Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Het huidige protocol schetst methoden voor het uitvoeren van een grootschalige gravitaxis-test met Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol zorgt voor een betere detectie van gravitaxis-gedrag in vergelijking met een op platen gebaseerde test.

Abstract

Zwaartekrachtsensatie is een belangrijk en relatief onderbelicht proces. Het waarnemen van de zwaartekracht stelt dieren in staat om door hun omgeving te navigeren en vergemakkelijkt beweging. Bovendien is het zwaartekrachtgevoel, dat optreedt in het binnenoor van het zoogdier, nauw verwant aan het gehoor - dus het begrijpen van dit proces heeft implicaties voor auditief en vestibulair onderzoek. Gravitaxis-assays bestaan voor sommige modelorganismen, waaronder Drosophila. Enkele wormen zijn eerder getest op hun oriëntatievoorkeur terwijl ze zich in oplossing vestigen. Een betrouwbare en robuuste test voor Caenorhabditis gravitaxis is echter niet beschreven. Het huidige protocol schetst een procedure voor het uitvoeren van gravitaxis-assays die kunnen worden gebruikt om honderden Caenorhabditis dauers tegelijk te testen. Deze grootschalige, langeafstandstest maakt gedetailleerde gegevensverzameling mogelijk, waarbij fenotypen worden onthuld die mogelijk worden gemist op een standaard op platen gebaseerde test. Dauer-beweging langs de verticale as wordt vergeleken met horizontale bedieningselementen om ervoor te zorgen dat directionele vertekening te wijten is aan de zwaartekracht. Gravitactische voorkeur kan dan worden vergeleken tussen stammen of experimentele omstandigheden. Deze methode kan moleculaire, cellulaire en omgevingsvereisten voor gravitaxis in wormen bepalen.

Introduction

Het voelen van de zwaartekracht van de aarde is cruciaal voor de oriëntatie, beweging, coördinatie en balans van veel organismen. De moleculaire mechanismen en neurocircuits van zwaartekrachtsensatie zijn echter slecht begrepen in vergelijking met andere zintuigen. Bij dieren werkt het zwaartekrachtgevoel samen met en kan het worden weggeconcurreerd door andere stimuli om gedrag te beïnvloeden. Visuele signalen, proprioceptieve feedback en vestibulaire informatie kunnen worden geïntegreerd om een gevoel van lichaamsbewustzijn te genereren ten opzichte van de omgeving van een dier 1,2. Omgekeerd kan de gravitactische voorkeur worden gewijzigd in aanwezigheid van andere stimuli 3,4,5. Daarom is gravitactisch gedrag ideaal voor het bestuderen van zwaartekrachtsensatie en het begrijpen van de complexe sensorische integratie en besluitvorming van het zenuwstelsel.

C. elegans is een bijzonder nuttig modelorganisme voor het bestuderen van gravitaxis vanwege zijn polyfenische levenscyclus. Bij blootstelling aan stressoren tijdens de ontwikkeling, waaronder hitte, overbevolking of een gebrek aan voedsel, ontwikkelen C. elegans-larven zich tot dauers, die zeer stressbestendig zijn6. Als dauers voeren wormen kenmerkend gedrag uit, zoals nictatie, waarbij wormen op hun staart "staan" en met hun hoofd zwaaien, wat verspreiding naar betere habitats kan vergemakkelijken7. Gravitaxis-assays van C. elegans en C. japonica suggereren dat dauerlarven negatief gravitax zijn, en dat dit gedrag gemakkelijker wordt waargenomen bij dauers dan bij volwassenen 8,9. Het testen van gravitaxis in andere Caenorhabditis-stammen kan natuurlijke variatie in gravitactisch gedrag onthullen.

