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Behavior

Essai gravitaire à grande échelle des larves de Caenorhabditis dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Le présent protocole décrit les méthodes permettant d’effectuer un essai gravitaire à grande échelle avec des larves de Caenorhabditis dauer. Ce protocole permet une meilleure détection du comportement de l’axe gravitationnel par rapport à un test sur plaque.

Abstract

La sensation de gravité est un processus important et relativement peu étudié. La détection de la gravité permet aux animaux de naviguer dans leur environnement et facilite les mouvements. De plus, la sensation de gravité, qui se produit dans l’oreille interne des mammifères, est étroitement liée à l’audition - ainsi, la compréhension de ce processus a des implications pour la recherche auditive et vestibulaire. Des essais gravitationnels existent pour certains organismes modèles, dont la drosophile. Les vers simples ont déjà été testés pour leur préférence d’orientation lorsqu’ils s’installent en solution. Cependant, un essai fiable et robuste pour Caenorhabditis gravitaxis n’a pas été décrit. Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer des tests gravitaires qui peuvent être utilisés pour tester des centaines de Caenorhabditis dauers à la fois. Ce test à grande échelle et à longue distance permet une collecte de données détaillées, révélant des phénotypes qui peuvent être manqués sur un essai standard sur plaque. Le mouvement de Dauer le long de l’axe vertical est comparé aux commandes horizontales pour s’assurer que la polarisation directionnelle est due à la gravité. La préférence gravitactique peut alors être comparée entre les souches ou les conditions expérimentales. Cette méthode permet de déterminer les exigences moléculaires, cellulaires et environnementales pour la gravitaxie chez les vers.

Introduction

La détection de l’attraction gravitationnelle de la Terre est cruciale pour l’orientation, le mouvement, la coordination et l’équilibre de nombreux organismes. Cependant, les mécanismes moléculaires et les neurocircuits de la sensation de gravité sont mal compris par rapport à d’autres sens. Chez les animaux, la sensation de gravité interagit avec et peut être dépassée par d’autres stimuli pour influencer le comportement. Des indices visuels, une rétroaction proprioceptive et des informations vestibulaires peuvent être intégrés pour générer un sentiment de conscience corporelle par rapport à l’environnement d’un animal 1,2. Inversement, la préférence gravitactique peut être altérée en présence d’autres stimuli 3,4,5. Par conséquent, le comportement gravitactique est idéal pour étudier la sensation de gravité et comprendre l’intégration sensorielle complexe du système nerveux et la prise de décision.

C. elegans est un organisme modèle particulièrement utile pour étudier la gravitaxie en raison de son cycle de vie polyphénique. Lorsqu’elles sont exposées à des facteurs de stress pendant le développement, notamment la chaleur, le surpeuplement ou le manque de nourriture, les larves de C. elegans se transforment en dauers, qui sont très résistants au stress6. En tant que dauers, les vers adoptent des comportements caractéristiques, tels que la nictation, dans laquelle les vers « se tiennent » sur leur queue et agitent la tête, ce qui peut faciliter la dispersion vers de meilleurs habitats7. Les essais gravitaxis de C. elegans et de C. japonica suggèrent que les larves de dauer ont un gravitax négatif, et que ce comportement est plus facilement observé chez les dauers que chez les adultes 8,9. Le test de l’axe de gravité dans d’autres souches de Caenorhabditis peut révéler une variation naturelle du comportement gravitactique.

Les mécanismes de sensation de gravité ont été caractérisés chez Euglena, Drosophila, Ciona et diverses autres espèces en utilisant les essaisde gravité 3,10,11. Pendant ce temps, les études gravitaxis à Caenorhabditis ont initialement fourni des résultats mitigés. Une étude de la préférence d’orientation de C. elegans a révélé que les vers s’orientent la tête baissée en solution, suggérant une préférence gravitactique positive12. Pendant ce temps, bien que C. japonica dauers ait été identifié très tôt comme étant négativement gravitactique8, ce comportement n’a été décrit que récemment dans C. elegans9. Plusieurs défis se posent dans le développement d’un essai de gravité représentatif chez les vers. Les souches de Caenorhabditis sont maintenues sur des plaques de gélose; Pour cette raison, les tests comportementaux utilisent généralement des plaques de gélose dans le cadre de leur conception expérimentale13,14,15. Le premier essai d’axe gravitationnel signalé chez Caenorhabditis a été réalisé en plaçant une plaque sur le côté à un angle de 90° par rapport à la plaque de contrôle horizontale8. Cependant, le comportement de l’axe gravitationnel n’est pas toujours robuste dans ces conditions. Alors que les vers adultes peuvent être testés pour la préférence d’orientation dans la solution12, cette préférence directionnelle peut également dépendre du contexte, conduisant à des comportements différents si les vers rampent plutôt que de nager. De plus, C. elegans est sensible à d’autres stimuli, y compris la lumière et les champs électromagnétiques16,17, qui interfèrent avec leurs réponses à la gravité9. Par conséquent, un test gravitaxique mis à jour qui protège contre d’autres variables environnementales est important pour disséquer les mécanismes de ce processus sensoriel.

