca²⁺ transienter i gnagermyocytter

Summary

Det presenteres et sett med protokoller som beskriver måling av kontraktil funksjon via sarkomerlengdedeteksjon sammen med kalsium (Ca²⁺) forbigående måling i isolerte rottemyocytter. Anvendelsen av denne tilnærmingen for studier i dyremodeller av hjertesvikt er også inkludert.

Abstract

Kontraktil dysfunksjon og Ca²⁺ transienter analyseres ofte på cellenivå som en del av en omfattende vurdering av hjerteindusert skade og/eller remodellering. En tilnærming for å vurdere disse funksjonelle endringene benytter losset forkortelse og Ca²⁺ forbigående analyser i primære voksne hjertemyocytter. For denne tilnærmingen isoleres voksne myocytter ved kollagenasefordøyelse, gjøres Ca²⁺ tolerante, og deretter overholdes lamininbelagte dekkslipp, etterfulgt av elektrisk pacing i serumfrie medier. Den generelle protokollen benytter voksne hjertemyocytter hos rotter, men kan lett justeres for primære myocytter fra andre arter. Funksjonelle endringer i myocytter fra skadde hjerter kan sammenlignes med humbug myocytter og/eller med in vitro terapeutisk behandling. Metodikken inkluderer de essensielle elementene som trengs for myocytt pacing, sammen med cellekammeret og plattformkomponentene. Den detaljerte protokollen for denne tilnærmingen inkorporerer trinnene for måling av losset forkortelse ved sarkomerlengdedeteksjon og cellulære Ca²⁺ transienter målt med den ratiometriske indikatoren Fura-2 AM, samt for rådataanalyse.

Introduction

Analysen av hjertepumpefunksjon krever ofte en rekke tilnærminger for å få tilstrekkelig innsikt, spesielt for dyremodeller av hjertesvikt (HF). Ekkokardiografi eller hemodynamiske målinger gir innsikt i in vivo hjertedysfunksjon¹, mens in vitro-tilnærminger ofte benyttes for å identifisere om dysfunksjon oppstår ved endringer i myofilamentet og/eller Ca²⁺ -transienten som er ansvarlig for koblingseksitasjon, eller handlingspotensialet, med kontraktil funksjon (f.eks. eksitasjonskontraksjon [E-C]-kobling). In vitro-tilnærminger gir også mulighet til å screene funksjonell respons på nevrohormoner, vektorinduserte genetiske endringer, samt potensielle terapeutiske midler² før de forfølger kostbare og / eller arbeidskrevende in vivo-behandlingsstrategier .

Flere tilnærminger er tilgjengelige for å undersøke in vitro kontraktil funksjon, inkludert kraftmålinger i intakte trabeculae³ eller permeabiliserte myocytter⁴, samt losset forkortelse og Ca²⁺ transienter i intakte myocytter i nærvær og fravær av HF ^5,6. Hver av disse tilnærmingene fokuserer på hjerte myocytt kontraktil funksjon, som er direkte ansvarlig for hjertepumpefunksjon ^2,7. Imidlertid utføres analysen av både sammentrekning og E-C-kobling sammen oftest ved å måle forkortelse av muskellengden og Ca 2+ transienter i isolerte, Ca²⁺ tolerante voksne myocytter. Laboratoriet bruker en detaljert publisert protokoll for å isolere myocytter fra rottehjerter for dette trinn⁸.

Både Ca²⁺ transiente og myofilamenter bidrar til forkorting og reforlengelse i intakte myocytter og kan bidra til kontraktil dysfunksjon ^2,7. Denne tilnærmingen anbefales derfor når in vitro funksjonsanalyse krever en intakt myocytt som inneholder Ca²⁺ sykkelmaskiner pluss myofilamentene. For eksempel er intakte isolerte myocytter ønskelige for å studere kontraktil funksjon etter modifisering av myofilament- eller Ca²⁺-syklusfunksjonen via genoverføring⁹. I tillegg foreslås en intakt myocyttilnærming for å analysere den funksjonelle effekten av nevrohormoner når man studerer virkningen av nedstrøms andre budbringersignalveier og / eller respons på terapeutiske midler². En alternativ måling av belastningsavhengig kraft i enkeltmyocytter utføres oftest etter membranpermeabilisering (eller skinning) ved lave temperaturer (≤15 °C) for å fjerne Ca²⁺ forbigående bidrag og fokus på myofilamentfunksjon¹⁰. Måling av belastningsavhengig kraft pluss Ca²⁺ transienter i intakte myocytter er sjelden på grunn av den komplekse og tekniske utfordringen ved tilnærming¹¹, spesielt når høyere gjennomstrømning er nødvendig, for eksempel for å måle responser på nevrohormonsignalering eller som en skjerm for terapeutiske midler. Analysen av hjertetrabeculae overvinner disse tekniske utfordringene, men kan også påvirkes av ikke-myocytter, fibrose og / eller ekstracellulær matriksremodellering². Hver av tilnærmingene beskrevet ovenfor krever et preparat som inneholder voksne myocytter fordi neonatale myocytter og myocytter avledet fra induserbare pluripotente stamceller (iPSCs) ennå ikke uttrykker det fulle komplementet til voksne myofilamentproteiner og vanligvis mangler nivået av myofilamentorganisasjon som er tilstede i den voksne stavformede myocyten². Til dags dato indikerer bevis i iPSCs at full overgang til voksne isoformer overstiger mer enn 134 dager i kultur¹².