Mechanismen voor zwaartekrachtsensatie zijn gekarakteriseerd in Euglena, Drosophila, Ciona en verschillende andere soorten met behulp van gravitaxis-assays 3,10,11. Ondertussen leverden gravitaxisstudies in Caenorhabditis aanvankelijk gemengde resultaten op. Een studie van C. elegans oriëntatievoorkeur wees uit dat wormen zich oriënteren met hun hoofd naar beneden in oplossing, wat een positieve gravitactische voorkeur suggereert12. Ondertussen, hoewel C. japonica dauers al vroeg werden geïdentificeerd als negatief gravitactisch8, is dit gedrag pas onlangs beschreven in C. elegans9. Verschillende uitdagingen doen zich voor bij het ontwikkelen van een representatieve gravitaxis-test in wormen. Caenorhabditis stammen worden onderhouden op agar platen; om deze reden gebruiken gedragstests meestal agarplaten als onderdeel van hun experimentele ontwerp 13,14,15. De vroegst gerapporteerde gravitaxistest bij Caenorhabditis werd uitgevoerd door een plaat op zijn kant te laten staan in een hoek van 90° ten opzichte van de horizontale controleplaat8. Gravitaxis-gedrag is echter niet altijd robuust onder deze omstandigheden. Hoewel volwassen wormen in oplossing12 kunnen worden getest op oriëntatievoorkeur, kan deze richtingsvoorkeur ook contextafhankelijk zijn, wat leidt tot ander gedrag als de wormen kruipen in plaats van zwemmen. Bovendien is C. elegans gevoelig voor andere stimuli, waaronder licht en elektromagnetische velden16,17, die interfereren met hun reacties op zwaartekracht9. Daarom is een bijgewerkte gravitaxis-test die beschermt tegen andere omgevingsvariabelen belangrijk voor het ontleden van de mechanismen van dit sensorische proces.

In dit protocol wordt een test voor het observeren van Caenorhabditis gravitaxis beschreven. De opzet voor deze studie is deels gebaseerd op een methode die is ontwikkeld om neuromusculaire integriteit tebestuderen 18,19. Dauerlarven worden gekweekt en geïsoleerd met behulp van standaardprocedures20. Ze worden vervolgens geïnjecteerd in kamers gemaakt van twee serologische pipetten van 5 ml gevuld met agar. Deze kamers kunnen verticaal of horizontaal worden georiënteerd en gedurende 12-24 uur in een donkere kooi van Faraday worden geplaatst om te beschermen tegen licht en elektromagnetische velden. De locatie van elke worm in de kamers wordt geregistreerd en vergeleken met de verticale taxi's van een referentiestam zoals C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De stammen die in deze studie worden gebruikt zijn C. elegans (N2) en C. briggsae (AF16) (zie Materiaaltabel). Voor elke test werd een populatie van dauers van gemengd geslacht gebruikt.

1. Kamervoorbereiding

  1. Werk in een zuurkast. Richt de werkruimte in met een Bunsen-brander, 1-2 scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak (zie Materiaaltabel).
  2. Verzamel voor elke kamer twee serologische pipetten van 5 ml. Verwijder de katoenen plug van een pipet met een pincet. Houd een scheermesje boven de Bunsen brander tot het heet is met een tang. Gebruik het verwarmde mes om het taps toelopende uiteinde van de tweede pipet af te snijden, zodat de hele pipet een uniforme diameter heeft (figuur 1A).
  3. Werk snel, breng de twee gemodificeerde pipetuiteinden dicht bij de vlam en smelt ze enigszins. Verbind deze uiteinden door ze stevig tegen elkaar te drukken, zodat de wanden van beide pipetten continu zijn. Als er na het samenvoegen openingen zichtbaar zijn, breek deze dan uit elkaar en herhaal deze stap (figuur 1A,B).