Dans le présent protocole, un essai d’observation de l’axe gravitationnel de Caenorhabditis est décrit. La configuration de cette étude est basée en partie sur une méthode développée pour étudier l’intégrité neuromusculaire18,19. Les larves de Dauer sont cultivées et isolées selon les procédures standard20. Ils sont ensuite injectés dans des chambres fabriquées à partir de deux pipettes sérologiques de 5 ml remplies d’agar-agar. Ces chambres peuvent être orientées verticalement ou horizontalement et placées dans une cage de Faraday sombre pendant 12-24 h pour se protéger contre la lumière et les champs électromagnétiques. L’emplacement de chaque ver dans les chambres est enregistré et comparé aux taxis verticaux d’une souche de référence telle que C. elegans N2.

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Protocol

Les souches utilisées dans la présente étude sont C. elegans (N2) et C. briggsae (AF16) (voir le tableau des matériaux). Une population mixte de dauers a été utilisée pour chaque essai.

1. Préparation de la chambre

  1. Travailler dans une hotte. Configurez l’espace de travail avec un brûleur Bunsen, 1-2 lames de rasoir, des pinces, une pince à épiler et une surface de coupe en plastique (voir le tableau des matériaux).
  2. Pour chaque chambre, prélever deux pipettes sérologiques de 5 mL. Retirez le bouchon de coton d’une pipette avec une pince à épiler. Tenez une lame de rasoir sur le brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’il soit chaud à l’aide d’une pince. Utilisez la lame chauffée pour trancher l’extrémité conique de la deuxième pipette de manière à ce que la pipette entière ait un diamètre uniforme (Figure 1A).
  3. En travaillant rapidement, rapprochez les deux extrémités modifiées de la pipette de la flamme et faites-les fondre légèrement. Joignez ces extrémités en les pressant fermement ensemble, en veillant à ce que les parois des deux pipettes soient continues. Si des espaces sont visibles après l’assemblage, séparez-les et répétez cette étape (Figure 1A,B).

2. Remplir les chambres avec de la gélose

  1. Préparer NGM avec de la gélose à 4% selon les procédures standardde ver 21. Pendant que la gélose est encore fondue, remplissez chaque chambre en la fixant à un pipeteur sérologique et en aspirant lentement la solution. Scellez l’embout avec un film de paraffine avant de retirer la chambre du pipeteur. Posez la chambre à plat (parallèle à la paillasse) pour refroidir.
    NOTA: Couvrir la fiole d’une pellicule alimentaire (voir tableau des matières) après l’autoclavage aide à prévenir la formation de bulles dans la solution18.
    1. Pour minimiser les variations de consistance de la gélose dues à un refroidissement inégal, maintenez la pipette (voir le tableau des matériaux) parallèle à la paillasse pendant que vous tirez la gélose pendant que vous tirez la gélose Posez les chambres à plat sur la paillasse et laissez la gélose durcir avant de la déplacer.
      REMARQUE: Le pourcentage de gélose et le contenu multimédia peuvent être adaptés à l’expérience. La gélose à 4% est plus rigide que la concentration d’environ 2% utilisée pour le coulage des plaques et empêche les vers de s’enfouir dans le milieu dans nos mains. Cependant, d’autres expérimentateurs ont observé le comportement fouisseur des vers adultes dans jusqu’à 9% de gélose18,19.
  2. Une fois refroidi, chauffer une clé hexagonale de 3 mm (ou un autre outil métallique de la même taille, voir Tableau des matériaux) sur un brûleur Bunsen. Appuyez fermement dans la paroi de chaque chambre à environ 5 mm d’un côté de la ligne médiane, créant une petite ouverture dans le plastique (Figure 1C). Utilisez une lame chauffée pour enlever le coton et les extrémités effilées de la chambre et scellez ces extrémités avec un film de paraffine.
    NOTE: Une fois préparée, chaque chambre doit être utilisée dans un délai de 1 jour ou maintenue à 4 °C pendant plusieurs jours. Couvrez toutes les ouvertures exposées avec un film de paraffine pour empêcher la gélose de se dessécher.