Gitt fokuset i denne samlingen på HF, inkluderer protokollene tilnærminger og analyser for å differensiere kontraktil funksjon i sviktende versus ikke-sviktende intakte myocytter. Representative eksempler er gitt fra rottemyocytter studert 18-20 uker etter en supra-renal koarktasjon, beskrevet tidligere ^5,13. Sammenligninger blir deretter gjort med myocytter fra humbugbehandlede rotter.

Protokollen og bildebehandlingsplattformen beskrevet her brukes til å analysere og overvåke endringer i forkortelse og Ca^{2 +} transienter i stavformede hjerte myocytter under utviklingen av HF. For denne analysen er 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter belagt på²² mm² lamininbelagte glassdeksler (CSer) og dyrket over natten, som beskrevet tidligere⁸. Komponentene som er montert for denne bildeplattformen, sammen med media og buffere som brukes til optimal avbildning, er gitt i materialtabellen. En guide for dataanalyse ved hjelp av en programvare og de representative resultatene er også gitt her. Den overordnede protokollen er delt inn i separate underseksjoner, med de tre første seksjonene som fokuserer på isolerte rottemyocytter og dataanalyse, etterfulgt av cellulære Ca²⁺ forbigående eksperimenter og dataanalyse i myocytter.

Protocol

Studier utført på gnagere fulgte Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og ble godkjent av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. For denne studien ble myocytter isolert fra 3-34 måneder gamle Sprague-Dawley og F344BN rotter som veide ≥ 200 g⁵. Både mannlige og kvinnelige priser ble brukt.

1. Myocytt pacing for kontraktile funksjonsstudier

1. Lag ferske M199-baserte medier for hvert sett med isolerte myocytter (Table of Materials). 1 dag før pacing, plate 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på²² mm² lamininbelagte glassdeksler (CS), som beskrevet tidligere⁸.
2. For å forberede kamrene, suge hvert kammer i 10% blekemiddel i 1 time. Skyll deretter kamrene med rennende vann fra springen i 30-45 minutter, etterfulgt av destillert vann erstattet hvert 5. minutt i 30 minutter, etterfulgt av avionisert vann erstattet hvert 5. minutt i 30 minutter, og en siste skylling i avionisert vann.
3. Tørk kamrene på en ren overflate i 20-30 minutter (tilleggsfigur 1A-C). Deretter behandler UV kamrene i et biosikkerhetsskap i 5 minutter i hver retning (totalt = 20 min). Dette trinnet er ikke nødvendig for pre-steriliserte kamre.
   FORSIKTIG: Forlat området for å minimere UV-eksponering.
4. Fjern dekselet fra kammeret, tilsett 3 ml M199-baserte medier (se materialtabell) i hver brønn (supplerende figur 1B), skift ut dekselet og forvarm kammeret i en 37 °C inkubator med 5 % CO 2 og 20 % O₂.
5. Steriliser tang i en varm perlesterilisator ved 250 °C i 20-25 s. Overfør det forvarmede stimuleringskammeret fra inkubatoren til et biosikkerhetsskap.
6. Overfør hvert deksel (CS) som inneholder hjertemyocytter til individuelle brønner i stimuleringskammeret ved hjelp av sterile tang. Overfør CS-er fire om gangen, etterfulgt av oppvarming i 10 minutter før overføring av de resterende fire CS-ene for å opprettholde medietemperaturen.
7. Fest bananknektene til stimuleringskammeret i den ene enden (supplerende figur 1C) og til stimulatoren i den andre enden (supplerende figur 1D).
8. Sett stimulatorfrekvensen til 0,2 Hz og still spenningen (~ 12 V) for å oppnå sammentrekning i ~ 10% -20% av alle de stavformede hjertemyocytter i en brønn. For å bestemme antall kontraherende myocytter, plasser kammeret under et omvendt mikroskop med 4x til 10x forstørrelse.
9. Plasser stimuleringskammeret i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO₂ (supplerende figur 1E). Bytt medium hver 12. time med medier forvarmet i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 20-25 minutter. Fortsett elektrisk stimulering i opptil 3 dager med media skiftet hver 12. time.