2. De kamers vullen met agar

  1. Bereid NGM met 4% agar volgens standaard wormprocedures21. Terwijl de agar nog steeds gesmolten is, vult u elke kamer door deze aan een serologische pipettor te bevestigen en de oplossing langzaam op te trekken. Sluit de punt af met paraffinefilm voordat u de kamer uit de pipettor verwijdert. Leg de kamer plat (parallel aan het bankblad) om af te koelen.
    OPMERKING: Het bedekken van de kolf met vershoudfolie (zie Materiaaltabel) na het autoclaveren helpt voorkomen dat er bellen in de oplossing ontstaan18.
    1. Om eventuele variaties in de consistentie van de agar als gevolg van ongelijke koeling te minimaliseren, houdt u de pipettor (zie Materiaaltabel) parallel aan het tafelblad terwijl u de agar opstelt. Leg de kamers plat op het bankje en laat de agar uitharden voordat je gaat bewegen.
      OPMERKING: Het agarpercentage en de media-inhoud kunnen worden aangepast aan het experiment. 4% agar is stijver dan de concentratie van ongeveer 2% die wordt gebruikt voor het gieten van platen en voorkomt dat wormen zich door het medium in onze handen graven. Andere onderzoekers hebben echter graafgedrag van volwassen wormen waargenomen in maximaal 9% agar18,19.
  2. Verwarm na het afkoelen een inbussleutel van 3 mm (of een ander metalen gereedschap van dezelfde grootte, zie Materiaaltabel) boven een Bunsen-brander. Druk het stevig in de wand van elke kamer ongeveer 5 mm aan één kant van de middellijn, waardoor een kleine opening in het plastic ontstaat (figuur 1C). Gebruik een verwarmd mes om de katoenen en taps toelopende uiteinden van de kamer te verwijderen en sluit deze uiteinden af met paraffinefilm.
    OPMERKING: Eenmaal bereid, moet elke kamer binnen 1 dag worden gebruikt of gedurende enkele dagen op 4 °C worden gehouden. Bedek eventuele blootgestelde openingen met paraffinefilm om te voorkomen dat de agar uitdroogt.

3. Dauerlarven isoleren

  1. 10-15 dagen voorafgaand aan het experiment, snijd elke stam op 2-3 grote NGM-platen met OP50-bacteriën en wikkel met paraffinefilm. Na 10-15 dagen moet elke plaat volledig worden uitgehongerd met duizenden dauerlarven aanwezig op de agar, muren en deksels.
    OPMERKING: Maak borden van tevoren met behulp van een dik OP50-recept voor maximale drukte (zie Materiaaltabel). Dauervorming kan ook worden geïnduceerd door andere methoden, waaronder de toevoeging van feromonen of door te groeien bij hogere temperaturen22.
  2. Verzamel wormen door de deksels en platen met M9-buffer te spoelen en de oplossing in centrifugebuizen van 15 ml te pipetteren. Draai op 1.600 x g gedurende 30-60 s bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-buffer aan met een pipet of vacuümaspirator.
  3. Isoleer dauers door behandeling met 1% SDS gevolgd door een sucrose flotatiegradiënt van 30% volgens het eerder gepubliceerde rapport20.
    1. Voeg 7 ml 1% SDS-oplossing toe aan elke wormpellet. Laat de wormen 30 minuten in SDS staan; draai de buizen gedurende deze tijd continu om beluchting mogelijk te maken. Spoel 3-5x af met M9 om het wasmiddel te verwijderen.
    2. Voeg vervolgens 5 ml M9 toe, gevolgd door 5 ml koude, gefilterde 60% sucrose-oplossing. Meng grondig en centrifugeer vervolgens op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een scheidingsgradiënt te creëren.
  4. Vul nieuwe centrifugebuizen van 15 ml met 2 ml M9-buffer. Plet de uiteinden van glazen Pasteur-pipetten om de boring te verbreden en gebruik deze pipetten om de bovenste laag van de oplossing (met geïsoleerde dauers) van de sucrosegradiënt naar de nieuwe buizen over te brengen. Spoel de dauers 3-5x af met M9.
    OPMERKING: Er zullen op dit moment duizenden geïsoleerde dauers in oplossing zijn. Ze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of belucht worden gehouden door een nacht in 5-7 ml M9 te draaien.