3. Isoler les larves de dauer

  1. 10-15 jours avant l’expérience, couper chaque souche sur 2-3 grandes plaques NGM avec des bactéries OP50 et envelopper avec un film de paraffine. Après 10-15 jours, chaque plaque doit être complètement affamée avec des milliers de larves de dauer présentes sur l’agar-agar, les murs et les couvercles.
    REMARQUE: Faites des assiettes à l’avance en utilisant une recette épaisse OP50 pour un encombrement maximal (voir le tableau des matériaux). La formation de Dauer peut également être induite par d’autres méthodes, notamment l’ajout de phéromones ou par croissance à des températures plus élevées22.
  2. Recueillir les vers en rinçant les couvercles et les plaques avec un tampon M9 et en pipetant la solution dans des tubes à centrifuger de 15 mL. Faire tourner à 1 600 x g pendant 30-60 s à température ambiante et aspirer la majeure partie du tampon M9 avec une pipette ou un aspirateur à vide.
  3. Isoler les dauers en les traitant avec 1 % de SDS suivi d’un gradient de flottation du saccharose de 30 % suivant le rapport publié précédemment20.
    1. Ajouter 7 ml de solution de SDS à 1 % à chaque pastille de vers. Laissez les vers dans la FDS pendant 30 min; Faites tourner les tubes en continu pendant ce temps pour permettre l’aération. Rincer 3-5x avec M9 pour enlever le détergent.
    2. Ensuite, ajoutez 5 mL de M9 suivi de 5 mL de solution de saccharose froide filtrée à 60 %. Bien mélanger, puis centrifuger à 1 600 x g pendant 5 min à température ambiante pour créer un gradient de séparation.
  4. Remplir les nouveaux tubes à centrifuger de 15 ml avec 2 ml de tampon M9. Écraser les extrémités des pipettes Pasteur en verre pour élargir l’alésage et utiliser ces pipettes pour transférer la couche supérieure de la solution (contenant des baraudes isolées) du gradient de saccharose vers les nouveaux tubes. Rincer les dauers 3-5x avec M9.
    REMARQUE: Il y aura des milliers de dauers isolés en solution à ce stade. Ils peuvent être utilisés immédiatement ou maintenus aérés en alternant dans 5-7 mL M9 pendant la nuit.

4. Ajout de dauers à la chambre

  1. Centrifuger les baraudes à 1 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer la majeure partie de la solution M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Pour estimer la densité des vers, comptez manuellement le nombre de vers dans trois gouttelettes distinctes de 1 μL sous un microscope à dissection. Utilisez la moyenne de ces comptages pour estimer le nombre de vers par μL.
    REMARQUE : Certains pipetteurs de petit volume peuvent être incapables d’atteindre le fond d’un tube à centrifuger de 15 mL; Dans ce cas, une gouttelette concentrée de vers peut d’abord être transférée dans un morceau de film de paraffine.
  2. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 10, 20 ou 200 μL pour élargir l’alésage. Réglez la micropipette à un volume légèrement supérieur au volume d’aspiration prévu. Aspirez environ 1 à 2 μL de la solution de vers concentrée (idéalement entre 100 et 300 vers) et laissez une petite quantité d’air pénétrer dans la pointe.
    REMARQUE: Un grand nombre de vers (1,000+) dans une chambre peut augmenter la gamme de distances parcourues en raison de la surpopulation9.
  3. Poussez doucement l’embout de la pipette dans la gélose tout en appuyant sur la micropipette. Cela créera un site d’injection dans la gélose sans obstruer l’embout. Relâchez les vers dans l’agar-agar. Utilisez un film de paraffine pour sceller l’ouverture.

5. Exécution et notation du test

REMARQUE: La gravité peut être testée dans diverses conditions pouvant affecter le comportement9.