2. Kontraktil funksjonsanalyse av voksne hjertemyocytter hos rotter

1. Forvarm en gelpakke og media i en 37 °C inkubator i 30 minutter før forsøket.
2. Slå på kontraktile funksjonsplattformkomponenter som er oppført i materialtabellen og vist i tilleggsfigur 2, med spesiell oppmerksomhet til nøkkelkomponentene, som inkluderer et antivibrasjonsbord (tilleggsfigur 2A-1) med et omvendt mikroskop med et dypt rødt (590 nm) filter (tilleggsfigur 2A-2,3) og CCD-kamera (tilleggsfigur 2A-4) koblet til en CCD-kontroller (tilleggsfigur 2A-5 og Tilleggsfigur 2C-5) og integrert med en PC-datamaskin (tilleggsfigur 2B-14).
3. Monter slangen i den peristaltiske pumpen (tilleggsfigur 2A-8; Tilleggsfigur 2A-8), overfør den forvarmede gelpakken til rørholderen (tilleggsfigur 2A-9), og slå på vakuumet (tilleggsfigur 2A-11) og kraften til cellestimulatoren (tilleggsfigur 2B-13).
4. Plasser et 50 ml rør med media i den isolerte rørholderen (tilleggsfigur 2A-9) og begynn perfusjon ved ~ 0,5 ml / min gjennom det peristaltiske pumpeslangen (tilleggsfigur 2E-8).
5. Tilsett en liten mengde forvarmede medier i en liten veiebåt (~2 ml). Overfør en CS som inneholder myocytter fra stimuleringskammeret til veiebåten. Sett stimuleringskammeret tilbake til 37 °C i 5 % CO 2-inkubatoren.
6. Fjern CS fra veiebåten og tørk forsiktig av undersiden. Overfør CS til et nysmurt CS-kammer (tilleggsfigur 2A, F-10; svart pil) og tilsett forsiktig en dråpe media (~ 200 μL) på CS.
7. Plasser en platinaelektrodemontering over CS (tilleggsfigur 2F; grå pil) og legg en ny CS over toppen ved hjelp av tang. Plasser et toppfeste (tilleggsfigur 2F; hvit pil) over CS-sandwichen, og installer deretter to eller fire #0 panneskruer for å fullføre monteringen av kammeret.
8. Når mediet er til stede i hele pumpeslangen, fest slangen til forvarmeren, og koble deretter forvarmeren til CS-kammeret montert i trinn 2.7. Begynn perfusjon ved 0,5 ml / min og legg en vevstørke under kammeret for å sikre at det ikke er lekkasjer.
9. Plasser CS-kammeret i sceneadapteren. Det perfusede mediet samles i motsatt ende av kammeret med rør koblet til et vakuumsystem. Slå på varmesystemet (tilleggsfigur 2A, D-7) og juster kammeret, målet og forvarmeren i ~ 5-10 minutter for å oppnå en konstant medietemperatur på 37 ° C. Visualiser myocytter med 40x vann nedsenking mål på mikroskopet i løpet av denne likevektstiden.
10. Aktiver pacingstimulatoren (tilleggsfigur 2B-13) ved å stille spenningen til 1,5 ganger innstillingen som trengs for at 80% av stangformede celler skal trekke seg sammen, som vanligvis er 35-40 V. Still stimuleringsfrekvensen til 0,2 Hz for å optimalisere kontraktil funksjon og myocytoverlevelse.
11. Samle kontraktile forkortelser og re-forlengelse spor fra kontinuerlig perfused og tempo myocytter. For å samle forkortelsesmålinger, bruk et CCD-kamera (tilleggsfigur 2A-4) koblet til en CCD-kontroller (tilleggsfigur 2B-5, C) og en dedikert datamaskin med et I / O-kontrollerkort (tilleggsfigur 2B-14; se materialtabell). Plattformen måler sarkomerforkortelse i rottemyocytter, selv om lignende resultater oppnås fra myocyttmålinger samlet fra myocyttenes langsgående kanter (se Ecklerle et ^al.14).
12. Hvis du vil samle sarkomerforkortelsesspor, åpner du programvaren på datamaskinen, velger OK og deretter Fil > Ny. Klargjør en skjermmal ved å velge Traces > Edit User Limits > Sarcomere Length og deretter angi maksimums- og minimumsverdier, som vanligvis er mellom 2,0 μm og 1,5 μm. Kalibrer CCD-kameraet med en 0,01 mm graticule før du gjør målinger i myocytter (figur 1D).
13. Hvis du vil registrere spor etter sarkomerlengde, velger du Fil > Ny. Identifiser en kontraherende myocytt og plasser myocytten langs kameraets lengdeakse slik at striasjonsmønsteret er vertikalt (figur 1B).
14. Bruk datamusen til å plassere boksen for interesseområde (ROI) (rosa boks) over myocytten (figur 1C). Velg Samle og Start for å registrere kontraktil funksjon. Rekordforkortelse i 60 s fra hver myocytt ved lave stimuleringsfrekvenser (≤0,5 Hz).
15. Registrer sarkomerforkortelse fra 5-10 celler per CS. Utfør målinger ved 1 celle / CS hvis studier inkluderer behandling med agonister / antagonister. Forbered separate forvarmede medier og et annet, dedikert stykke perfusjonsrør lastet i en flerkanals peristaltisk pumpe og følg trinn 2.9.-2.14. for å måle effekten av legemiddel- eller nevrohormonlevering på myocytkontraktil funksjon.
16. For å måle forkorting over et frekvensområde, tempo myocytter ved hver frekvens for å oppnå steady-state forkortelse før opptak⁵. For disse studiene dobler du perfusjonshastigheten og begynner å registrere 15-20 s etter stimulering med en ny frekvens for å oppnå konsistente steady-state kontraktile responser for frekvenser i området 0,2 Hz og 2 Hz. Vanligvis registreres ikke mer enn 2 myocytter/CS for forkortelse over det gitte området av stimuleringsfrekvenser.
17. Ta opp minst 7 sammentrekninger/celler for å få pålitelige signalgjennomsnittsdata når du analyserer opptakene (se trinn 3.).