4. Dauers toevoegen aan de kamer

  1. Centrifugeer dauers bij 1.600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-oplossing aan met een pipet of vacuümaspirator. Om de wormdichtheid te schatten, telt u handmatig het aantal wormen in drie afzonderlijke druppeltjes van 1 μL onder een ontleedmicroscoop. Gebruik het gemiddelde van deze tellingen om het aantal wormen per μL te benaderen.
    OPMERKING: Sommige pipettors met een klein volume kunnen mogelijk niet de bodem van een centrifugebuis van 15 ml bereiken; in dit geval kan een geconcentreerde druppel wormen eerst worden overgebracht naar een stuk paraffinefilm.
  2. Snijd het uiteinde van een pipetpunt van 10, 20 of 200 μL om de boring te verbreden. Stel de micropipette in op een iets groter volume dan het beoogde aspiratievolume. Zuig ongeveer 1-2 μL van de geconcentreerde wormoplossing aan (idealiter tussen 100-300 wormen) en laat een kleine hoeveelheid lucht in de punt komen.
    OPMERKING: Grote aantallen wormen (1.000+) in één kamer kunnen het bereik van afgelegde afstanden vergroten als gevolg van overbevolking9.
  3. Duw de pipetpunt voorzichtig in de agar terwijl u de micropipette indrukt. Hierdoor ontstaat een injectieplaats in de agar zonder de punt te verstoppen. Laat de wormen los in de agar. Gebruik paraffinefolie om de opening af te sluiten.

5. Uitvoeren en scoren van de test

OPMERKING: Gravitaxis kan worden getest onder verschillende omstandigheden die van invloed kunnen zijn op gedrag9.

  1. Om zoveel mogelijk variabelen te elimineren, plaatst u de kamers in een donkere kooi van Faraday (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur.
  2. Label elke kamer en hang deze verticaal in de kooi van Faraday (voer dit uit met behulp van labeling tape). Test horizontale controles gelijktijdig door sommige kamers plat te leggen binnen dezelfde omgevingsomstandigheden. Test de experimentele stammen tegen verticaal georiënteerde N2-wormen als een positieve controle. Gebruik horizontaal georiënteerde kamers met N2 dauers als extra negatieve controle.
    OPMERKING: Horizontale en verticale testen moeten in dezelfde omgeving binnen het laboratorium worden uitgevoerd om de omgevingsvariabiliteit tussen de twee omstandigheden te minimaliseren. Een grote incubator kan worden gebruikt om beide kooien van Faraday te huisvesten.
  3. Dauers beginnen zich na een paar uur van de startplaats te verspreiden en doen er enkele uren over om beide uiteinden van de kamer te bereiken. Laat de kamers gedurende deze tijd ongestoord en scoor binnen 12-24 uur na injectie.
    OPMERKING: Gebruik geen verlamd middel (zoals natriumazide) om wormen te immobiliseren die de uiteinden van de kamers hebben bereikt. Omdat de totale verspreiding van wormen wordt gemeten in plaats van een voorkeursindex (zoals in een test met twee keuzes), is natriumazide onnodig en kan het de resultaten veranderen.
  4. Verwijder en scoor gravitaxiskamers één voor één. Zoek naar levende dauers onder een ontleedmicroscoop en markeer hun locaties in inkt (figuur 1C, D). Scoor geen wormen binnen 2,5 cm aan weerszijden van de injectieplaats, omdat deze wormen waarschijnlijk geen richtingsvoorkeur vertonen.
    1. Vermijd ook het scoren van wormen die dood lijken of gevangen zitten in de vloeistof. Gooi alle kamers met >50% dode of zwemmende wormen weg.
      OPMERKING: Zodra de kamer uit het testgebied is verwijderd, moet deze onmiddellijk worden gescoord op nauwkeurigheid. Dauers mogen alleen zichtbaar zijn tussen het oppervlak van de agar en de muur van de pipet. Als graafgedrag wordt waargenomen, overweeg dan om de agarconcentratie in toekomstige testen te verhogen.
  5. Om de resultaten te kwantificeren, gebruikt u een marker om elke helft van de kamer te verdelen in zeven secties van 3,5 cm vanaf 2,5 cm afstand van de injectieplaats (op sommige pipetten 3,5 cm = 1 ml volume). Gebruik een handmatige tellingsteller (zie Tabel met materialen) om het aantal wormen te tellen dat in elke sectie is waargenomen.
    OPMERKING: Er moeten zeven secties aan elke kant van de oorsprong zijn, die kunnen worden genummerd van -7 (onder) tot +7 (boven). Deze getallen moeten overeenkomen met dezelfde relatieve locaties op basis van hoe de kamers zijn gebouwd; agar wordt getrokken van het -7-uiteinde naar het +7-einde in stap 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gravitaxis vergelijken tussen soorten
Volgens de hierboven beschreven procedure kan C. briggsae dauer gravitaxis worden vergeleken met C. elegans gravitaxis en horizontale controles. De verticale verdeling (kastanjebruin) van C. briggsae dauers is scheef naar de toppen van de kamers, waarbij een groot percentage wormen +7 bereikt (figuur 2A). In tegenstelling tot horizontale bedieningselementen (aqua), waarbij dauers in een ruwweg klokvormige curve rond het midden van de kamers worden verdeeld, duidt deze trend op negatief zwaartekrachtsgedrag. Deze gegevens kunnen worden vergeleken met C. elegans gravitaxis uitgevoerd op dezelfde experimentele dagen (figuur 2B).