  1. Pour éliminer autant de variables que possible, placez les chambres dans une cage de Faraday sombre (voir Tableau des matériaux) à température ambiante.
  2. Étiquetez chaque chambre et suspendez-la verticalement dans la cage de Faraday (effectuez cette opération à l’aide de ruban adhésif). Testez simultanément les contrôles horizontaux en posant certaines chambres à plat dans les mêmes conditions environnementales. Testez les souches expérimentales contre les vers N2 orientés verticalement en tant que témoin positif. Utiliser des chambres orientées horizontalement contenant des barauers N2 comme témoin négatif supplémentaire.
    REMARQUE : Les essais horizontaux et verticaux doivent être effectués dans le même cadre au sein du laboratoire afin de minimiser la variabilité environnementale entre les deux conditions. Un grand incubateur peut être utilisé pour abriter les deux cages de Faraday.
  3. Les dauers commencent à se disperser du site de départ après quelques heures et mettent plusieurs heures à atteindre chaque extrémité de la chambre. Laissez les chambres intactes pendant ce temps et marquez dans les 12 à 24 heures suivant l’injection.
    REMARQUE: N’utilisez pas un paralytique (tel que l’azoture de sodium) pour immobiliser les vers qui ont atteint les extrémités des chambres. Étant donné que la distribution globale des vers est mesurée au lieu d’un indice de préférence (comme dans un test à deux choix), l’azoture de sodium est inutile et peut modifier les résultats.
  4. Retirez et marquez les chambres de gravité une à la fois. Recherchez les baraudes vivantes sous un microscope à dissection et marquez leur emplacement à l’encre (Figure 1C,D). Ne marquez pas les vers à moins de 2,5 cm de chaque côté du site d’injection, car il est peu probable que ces vers présentent une préférence directionnelle.
    1. Évitez également de marquer des vers qui semblent morts ou qui sont piégés dans le liquide. Jetez toutes les chambres contenant >50% de vers morts ou nageurs.
      REMARQUE: Une fois que la chambre a été retirée de la zone d’essai, elle doit être notée rapidement pour la précision. Les dauers ne doivent être visibles qu’entre la surface de l’agar et la paroi de la pipette. Si un comportement fouisseur est observé, envisager d’augmenter la concentration de gélose dans les futurs essais.
  5. Pour quantifier les résultats, utilisez un marqueur pour diviser chaque moitié de la chambre en sept sections de 3,5 cm à partir de 2,5 cm du site d’injection (sur certaines pipettes, 3,5 cm = 1 ml de volume). Utilisez un compteur de comptage manuel (voir le tableau des matières) pour compter le nombre de vers observés dans chaque section.
    NOTE: Il devrait y avoir sept sections de chaque côté de l’origine, qui peuvent être numérotées de -7 (bas) à +7 (haut). Ces nombres doivent correspondre aux mêmes emplacements relatifs en fonction de la façon dont les chambres ont été construites; La gélose est tirée de la fin -7 à la fin +7 à l’étape 2.

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Representative Results

Comparaison de la gravité entre les espèces
En suivant la procédure décrite ci-dessus, la gravitaxie de C. briggsae dauer peut être comparée à l’axe gravitationnel et aux contrôles horizontaux de C. elegans . La distribution verticale (marron) de C. briggsae dauers est inclinée vers le sommet des chambres, avec un pourcentage élevé de vers atteignant +7 (Figure 2A). Contrairement aux contrôles horizontaux (aqua), dans lesquels les dauers sont répartis dans une courbe grossièrement en forme de cloche autour du centre des chambres, cette tendance indique un comportement gravitactique négatif. Ces données peuvent être comparées à l’axe gravitationnel de C. elegans effectué les mêmes jours expérimentaux (Figure 2B).