3. Dataanalyse av kontraktil funksjon i isolerte myocytter

1. Du begynner ved å velge Fil, velge en registrert sporing og deretter velge Åpne. Velg Tab 1 (venstre side) av basissporingen, og sett deretter det gule panelet øverst i sporingen til Sarc-lengde. Velg Spor og skjermmalen som er klargjort i trinn 2.12.
2. Hvis du vil klargjøre en analysemal, velger du Operasjoner, Monotone forbigående analysealternativer, TTL-hendelsesmerke i boksen Definisjon av t0, i tillegg til følgende alternativer på menyen: Grunnlinje (hvilende sarkomerlengde), Avgangshastighet i forhold til t0 (dep v), Topp (topphøyde og %topphøyde/grunnlinje eller bl%topp h), Returhastighet i forhold til tPeak (ret v), Tid til topp 50 % (TTP 50 %) ved bruk av t0, og tid til grunnlinje 50 % (TTR_{50 %}) ved bruk av tPeak. Lagre disse analysealternativene ved å velge Maler > Lagre analysemal med en identifikator. Last inn denne analysemalen før du analyserer hver sporing.
3. Hvis du vil starte dataanalysen, velger du > Gate > Add Transient > Convert from Event > Analysis Range. Sett nå tidsintervallet fra -0,01 s til 1,20 s for myocytter i tempo på 0,2 Hz (figur 2A, røde merker på den nedre delen av råsporet). Velg et kortere tidsintervall for myocytter stimulert ved høyere frekvenser.
4. Produser en sporing med signalgjennomsnitt ved å velge Operasjoner > Gjennomsnittlige hendelser. Et signalgjennomsnittsopptak vises under den opprinnelige basissporingen.
5. Velg Tab 1 i signalgjennomsnittssporingen (venstre side av skjermen), og velg deretter Merker på den øvre menyen, etterfulgt av Legg til forbigående. Velg Operations fra toppmenyen og Monotonic Transient Analysis for å vise signalgjennomsnittsverdiene for baseline sarkomerlengde, peak height, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50 % og TTR_{50 %} i skjermpanelet med signalgjennomsnitt.
6. Overfør hver sarkomere forbigående analyse til et regneark for sammensatt analyse av flere myocytter ved å velge Eksporter > monoton forbigående analyse > utklippstavlestrøm. Lim inn disse dataene i regnearket for hver sporing.
7. Hvis du vil kopiere sporingen med signalgjennomsnitt, velger du Eksporter > gjeldende sporing > utklippstavle > Alternativer og angir desimalene til 5, velger Tabulatorskilletegn og klikker OK og OK. Lim inn signalgjennomsnittssporene for hvert myocytopptak i et andre regneark.

4. Registrering av Ca²⁺ transienter i voksne hjertemyocytter hos rotter

1. Før du måler Ca 2+-transienter, må du slå på plattformkomponentene beskrevet i trinn 2.2., sammen med ytterligere fluorescensbildekomponenter (se tilleggskomponenter for Ca²⁺-avbildningsanalyse i materialtabellen; Tilleggsfigur 2A-5,6; 2B-12).
2. Forbered Fura-2AM stamløsning inneholdende 1 mM Fura-2AM pluss 0,5 M probenecid i dimetylsulfoksid (DMSO). Probenecid minimerer Fura-2AM lekkasje¹⁵.
3. Fortynn stamløsningen til 5 μM Fura-2AM og 2,5 mM probenecid i 2,5 ml media (se Materialtabell) i en brønn på en 6-brønns plate. Tilsett 2,5 ml media alene (ingen Fura-2AM) til ytterligere tre brønner i platen, dekk platen med aluminiumsfolie og forvarm mediet til 37 °C.
4. Overfør en CS-holdig myocytter fra pacingkammeret til brønnen som inneholder Fura-2AM, dekk til og returner platen til 37 ° C-inkubatoren med 5% CO₂ i 4 minutter. Monter slangen i perfusjonspumpen og perfuse med media under Fura-2AM lasteperioden, som beskrevet i trinn 2.4.
5. Slå av eller minimer romlys for å redusere fluorescensfotobleking og for å optimalisere fluorescenssignalet. Fjern 6-brønnsplaten fra inkubatoren, og vask deretter CS i 10 s i hver av de tre brønnene som inneholder media alene. Overfør CS til en liten veiebåt som inneholder forvarmede medier (ingen tilsatt Fura-2AM).
6. Monter CS på nysmurt CS-kammer etter forsiktig å ha tørket undersiden av CS. Legg forsiktig en dråpe media til CS, og monter deretter elektrodefestet over CS, etterfulgt av en andre CS og toppfestet. Bruk #0 pan-head skruer for å fullføre monteringen av cellekammeret, som beskrevet i trinn 2.6.-2.7.
7. Koble pumpeslangen fylt med media til forvarmeren, koble forvarmeren til CS-kammeret, og sett i en trinnadapter, som beskrevet i trinn 2.8. Samle mediet med vakuumrørsystemet og slå på varmesystemet (tilleggsfigur 2A, D-7) for å balansere kammeret til 37 °C, som beskrevet i trinn 2.8.-2.9.
8. Aktiver pacingstimulatoren (tilleggsfigur 2B-13) satt til 35-40 V og 0,2 Hz, som beskrevet i trinn 2.10.
9. Før du tar opp en Ca²⁺ -transient, må du slå på en liten lommelykt eller boklys montert i nærheten av tastaturet for å hjelpe deg med å se tastaturet. I tillegg registrerer fluorescensbakgrunnen i et område uten hjerte myocytter. Du starter ved å velge Fil > Start > Ny, som beskrevet i trinn 2.12.
10. Velg en avkastning, og angi én fane (eller sporingslinje, venstre side) for råteller og en annen fane for rå nevner, definert øverst i midten av hver fane. Ta opp bakgrunnen for 10-20 s. Høyreklikk musen og dra over ett sporingslinjepanel for å hente de rå signalgjennomsnittlige teller- og nevnerverdiene. Angi disse verdiene ved å velge operasjonene > konstantene, og angi råverdiene.
11. Forbered en ny skjermmal for å samle både forkortelse og Ca²⁺ transienter. For sarkomerlengde velger du Tab 1 og bruker samme prosess som beskrevet i trinn 2.13. For Ca²⁺ -bildebehandling velger du Tab 2 > Ratio (øverst i midten av fanen) > Traces > Edit User Limits for å angi minimums- og maksimumsnivåene for forholdet, som vanligvis er satt mellom 1 og 5. Bruk samme prosess for å definere teller- og nevnerområdene for fane 3 og 4 (venstre side).
12. Plasser en ROI-boks over et myocyttbilde, som beskrevet i trinn 2.14. Velg Fil > Ny > samle. Velg nå Start for å samle forkortelses- og ratiometriske Ca²⁺ -data. Ta opp ≥7 kontraksjoner/celle for signalgjennomsnittsanalyse.
13. Gjenta bakgrunnssporopptaket som er beskrevet i trinn 4.10. etter registrering av 2-4 myocytter. Vanligvis registrerer du 4-5 myocytter/CS eller færre myocytter hvis det er signifikante endringer i bakgrunnsavlesningen.