Een Kruskal-Wallis-test gevolgd door Dunn's test met Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen bepaalde significante verschillen tussen assays 9,23. In dit experiment werden 1.108 C. briggsae dauers gescoord over drie verticale kamers uit twee onafhankelijke experimentele dagen. Deze wormen migreerden aanzienlijk naar boven dan horizontale controles (p < 0,001; 1.639 dauers in drie horizontale kamers gedurende 2 experimentele dagen). Bovendien verschilden de verticale C. briggsae- en verticale C. elegans-verdelingen niet (p > 0,05; 386 C. elegans dauers in twee verticale kamers gedurende 2 experimentele dagen). Deze resultaten suggereren dat C. briggsae dauers een negatief gravitaxis gedrag vertonen dat vergelijkbaar is met dat van C. elegans dauers.

Figure 1
Figuur 1: Gravitaxis assay kamer setup. Foto's met stappen van gravitaxis assay kamer voorbereiding. (A) Afzonderlijke pipetten van 5 ml werden bereid voor fusie tot één kamer. Verwijdering van katoenen plug aangegeven met zwarte pijlpunt; verwijdering van de punt aangegeven met een witte pijlpunt. De in dit onderzoek gebruikte buizen hebben een binnendiameter van 6 mm en zijn elk 34,5 cm lang (voorafgaand aan het snijden). (B) Voltooide kamer voorafgaand aan de toevoeging van NGM-agar. Pipetten zijn gesmolten door eerst over een Bunsen brander te smelten. (C) Voorbeeldkamers gevuld met NGM-agar. De injectieplaats wordt aangegeven met een pijl en vergroot in de inzet. Wormen zijn gemarkeerd met inkt en lijnen worden getrokken om afstanden samen met de kamer te onderscheiden en om het scoren te vergemakkelijken. (D) Weergave van kamers in hun geheel (genomen na scoren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Gravitaxis in C. briggsae vs. C. elegans. Resultaten van gravitaxis in C. briggsae en C. elegans. (A) Histogram van C. briggsae gravitaxis. Beweging in verticale kamers (kastanjebruin) wordt vergeleken met horizontale controles (aqua). De afstand tot het injectiepunt (-7 is het verst onder, +7 het verst boven) wordt uitgezet als het percentage van het totale aantal geteste wormen (x-as). Er worden geen gegevens uitgezet voor de oorsprong (+0) omdat wormen niet binnen 2,5 cm aan weerszijden van de injectieplaats worden geteld. N = 1.639 wormen over drie buizen in de horizontale toestand; verticale N = 1.108 wormen over drie buizen. (B) Boxplots waarin de verdeling van C. briggsae horizontale en verticale wormen wordt vergeleken met C. elegans verticale wormen. C. briggsae steekproefgroottes worden hierboven gegeven. C. elegans verticaal N = 386 wormen over twee buizen. Middelen worden aangegeven met witte diamanten; verticale omstandigheden zijn in kastanjebruin en hebben het label "V", en horizontale omstandigheden ("H") zijn in aqua. Vergelijkingen werden gemaakt met behulp van de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de Dunn's-test met Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. Geen sterren = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vergelijking met eerdere methoden