Un test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples a déterminé toute différence significative entre les tests 9,23. Dans cette expérience, 1 108 Dauers de C. briggsae ont été notés dans trois chambres verticales au cours de deux jours d’expérimentation indépendants. Ces vers ont migré significativement vers le haut que les témoins horizontaux (p < 0,001; 1 639 dauers dans trois chambres horizontales sur 2 jours expérimentaux). De plus, les distributions verticales de C. briggsae et verticales de C. elegans ne différaient pas (p > 0,05; 386 C. elegans dauers dans deux chambres verticales sur 2 jours expérimentaux). Ces résultats suggèrent que C. briggsae dauers présente un comportement gravitationnel négatif similaire à celui de C. elegans dauers.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la chambre d’essai gravitaxie. Photos illustrant les étapes de la préparation de la chambre d’essai de gravitaxie. (A) Des pipettes individuelles de 5 mL ont été préparées pour la fusion en une seule chambre. Enlèvement du bouchon de coton indiqué par une pointe de flèche noire; Retrait de la pointe indiquée par une pointe de flèche blanche. Les tubes utilisés dans cette étude ont un diamètre intérieur de 6 mm et mesurent chacun 34,5 cm de long (avant coupe). (B) Chambre terminée avant l’ajout de gélose NGM. Les pipettes ont été fusionnées en fondant d’abord sur un brûleur Bunsen. (C) Exemples de chambres remplies de gélose NGM. Le site d’injection est indiqué par une flèche et agrandi dans l’encart. Les vers ont été marqués à l’encre et des lignes sont tracées pour distinguer les distances le long de la chambre ainsi que pour faciliter la notation. D) Vue des chambres dans leur intégralité (prise après notation). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Gravitaxis chez C. briggsae par rapport à C. elegans. Résultats de l’axe gravitationnel chez C. briggsae et C. elegans. (A) Histogramme de l’axe gravitationnel de C. briggsae. Le mouvement dans les chambres verticales (marron) est comparé aux contrôles horizontaux (aqua). La distance du point d’injection (-7 étant le plus en dessous, +7 le plus au-dessus) est représentée en pourcentage du nombre total de vers analysés (axe des abscisses). Aucune donnée n’est tracée pour l’origine (+0) car les vers ne sont pas comptés à moins de 2,5 cm de chaque côté du site d’injection. N = 1 639 vers dans trois tubes à l’état horizontal; verticale N = 1 108 vers sur trois tubes. (B) Boxplots comparant la répartition des vers horizontaux et verticaux de C. briggsae par rapport aux vers verticaux de C. elegans. La taille des échantillons de C. briggsae est indiquée ci-dessus. C. elegans vertical N = 386 vers sur deux tubes. Les moyens sont indiqués par des diamants blancs; les conditions verticales sont en marron et sont étiquetées « V », et les conditions horizontales (« H ») sont en aqua. Les comparaisons ont été faites en utilisant le test de Kruskal-Wallis, suivi du test de Dunn avec correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples. Pas d’étoiles = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Comparaison avec les méthodes antérieures
Contrairement à la chimiotaxie, la gravitaxie chez Caenorhabditis ne peut pas être observée de manière fiable à l’aide d’un plan expérimental traditionnel sur plaque d’agar. Une boîte de Petri standard mesure 150 mm de diamètre, ce qui donne seulement 75 mm disponibles dans les deux sens pour que les dauers puissent démontrer la préférence gravitaire. Bien que la préférence d’orientation de C. elegans puisse être dosée dans la solution12, cette méthode est à faible débit car les vers doivent être analysés un à la fois. En outre, les préférences et les comportements gravitactiques peuvent différer entre les vers flottant dans les milieux et rampant sur une surface. Pour ces raisons, nous avons développé un test à haut débit avec une sensibilité améliorée qui peut être utilisé pour analyser le comportement de la gravité chez les vers rampants ou grimpants. Parce que C. elegans est sensible à la lumière et aux champs électromagnétiques, qui interfèrent tous deux avec la préférence gravitactique9, ces tests doivent être effectués sans aucun stimulus. Si une cage de Faraday faite maison est utilisée, il est nécessaire et recommandé de vérifier la résistance de la cage et de la renforcer.

Les chambres d’essai décrites dans ce protocole mesurent environ 54 cm de longueur et sont placées dans des cages de Faraday pour se protéger de la lumière et des champs électromagnétiques. Il a été constaté que changer « l’arène » pour observer le comportement de la gravitaxie présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il permet une quantification détaillée et une analyse descriptive. Les distances relatives parcourues et les distributions globales des vers peuvent être recueillies et comparées au lieu de compter le nombre de vers gravitactiques négatifs par rapport aux vers gravitactiques positifs. Deuxièmement, l’environnement clos d’une pipette remplie d’agar reproduit plus fidèlement les conditions qui peuvent favoriser la gravité dans la nature. Comme indiqué plus haut, le stade dauer est une phase de dispersion qui permet de s’échapper de conditions défavorables6. Parce que Caenorhabditis vit dans le compost, où les indices de guidage tels que la lumière peuvent ne pas être disponibles, la gravité peut permettre aux vers de naviguer vers vers la surface 6,9. Il est peu probable que les tests bidimensionnels sur plaque reproduisent ces conditions, même s’ils sont testés sans autres stimuli. Enfin, cet appareil plus grand teste de plus grandes quantités de vers en un seul essai.

Limites et autres considérations
Bien que ce protocole mesure efficacement la préférence gravitactique chez un grand nombre de dauers, il n’est pas pratique pour les expériences sur des vers de petite taille ou uniques en raison du temps et des matériaux nécessaires à la construction de chaque chambre. En combinant les comptages entre les essais plutôt qu’en utilisant un indice de gravitaxie, la puissance statistique est augmentée car chaque ver est traité comme un événement indépendant. Bien que cette sensibilité accrue soit utile pour différencier les vers gravitactiques et non gravitactiques, il est important de noter que C. elegans dauers présente des comportements sociaux 7,24 qui pourraient affecter la gravitaxe gravitationnelle globale. Nous avons constaté que des densités de vers plus élevées sont corrélées à une plus grande plage de distance parcourue au cours du test à grande échelle, bien que cet effet soit minime lorsque le nombre total est inférieur à environ 1 000 vers9. Les effets d’interaction résultant de facteurs tels que le nombre total de vers dans chaque chambre doivent être surveillés lors de l’analyse des données. Comme pour tous les tests comportementaux, la notation doit être en aveugle lorsque cela est possible.

Trouver une densité moyenne de vers dans la solution peut minimiser la variabilité du nombre de vers injectés d’une chambre à l’autre. Les vers s’installent rapidement dans la solution, il est donc important de mélanger les vers avant de les pipeter, soit en agitant les tubes, soit en les pipetant de haut en bas avec une pointe de gros alésage. Même lorsqu’une densité constante est atteinte, le nombre de vers ajoutés peut varier car les vers sont susceptibles de coller à la surface intérieure des embouts de pipettes en plastique. Le revêtement des pointes de pipette avec du BSA ou d’autres solutions pourrait minimiser cet effet. Les vers doivent être injectés avec le moins de solution possible; Si trop de liquide est ajouté à la chambre, les vers seront piégés dans la solution et peuvent même dériver. Pour cette raison, seuls les vers vivants et rampants peuvent être marqués, et toute chambre contenant plus de 50% de vers morts ou nageurs ne doit pas être utilisée. Les chambres doivent être retirées de la cage de Faraday une à la fois et marquées dans les 10-15 minutes pour la plus grande précision.

Applications potentielles
Ce test peut être utilisé pour tester les exigences environnementales, génétiques et cellulaires de la gravité dans une variété de souches de Caenorhabditis. Jusqu’à présent, la lumière et les champs électromagnétiques ont été identifiés comme des stimuli qui interfèrent avec la gravitaxie9. Cependant, C. elegans est sensible à d’autres stimuli, y compris la température, les produits chimiques volatils et non volatils, la texture, l’humidité et le son, qui influencent leur comportement25,26,27,28. Comprendre comment diverses entrées sensorielles sont intégrées dans le système nerveux est une question en suspens en neurosciences, en particulier lorsque l’intégration se produit au niveau des neurones individuels 9,29,30,31,32. L’intégration sensorielle est particulièrement importante dans la proprioception, qui est elle-même une modalité intégrative qui puise dans de multiples indices sensoriels1.

Comprendre la sensation de gravité chez Caenorhabditis a des implications pour la santé humaine. Des millions de personnes souffrent de dysfonction vestibulaire rien qu’aux États-Unis33, et beaucoup de ces troubles ont des causes génétiques sous-jacentes34,35. Pour cette raison, l’identification de gènes candidats et de thérapies ciblées est un domaine de recherche actif36. De plus, étant donné que les systèmes vestibulaire et auditif des vertébrés sont étroitement liés sur le plan du développement et de l’évolution33,36,37, l’élucidation de la sensation de gravité pourrait également donner un aperçu de l’audition et des troubles auditifs.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par des subventions de recherche des National Institutes of Health à JHR (#R01 5R01HD081266 et #R01GM141493). Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous tenons à remercier Pradeep Joshi (UCSB) pour sa contribution éditoriale. Consultation statistique fournie par l’UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comportement numéro 183
Essai gravitaire à grande échelle des larves de <em>Caenorhabditis</em> dauer
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Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

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