5. Dataanalyse av Ca²⁺ transienter i isolerte myocytter.

1. Åpne ønsket fil for analyse og velg Maler > Skjermmal for forkortelse pluss Ca²⁺ transienter. Velg deretter fane 1 og 2 (venstre) for å vise henholdsvis sarkomerlengde og Ca²⁺ -forhold. Velg Operasjoner > konstanter, og angi teller- og nevnerverdiene fra bakgrunnssporingen Ca²⁺ .
2. Klargjør analysemaler for forkortelse pluss Ca²⁺ forbigående data. Velg fane 1 (venstre side) og bruk samme prosess som beskrevet i trinn 3.2. for å angi sarkomerlengdeanalysemalen.
3. Velg fane 2 (venstre side), og velg Operasjoner, Monotone forbigående analysealternativer, TTL-hendelsesmerke i boksen Definisjon av t0 og følgende alternativer på menyen: Baseline (basalforhold), Avgangshastighet i forhold til t0 (dep v), Topp (topphøyde og %topphøyde/baseline eller bl%topp h), Forfallshastighet i forhold til tPeak (ret v), Tid til topp 50 % (TTP 50 %) ved bruk av t0, og tid til grunnlinje 50 % (TTR_{50 %}) ved bruk av tPeak. Lagre disse analysealternativene ved å velge Maler og Lagre analysemal ved hjelp av et nytt identifikatornavn. Last inn denne analysemalen før du analyserer hver sporing.
4. Bruk samme prosess som beskrevet i trinn 3.3.-3.6. å gjennomsnittlig signalet og deretter analysere sarkomerlengden, etterfulgt av de samme trinnene for Ca²⁺ transienter. Sett separate merker for sarkomerlengde og for Ca²⁺ transientforholdsspor.

Representative Results

Kontraktile funksjonsstudier utføres på rottemyocytter som starter dagen etter isolering (dag 2) opptil 4 dager etter isolering. Selv om myocytter kan registreres dagen etter isolasjon (dvs. dag 2), er det ofte nødvendig med lengre kulturtider etter genoverføring eller behandlinger for å endre kontraktil funksjon⁸. For myocytter dyrket i mer enn 18 timer etter isolasjon, bidrar pacingprotokollen beskrevet i avsnitt 1 til å opprettholde t-tubuli og konsistente forkortelses- og forlengelsesresultater.

En representativ del av en CS-holdig myocytter for forkortingsstudier er vist i figur 1A, sammen med en passende plassert myocytt før roi settes (figur 1B). Når en ROI er identifisert (figur 1C; rosa boks), bidrar algoritmeinformasjonen vist under myocytten også til å optimalisere myocytposisjonering før opptak. Spesielt er den lineære optiske tettheten (LOD; svart linje) en indikator for antall og avstand mellom sarkomerer, og et skarpt effektspekter i det raske Fourier-transformasjonssporet (FFT, rød linje) bidrar til å oppnå optimal justering for opptak av forkortelse og forlengelse. Gratikulemønsteret som brukes til kalibrering av sarkomerlengde (og kantdeteksjon) er vist i figur 1D. Et typisk justert opptak av forkorting av sarkomerlengde er vist i figur 2A (topppanel), sammen med signalgjennomsnittsanalysen beskrevet i avsnitt 3 (nedre panel).

Dysfunksjon oppdages ofte i myocytter når det er in vivo dysfunksjon i dyremodeller. For eksempel påvises systolisk dysfunksjon observert ved ekkokardiografi som respons på trykkoverbelastning (PO)¹³ også i myocyttforkortelsesstudier⁵. For å illustrere dataspor vises representative rå (figur 2; øvre panel) og signalgjennomsnitt (figur 2; nedre panel) spor oppnådd ved 0,2 Hz for myocytter fra humbug- (figur 2A) og PO-behandlede (figur 2B) rotter. For å teste om myocyttfunksjonen kunne reddes etter PO, ble virusmediert genoverføring på tidspunktet for myocyttisolering også brukt til å erstatte endogent hjertetroponin I (cTnI) med en fosfo-mimetisk cTnI T144D-substitusjon (T144D) i sarkomere¹⁶. Den innledende analysen viser at den PO-induserte reduksjonen i kontraktil funksjon (tabell 1, øvre panel) returnerte mot humbugnivåer i PO-myocytter 4 dager etter genoverføring av cTnIT144D (tabell 1; nedre panel).

Denne plattformen kan også brukes til å måle Ca²⁺ transienter, sammen med forkortelse i isolerte myocytter. Forkortelse og Ca 2+ ble ikke registrert etter PO fordi PO reduserer etterlevelse av rottemyocytter til laminin¹³, og en sammenlignbar modell som tidligere viste at endret Ca²⁺-håndtering utvikler seg på et lignende tidspunkt¹⁷. I stedet ble representative eksperimenter utført i Fura-2AM-lastede myocytter isolert fra 2-3 måneder gamle rotter. Et representativt registrerings- og signalgjennomsnittsspor er vist i figur 3, sammen med dataanalysen i tabell 2. For dette settet av eksperimenter ble myocytter isolert fra voksne rotter studert 4 dager etter adenoviralmediert genoverføring (mangfold av infeksjon = 100) av cTnIT144D eller villtype cTnI. Både sarkomforkorting og Ca 2⁺ transienter ble målt etter belastning av myocytter med Fura-2AM. Genoverføring av cTnIT144D forbedret maksimal forkorting og forhøyede diastoliske Ca²⁺-nivåer sammenlignet med cTnI i disse innledende studiene (tabell 2). Selv om det er behov for mer omfattende analyser, antyder de første resultatene at in vivo-erstatning med cTnIT144D kan produsere en kompleks hjertefenotype på grunn av endringer i både kontraktil funksjon og Ca²⁺-håndtering over tid.

Figur 1: Voksne voksne hjertemyocytter brukt i funksjonelle studier. (A) Representative isolerte hjertemyocytter fra en voksen rotte (skalabar = 50 μm). Pil peker på en representativ myocytt avbildet for kontraktil funksjonsanalyse. (B) Representativ myocytt med ROI (rosa) plassert på siden (skalalinje = 20 μm). (C) Representativ myocyt med avkastning (øvre panel), sarkomermønsteret for denne myocytten (nedre panel, blå; skalalinje = 20 μm) og den skarpe toppen av effektspekteret (nedre panel, rød). (D) Skjermbilde av 0,01 mm graticule for å kalibrere forkortelsesmålingene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Representative registreringer fra rottemyocytter. Et råopptak (øvre panel) og signalgjennomsnitt (nedre panel) spor registrert ved 0,2 Hz i myocytter fra (A) humbug- og (B) trykkoverbelastning (PO)-behandlede rotter. Myocytter ble isolert 18-20 uker etter operasjon, med PO produsert ved supra-renal koarktasjon¹³. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Representativ registrering og analyse av sarkomerlengde (SL) og Ca 2+ transienter fra Fura-2AM-lastede voksne hjertemyocytter. (A) Råspor for SL, Ca 2+ transientforhold (ratio), og teller- og nevnersporene som brukes til å produsere Ca²⁺ transientforholdet. (B) Et eksempel på signalgjennomsnittsspor for SL (øvre spor) og Ca²⁺ transientforhold (nedre spor). (C) Spor analyseres for sarkomerlengde (SL) og Ca²⁺ forbigående forhold ved hjelp av den monotone sporalgoritmen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rottegruppe	Humbug (n=30)	Bestilling (n=32)
Hvilende sarkomerlengde (mm; SL)	1.761 + 0.006	1.748 + 0.004
topphøyde (% av baseline)	9.003 + 0.409	6.680 + 0.552*
Topp amplitude (mm)	0.159 + 0.007	0.117 + 0.010*
Forkortingshastighet (mm/s)	-4.674 + 0.285	-4.143 + 0.335
Ny forlengingshastighet (mm/s)	3.251 + 0.223	2.706 + 0.273
Tid til topp (ms; TTP)	60 + 2	59 + 3
Tid til 50% forlengelse (ms; TTR50%)	35 + 2	37 + 3
Rottegruppe	Sham + cTnIT144D (n = 14)	PO + cTnIT144D (n = 17)
Hvilende sarkomerlengde (mm; SL)	1.768 + 0.009	1.776 + 0.004
topphøyde (% av baseline)	9.038 + 1.339	8.414 + 0.960
Topp amplitude (mm)	0.160 + 0.023	0.149 + 0.016
Forkortingshastighet (mm/s)	-5.972 + 0.711	-4.173 + 0.726
Ny forlengingshastighet (mm/s)	3.925 + 0.577	3.055 + 0.403
Tid til topp (ms; TTP)	51 + 5	59 + 2
Tid til 50% forlengelse (ms; TTR50%)	31 + 3	32 + 2

Tabell 1: Sammenligning av kontraktil funksjon i hjertemyocytter som respons på trykkoverbelastning (PO) og genoverføring. Myocyttforkortelsesresultater er fra humbug- og PO-rottehjerter 18-20 uker etter operasjon (øvre panel)^5,13 og myocytter fra humbug og PO-rotter 4 dager etter cTnIT144D genoverføring (nedre panel). Kontraktil funksjon måles 4 dager etter myocyttisolering/genoverføring i alle grupper. Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (n = antall myocytter). Hvert sett med humbug- og PO-data sammenlignes med en Student t-test, med * p < 0,05 ansett som statistisk signifikant. Toppamplituderesultater for humbug- og PO-myocytter alene ble rapportert tidligere i Ravichandran et ^al.5.

	Sarkomere lengde analyse
Genoverføringsgruppe	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=16)
Hvilende sarkomerlengde (mm; SL)	1.81 + 0.01	1.81 + 0.01
Topp amplitude (mm)	0.11 + 0.01	0.14 + 0.02*
Forkortingshastighet (mm/s)	-4.29 + 0.42	-4.67 + 0.77
Ny forlengingshastighet (mm/s)	2.92 + 0.43	3.71 + 0.64
Tid til topp (ms; TTP)	50 + 4	84 + 28
Tid til 50% forlengelse (ms; TTR50%)	37 + 4	35 + 6
	Ca2+ transient analyse
Genoverføringsgruppe	cTnI (n=21)	cTnIT144D (n=19)
Hvilende Ca2+ -forhold	0.89 + 0.02	1.04 + 0.04*
Topp Ca2+ -forhold	0.50 + 0.05	0.42 + 0.07
Ca2+ transienthastighet (D/sek)	45.24 + 5.85	40.53 + 10.95
Ca2+ forfallshastighet (D/s)	-4.91 + 0.99	-2.87 + 0.57
Tid til topp Ca2+ (ms; TTP)	34 + 2	41 + 3
Tid til 50% Ca2 + Decay (ms; TTD50%)	101 + 8	117 + 6

Tabell 2: Kontraktil funksjon og Ca²⁺ transienter i voksne rottemyocytter 4 dager etter cTnIT144D genoverføring. En analyse av kontraktil funksjon (øvre panel) og Ca²⁺ transienter (nedre panel) er vist i myocytter etter genoverføring av cTnIT144D sammenlignet med villtype cTnI. Myocytter isoleres fra 2-3 måneder gamle voksne rotter, og data er presentert som gjennomsnittlig ± SEM (n = antall myocytter). Statistiske sammenlikninger av kontraktil funksjon (venstre) og Ca²⁺ transienter (høyre) gjøres med usvekket Student t-test med signifikans satt til *p < 0,05.

Supplerende figur 1: Komponenter i pacing-systemet for myocytter belagt på lamininbelagte CS-er. (A) Tilpasset pacing kammer som inneholder platina elektroder i hvert kammer. (B) Pacing kammer med de fire første kamrene fylt med media. (C) Pacing kammer festet til banan-jack kabler, som er koblet til kammeret og (D) stimulatoren. (E) Forbindelsen mellom stimulatoren (høyre) og 37 °C inkubatoren (venstre). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Komponenter som trengs for myocytt kontraktil funksjon og/eller Ca²⁺ transiente målinger. (A) Den kontraktile funksjonsplattformen som viser hver komponent, med de nummererte elementene forklart mer detaljert i materialtabellen. Komponenter i plattformen inkluderer et antivibrasjonsbord (# 1), invertert lysfeltmikroskop (# 2,3), CCD-kamera , CCD-kontroller og xenon-strømforsyning , dobbel utslippslyskilde (# 6), temperaturregulator (# 7), peristaltisk pumpe (# 8), isolert rørholder (# ), dekselmontert perfusjonskammer (# 10) og vakuumsystem (# 11). (B) Ytterligere komponenter inkluderer fluorescensgrensesnittet (# 12), kammerstimulator (# 13) og PC-datamaskin (# 14), som forklares mer detaljert i materialtabellen. Nærbilder av nummererte elementer i panel A vises i C-F. (C) Visning av xenon-strømforsyningen (venstre) og CCD-kontrolleren (høyre). (D) Temperaturregulator. (E) Peristaltisk pumpe. (F) Visning av basen for CS perfusjonskammer (svart pil), platinaelektrodefeste (grå pil) og toppfeste (hvit pil) med #0 pan-hodeskruer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den kroniske pacingprotokollen som er skissert i trinn 1, utvider den nyttige tiden for å studere isolerte myocytter og vurdere effekten av lengre behandlinger. I vårt laboratorium ble konsistente resultater oppnådd opptil 4 dager etter isolasjon ved måling av kontraktil funksjon ved bruk av sarkomerlengde på kronisk tempo myocytter. Imidlertid forverres myocytkontraktilfunksjonen raskt ved bruk av medier eldre enn 1 uke for å tempo myocytter.

For kontraktile funksjonsstudier samles dataene ved 37 °C, som er nær kroppstemperaturen for rotter. For å optimalisere myocytt levedyktighet og oppnå konsistente spor for hver myocyt, utføres disse forsøkene med en pacingfrekvens lavere enn den fysiologiske hjertefrekvensen på ~ 5 Hz hos rotter. Disse innstillingene gir konsistente kontraktile funksjonsdata, men kammertemperatur og/eller pacingfrekvens kan justeres hvis forkortelsessporene forblir konsistente på tvers av flere CS-er som inneholder samme behandlingsgruppe av myocytter. I tillegg oppnås optimale resultater ved å velge myocytter som mangler blebs, er fullt festet til en CS, og kontrakt i begge ender av en stangformet celle. Celler festet i bare den ene enden, de med flere flekker og / eller myocytter som trekker seg sammen i bare den ene enden, er ikke ønskelige og er ofte vanskeligere å registrere på grunn av bakgrunnsbevegelse. For disse studiene er ≥20 sarkomerer inkludert i avkastningen for å oppnå en skarp effektspektrumtopp, reproduserbare hvilende sarkomerlengder og et optimalt signal / støyforhold for forkortelsessporet. En avkastning på så få som syv sarkomerer kan brukes hvis effektspektrumtoppen forblir skarp. Hvilende sarkomerlengde i isolerte rottemyocytter varierer vanligvis fra 2,00-1,80 μm. Hvis en hvilende sarkomerlengde er mindre enn 1,5 μm, er en aktiv sammentrekning ikke realistisk basert på vår forståelse av sarkomerarkitektur¹⁸ og er vanligvis et resultat av suboptimal myocyttorientering.

Måling av kontraktil funksjon med eller uten Ca²⁺ transiente målinger i intakte myocytter er en høyere gjennomstrømningsmetode som krever mindre investering i å utvikle den tekniske ekspertisen som trengs for kraftmålinger i intakte enkeltceller¹¹. Intakte myocytstudier fokuserer også utelukkende på myocyttfunksjon, uten bidrag fra andre celletyper i multicellulære preparater². Et fremvoksende område på dette feltet er utviklingen av høyere gjennomstrømningsanalyse ved samtidig å måle forkortelse og / eller Ca^{2 +} transienter i flere intakte myocytter for å akselerere screening av terapeutiske midler på mobilnivå før mer omfattende in vivo-analyse .

Kontraktil funksjon og Ca²⁺ transiente målinger er også mulig i intakte myocytter isolert fra andre gnagermodeller som mus, selv om det er noen viktige hensyn og forskjeller sammenlignet med rottemyocytter. Mus myocytter er levedyktige i kultur i 24-36 timer, men levedyktigheten reduseres gradvis i myocytter dyrket i mer enn 48 timer¹⁹. Dette avkortede dyrkningsintervallet bør vurderes ved bruk av vektorbasert genoverføring, spesielt for myofilamentproteiner som har halveringstid i dager i stedet for timer²⁰. I motsetning til rottemyocytter, er vellykket isolasjon og kultur av musemyocytter også avhengig av tilsetning av myosin ATPase-hemmere, som 2,3-butandionmonoksim eller blebbistatin, til kulturmedier¹⁹. Som et resultat er kronisk pacing ikke et levedyktig alternativ i mus myocytkulturer. En lengre likevektstid på 15-20 minutter er også nødvendig for å fjerne den funksjonelle effekten av disse myosinhemmerne på isolerte musemyocytter. Til slutt blir musemyocytter optimalt tempoet ved 0,5 Hz for å oppnå reproduserbare forkortelsesspor sammenlignet med 0,2 Hz som brukes til rottemyocytter.

I studier på PO-behandlede rotter påvises kontraktil dysfunksjon konsekvent med lavfrekvent pacing i rottemyocytter. En større frekvensavhengig reduksjon i forkortelse påvises også i myocytter etter PO sammenlignet med humbugrotter når det er in vivo kontraktil dysfunksjon ^5,13. Under en studie som brukte en rekke frekvenser, doblet pumpehastigheten for å gi tilstrekkelig media jevn tilstandsforkortelse innen 15-20 s etter endring av stimuleringsfrekvensen mellom 0,2 og 2 Hz. Rottemyocytter reagerer også på kortsiktig stimulering ved høyere frekvenser opp til 8 Hz, selv om cellens levedyktighet raskt forverres ved disse høyere frekvensene. Samlet sett har myocytt kontraktil funksjon vist seg å være en reproduserbar tilnærming for å bekrefte eller validere in vivo hjertedysfunksjon i rottemodeller, for eksempel PO- sammenlignet med humbugbehandlede rotter (tabell 1; se Kim et ^al.13). I tillegg kan denne plattformen teste om en behandling rettet mot myocytter gjenoppretter eller svekker kontraktil funksjon før den forfølger dyrere og / eller arbeidskrevende in vivo-tilnærminger. Både akutt fødsel og lengre eksponering for terapeutiske midler og / eller etter genlevering under primærkultur er mulig ved hjelp av denne tilnærmingen. For eksempel indikerer genoverføringseksperimenter for å erstatte endogen cTnI med cTnIT144D ingen signifikant endring i forkortelse av amplitude i myocytter fra humbugrotter. I motsetning til dette gjenoppretter cTnIT144D maksimal forkortelsesamplitude mot humbugverdier i myocytter fra PO-behandlede rotter (tabell 1). En iboende svakhet ved denne tilnærmingen er fraværet av den typiske belastningen som er tilstede i myocytter under in vivo-forhold. Som et resultat kan responser avvike fra belastningsavhengige funksjonelle responser, og eksempeleksperimentet indikerer at in vivo tilnærminger er nødvendige for å undersøke om cTnIT144D forbedrer hjerteytelsen under PO.

Måling av både forkorting og Ca²⁺ transienter i samme myocytt er en fordel med denne plattformen. For eksempel kan endringsretningen variere for Ca²⁺ transienter sammenlignet med kontraktil funksjon. Som vist i tabell 2 øker toppforkortelsen betydelig etter genoverføring av cTnIT144D til myocytter fra 2-3 måneder gamle rotter. Dette utfallet skiller seg fra data innhentet i eldre, humbugbehandlede myocytter (tabell 1) og kan være relatert til rotte alder⁵. Imidlertid er det nødvendig med ytterligere testing for å bevise denne tolkningen. Dataene i tabell 2 viser også at cTnIT144D ikke endrer topp Ca 2+ amplitude og i stedet har en tendens til å bremse Ca 2+ henfallshastigheten og heve hvilende Ca ²⁺. Disse funnene tyder på at cTnIT144D-uttrykk forbedrer kontraktil funksjon, mens Ca²⁺ sykkelmaskiner kompenserer for å dempe denne effekten. Disse resultatene fremhever denne tilnærmingens evne til å skille mellom endringer i kontraktil funksjon og Ca²⁺ sykling. Selv om de spesifikke resultatene som presenteres her ennå ikke er definitive, gir de en solid begrunnelse for å utvikle en genetisk dyremodell for å uttrykke myokard cTnIT144D og evaluere om uttrykket stumper dysfunksjon forårsaket av PO i fremtiden. En siste observasjon fra Ca 2⁺ forbigående data er at fluorescerende fargestoffer som Fura-2AM endrer kontraktilfunksjonens kinetikk i myocytter²¹. Selv om den relative responsen produsert av en gitt behandling eller dyremodell er sammenlignbar innen Fura-2-lastede myocytter, bør disse resultatene ikke kombineres med forkortelsesmålinger gjort i fravær av Fura-2AM. For å optimalisere bruken av Fura-2AM for Ca 2+ transientanalyse, måler laboratoriet oftest forkortelse i fravær av Fura-2AM og utfører en delmengde av eksperimenter for å måle Ca²⁺ transienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11