In tegenstelling tot chemotaxis kan gravitaxis bij Caenorhabditis niet betrouwbaar worden waargenomen met behulp van een traditioneel experimenteel ontwerp van de agarplaat. Een standaard petrischaal heeft een diameter van 150 mm, wat resulteert in slechts 75 mm beschikbaar in beide richtingen voor dauers om gravitaxis-voorkeur aan te tonen. Hoewel de oriëntatievoorkeur van C. elegans kan worden getest in oplossing12, is deze methode een lage doorvoer omdat wormen één voor één moeten worden geanalyseerd. Bovendien kunnen gravitactische voorkeuren en gedragingen verschillen tussen wormen die in media zweven versus kruipen op een oppervlak. Om deze redenen hebben we een high throughput assay met verbeterde gevoeligheid ontwikkeld die kan worden gebruikt om gravitaxis-gedrag bij kruipende of klimmende wormen te analyseren. Omdat C. elegans gevoelig zijn voor licht en elektromagnetische velden, die beide interfereren met gravitactische voorkeur9, moeten deze testen zonder beide stimuli worden uitgevoerd. Als een zelfgemaakte kooi van Faraday wordt gebruikt, is het noodzakelijk en aanbevolen om de sterkte van de kooi te controleren en te versterken.

De in dit protocol beschreven testkamers zijn ongeveer 54 cm lang en worden in kooien van Faraday geplaatst om af te schermen tegen licht en elektromagnetische velden. Het bleek dat het veranderen van de "arena" voor het observeren van gravitaxis-gedrag verschillende voordelen heeft. Ten eerste maakt het gedetailleerde kwantificering en beschrijvende analyse mogelijk. De relatieve afstanden afgelegd en de totale verdelingen van wormen kunnen worden verzameld en vergeleken in plaats van het aantal negatief versus positief gravitactische wormen te tellen. Ten tweede repliceert de gesloten omgeving van een met agar gevulde pipet nauwer de omstandigheden die gravitaxis in het wild kunnen bevorderen. Zoals hierboven vermeld, is de dauer-fase een verspreidingsfase die het mogelijk maakt om te ontsnappen aan ongunstige omstandigheden6. Omdat Caenorhabditis in compost leeft, waar leidende signalen zoals licht mogelijk niet beschikbaar zijn, kan de zwaartekracht wormen in staat stellen om naar het oppervlak te navigeren 6,9. Het is onwaarschijnlijk dat tweedimensionale op platen gebaseerde assays deze omstandigheden repliceren, zelfs als ze zonder andere stimuli worden getest. Ten slotte test dit grotere apparaat grotere hoeveelheden wormen in één test.

Beperkingen en andere overwegingen
Hoewel dit protocol effectief de gravitactische voorkeur meet in grote aantallen dauers, is het onpraktisch voor kleine of enkele wormexperimenten vanwege de tijd en materialen die nodig zijn om elke kamer te bouwen. Door tellingen in verschillende onderzoeken te combineren in plaats van een gravitaxis-index te gebruiken, wordt de statistische kracht verhoogd omdat elke worm als een onafhankelijke gebeurtenis wordt behandeld. Hoewel deze verhoogde gevoeligheid nuttig is bij het onderscheiden van gravitactische en niet-gravitactische wormen, is het belangrijk op te merken dat C. elegans dauers sociaal gedrag vertonen 7,24 dat de algehele gravitaxis kan beïnvloeden. We ontdekten dat hogere wormdichtheden gecorreleerd zijn met een groter bereik in de afgelegde afstand over de grootschalige test, hoewel dit effect minimaal is wanneer het totale aantal minder dan ongeveer 1.000 wormen is9. Interactie-effecten als gevolg van factoren zoals het totale aantal wormen in elke kamer moeten worden gecontroleerd bij het analyseren van de gegevens. Zoals met alle gedragstests, moet het scoren waar mogelijk worden geblindeerd.

Het vinden van een gemiddelde dichtheid van wormen in de oplossing kan de variabiliteit in het aantal wormen dat van kamer tot kamer wordt geïnjecteerd, minimaliseren. Wormen nestelen zich snel in de oplossing, dus het mengen van de wormen voor het pipetteren, hetzij door de buizen te vegen of op en neer te pipetteren met een punt met brede boring, is belangrijk. Zelfs wanneer een consistente dichtheid wordt bereikt, kan het aantal toegevoegde wormen variëren omdat wormen waarschijnlijk aan de binnenkant van de plastic pipetpunten blijven kleven. Het coaten van pipetpunten met BSA of andere oplossingen kan dit effect minimaliseren. Wormen moeten worden geïnjecteerd met zo min mogelijk oplossing; als er te veel vloeistof aan de kamer wordt toegevoegd, zullen wormen vast komen te zitten in de oplossing en zelfs kunnen drijven. Om deze reden mogen alleen levende, kruipende wormen worden gescoord en mag elke kamer met meer dan 50% dode of zwemmende wormen niet worden gebruikt. Kamers moeten één voor één uit de kooi van Faraday worden verwijderd en binnen 10-15 minuten worden gescoord voor de grootste nauwkeurigheid.

Potentiële toepassingen
Deze test kan worden gebruikt om de omgevings-, genetische en cellulaire vereisten voor gravitaxis in verschillende Caenorhabditis-stammen te testen. Tot nu toe zijn licht en elektromagnetische velden geïdentificeerd als stimuli die gravitaxis verstoren9. C. elegans is echter gevoelig voor andere stimuli, waaronder temperatuur, vluchtige en niet-vluchtige chemicaliën, textuur, vochtigheid en geluid, die hun gedrag beïnvloeden 25,26,27,28. Begrijpen hoe verschillende sensorische inputs in het zenuwstelsel worden geïntegreerd, is een uitstekende vraag in de neurowetenschappen, vooral wanneer integratie plaatsvindt op het niveau van individuele neuronen 9,29,30,31,32. Sensorische integratie is vooral belangrijk bij proprioceptie, wat zelf een integratieve modaliteit is die put uit meerdere sensorische signalen1.

Het begrijpen van zwaartekrachtsensatie bij Caenorhabditis heeft implicaties voor de menselijke gezondheid. Miljoenen mensen lijden aan vestibulaire disfunctie alleen al in de Verenigde Staten33, en veel van deze aandoeningen hebben onderliggende genetische oorzaken34,35. Om deze reden is de identificatie van genkandidaten en gerichte therapieën een actief onderzoeksgebied36. Bovendien, omdat gewervelde vestibulaire en auditieve systemen nauw met elkaar verbonden zijn ontwikkeling en evolutionair 33,36,37, zou het ophelderen van zwaartekrachtsensatie ook inzicht kunnen geven in gehoor- en gehoorstoornissen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Institutes of Health aan JHR (#R01 5R01HD081266 en #R01GM141493). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We willen Pradeep Joshi (UCSB) bedanken voor zijn redactionele inbreng. Statistische raadpleging door het UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Gedrag Nummer 183
Grootschalige Gravitaxis-test van <em>Caenorhabditis</em> Dauer-larven
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter