ダウアー幼虫の大規模グラビタキシスアッセイ

Summary

本プロトコルは、 カエノラブディティス ・ダウアー幼虫を用いて大規模な重力試験を実施するための方法を概説する。このプロトコルにより、プレートベースのアッセイと比較して、グラビタキシスの挙動をより適切に検出できます。

Abstract

重力感覚は重要で比較的研究されていないプロセスです。重力を感知することで、動物は周囲をナビゲートし、動きを容易にすることができます。さらに、哺乳類の内耳で発生する重力感覚は聴覚と密接に関連しているため、このプロセスを理解することは、聴覚および前庭研究に影響を及ぼします。グラビタキシスアッセイは、 ショウジョウバエを含むいくつかのモデル生物に存在します。単一のワームは、溶液に定着する際の配向の好みについて以前にアッセイされています。ただし、 カエノラブディティス グラビタキシスの信頼性が高く堅牢なアッセイは記載されていません。.本プロトコルは、一度に数百の カエノラブディティス ダウアーを試験するために使用できるグラビタキシスアッセイを実行するための手順を概説しています。この大規模な長距離アッセイにより、詳細なデータ収集が可能になり、標準的なプレートベースのアッセイでは見逃される可能性のある表現型が明らかになります。垂直軸に沿ったダウアーの動きを水平コントロールと比較し、方向バイアスが重力によるものであることを確認します。次いで、重力選好を、菌株間または実験条件間で比較することができる。この方法は、ワームの重力症の分子、細胞、および環境要件を決定できます。

Introduction

地球の引力を感知することは、多くの生物の方向、動き、調整、およびバランスにとって非常に重要です。しかし、重力感覚の分子機構や神経回路は、他の感覚に比べてよくわかっていません。動物では、重力感覚は相互作用し、行動に影響を与えるために他の刺激と競争することができます。視覚的手がかり、固有受容感覚的フィードバック、および前庭情報を統合して、動物の周囲に対する身体意識の感覚を生成することができる^1,2。逆に、重量性嗜好は、他の刺激の存在下で変化させることができる^3、4、5。したがって、重力行動は、重力感覚を研究し、神経系の複雑な感覚統合と意思決定を理解するのに理想的です。

C. elegansは、そのポリフェニックライフサイクルのために、グラビタキシスを研究するための特に有用なモデル生物です。発育中に熱、過密、食物不足などのストレッサーにさらされると、C.エレガンスの幼虫はストレス耐性の高いダウアーに成長します⁶。ダウアーとして、ワームは、ワームが尾に「立ち」、頭を振るニクテーションなどの特徴的な行動を実行し、より良い生息地への分散を促進する可能性があります⁷。C. elegansとC. japonicaのGravitaxisアッセイは、ダウアー幼虫が負の重力を負にすることを示唆しており、この行動は成虫よりもダウアーでより容易に観察されます^8,9。他のカエノラブディティス株でグラビタキシスをテストすると、重力作用の自然な変化が明らかになる可能性があります。.

重力感覚のメカニズムは、ユーグレナ、ショウジョウバエ、シオナ、およびその他のさまざまな種で、グラビタキシスアッセイ³、^10、11を使用して特徴付けられています。一方、カエノラブディティスのグラビタキシス研究では、当初はさまざまな結果が得られました。C. elegansの配向選好に関する研究では、ワームは溶液中で頭を下にして配向し、正の重力嗜好を示唆している^{ことがわかりました12}。一方、C. japonica dauersは早い段階で負の重力8であることが確認されていました^が、この行動はC. elegans⁹で最近記述されたばかりです。ワームの代表的なグラビタキシスアッセイの開発には、いくつかの課題が生じます。カエノラブディティス株は寒天プレート上で維持されます。このため、行動アッセイは通常、実験デザインの一部として寒天プレートを使用します^13、14、15。カエノラブディティスで最も早く報告された重力試験は、水平コントロールプレート⁸に対して90°の角度でプレートを横に立てることによって実行されました。ただし、重力タクシーの挙動は、これらの条件下で常に堅牢であるとは限りません。.成虫は溶液¹²で向きの好みをアッセイできますが、この方向の好みは状況に依存する可能性があり、ワームが泳ぐのではなく這っている場合は異なる行動につながります。さらに、C.エレガンスは、重力9に対するそれらの応答を妨げる光および電磁場^16,17を含む他の刺激に敏感^である。したがって、他の環境変数から保護する最新の重力試験は、この感覚プロセスのメカニズムを分析するために重要です。

本プロトコールでは、カラビタキシスを観察するためのアッセイが記載されている。この研究のセットアップは、神経筋の完全性を研究するために開発された方法に部分的に基づいています^18,19。ダウアー幼虫を培養し、標準的な手順²⁰を用いて単離する。次に、寒天で満たされた2つの5 mL血清学的ピペットから作られたチャンバーに注入されます。これらのチャンバーは、垂直または水平に向けることができ、暗いファラデーケージ内に12〜24時間配置して、光および電磁界から遮蔽することができます。チャンバー内の各ワームの位置が記録され、C.エレガンスN2などの基準株の垂直タクシーと比較されます。

Protocol

本研究で使用した菌株は、C. エレガンス (N2)と C.ブリグサエ (AF16)です( 資料表を参照)。ダウアーの男女混合集団を各アッセイに使用した。

1. チャンバーの準備

1. ドラフトで作業します。ブンゼンバーナー、1〜2個のかみそりの刃、ペンチ、ピンセット、およびプラスチック製の切断面を使用してワークスペースをセットアップします(材料の表を参照)。
2. チャンバーごとに、5 mLの血清学的ピペットを2つ集めます。ピンセットで1つのピペットから綿プラグを取り外します。ペンチを使用して、ブンゼンバーナーにかみそりの刃を熱くなるまでかざします。加熱されたブレードを使用して、ピペット全体の直径が均一になるように、2番目のピペットのテーパー端を切り取ります(図1A)。
3. すばやく作業して、2つの修正されたピペットの端を炎に近づけ、わずかに溶かします。これらの端をしっかりと押し合わせて結合し、両方のピペットの壁が連続していることを確認します。接合後にギャップが見える場合は、それらを分解してこの手順を繰り返します(図1A、B)。

2.チャンバーに寒天を充填する

1. 標準的なワーム手順に従って4%寒天でNGMを準備し^{ます 21}.寒天がまだ溶けている間に、寒天を血清学的ピペッターに取り付け、ゆっくりと溶液を引き上げて、各チャンバーを満たします。チャンバーをピペッターから取り外す前に、チップをパラフィンフィルムで密封します。チャンバーを平ら(ベンチトップと平行)に置いて冷却します。
   注意: オートクレーブ処理後にフラスコをラップラップ( 材料の表を参照)で覆うと、溶液¹⁸に気泡が形成されるのを防ぐのに役立ちます。
   1. 不均一な冷却による寒天の粘稠度の変動を最小限に抑えるには、寒天を引き上げながらピペッター( 材料表を参照)をベンチトップと平行に保持します。チャンバーをベンチトップに平らに置き、寒天を硬化させてから移動します。
      注:寒天の割合と培地含有量は、実験に合わせて調整できます。4%寒天は、プレート注入に使用される約2%の濃度よりも硬く、ワームが手の培地に穴を掘るのを防ぎます。しかし、他の実験者は、最大9%の寒天^18,19で成虫による穴あけ行動を観察しました。
2. 冷却したら、ブンゼンバーナーで3 mmの六角レンチ(または同じサイズの別の金属工具、 材料表を参照)を加熱します。正中線の片側に約5 mmの各チャンバーの壁にしっかりと押し込み、プラスチックに小さな開口部を作ります(図1C)。加熱されたブレードを使用して、チャンバーの綿とテーパーの端を取り除き、これらの端をパラフィンフィルムで密封します。
   注:準備が完了したら、各チャンバーを1日以内に使用するか、4°Cで数日間保持する必要があります。寒天が乾燥するのを防ぐために、露出した開口部をパラフィンフィルムで覆います。

3.ダウアー幼虫の分離

1. 実験の10〜15日前に、各菌株をOP50細菌を含む2〜3個の大きなNGMプレートにチャンクし、パラフィンフィルムで包みます。10〜15日後、各プレートは完全に飢え、寒天、壁、蓋に何千ものダウアー幼虫が存在する必要があります。
   注意: 最大の混雑のために、厚いOP50レシピを使用して事前にプレートを作成してください( 材料表を参照)。ダウアー形成は、フェロモンの添加を含む他の方法によって、またはより高い温度で成長することによっても誘導することができる²²。
2. 蓋とプレートをM9バッファーですすぎ、溶液を15 mL遠沈管にピペッティングして、ワームを収集します。室温で1,600 x g で30〜60秒間スピンし、ピペットまたは真空アスピレーターでM9バッファーの大部分を吸引します。
3. 以前に発表された第20報告書に続いて、1%SDSとそれに続く³⁰%のスクロース浮遊選鉱勾配で処理することにより、ダウアーを分離します。
   1. 各ワームペレットに7 mLの1%SDS溶液を追加します。ワームをSDSに30分間放置します。この間、チューブを継続的に回転させて、通気を可能にします。洗剤を取り除くためにM9で3-5xすすぎます。
   2. 次に、5 mLのM9を加え、続いて5 mLの冷たくろ過した60%スクロース溶液を加えます。十分に混合し、1,600 x g で室温で5分間遠心分離して、分離勾配を作成します。
4. 新しい15 mL遠心チューブに2 mLのM9バッファーを充填します。ガラスパスツールピペットの端を粉砕してボアを広げ、これらのピペットを使用して溶液の最上層(単離されたダウアーを含む)をスクロース勾配から新しいチューブに移します。ダウアーをM3で5〜9回すすぎます。
   注:この時点で、溶液には何千もの孤立したダウアーがあります。それらはすぐに使用することも、5〜7mLのM9で一晩回転させて通気しておくこともできます。

4.チャンバーにダウアーを追加する

1. 室温で1,600 x g で5分間遠心分離し、ピペットまたは真空吸引器でM9溶液の大部分を吸引します。ワーム密度を推定するには、解剖顕微鏡で3つの別々の1 μL液滴中のワームの数を手動でカウントします。これらの数の平均を使用して、μLあたりのワーム数を概算します。
   注意: 一部の小容量ピペッターは、15mLの遠心分離管の底に到達できない場合があります。この場合、ワームの濃縮液滴を最初にパラフィンフィルムに移すことができます。
2. 10、20、または200 μLのピペットチップの端を切り取り、ボアを広げます。マイクロピペットを意図した吸引量よりわずかに大きい容量に設定します。約1〜2μLの濃縮ワーム溶液(理想的には100〜300ワームの間)を吸引し、少量の空気が先端に入るようにします。
   注:1つのチャンバーに多数のワーム(1,000+)があると、過密状態のために移動距離の範囲が長くなる可能性があります⁹。
3. マイクロピペットを押し下げながら、ピペットチップを寒天にそっと押し込みます。これにより、先端を詰まらせることなく寒天に注射部位が作成されます。ワームを寒天に放します。パラフィンフィルムを使用して開口部を密閉します。

5. アッセイの実行とスコアリング

注:重力運動は、行動に影響を与える可能性のあるさまざまな条件下でテストできます⁹。

1. できるだけ多くの変数を排除するには、チャンバーを室温の暗いファラデーケージ( 材料表を参照)内に置きます。
2. 各チャンバーにラベルを付け、ファラデーケージ内で垂直に吊るします(ラベリングテープを使用してこれを実行します)。同じ環境条件内でいくつかのチャンバーを平らに置くことにより、水平制御を同時にテストします。ポジティブコントロールとして、垂直方向のN2ワームに対して実験株をテストします。追加のネガティブコントロールとしてN2ダウアーを含む水平方向のチャンバーを使用してください。
   注:水平アッセイと垂直アッセイは、2つの条件間の環境変動を最小限に抑えるために、ラボ内の同じ設定で実行する必要があります。大型インキュベーターを使用して、両方のファラデーケージを収容することができます。
3. ダウアーは数時間後に開始場所から分散し始め、チャンバーの両端に到達するまでに数時間かかります。この間、チャンバーを邪魔せずに放置し、注射後12〜24時間以内にスコアを付けます。
   注意: チャンバーの端に達したワームを固定するために麻痺剤(アジ化ナトリウムなど)を使用しないでください。ワームの全体的な分布は(2選択アッセイのように)選好指数の代わりに測定されているため、アジ化ナトリウムは不要であり、結果を変える可能性があります。
4. 重力槽を一度に1つずつ取り外してスコアを付けます。解剖顕微鏡で生きたダウアーを探し、その位置をインクでマークします(図1C、D)。注射部位の両側から2.5cm以内のワームは、方向の好みを示している可能性が低いため、スコアを付けないでください。
   1. また、死んでいるように見えるワームや液体に閉じ込められているワームのスコアリングは避けてください。>50%の死んだワームまたは泳いでいるワームを含むチャンバーは廃棄してください。
      注意: チャンバーがテストエリアから取り外されたら、正確さのために迅速にスコアリングする必要があります。ダウアーは、寒天の表面とピペットの壁の間にのみ見える必要があります。穴を掘る挙動が観察された場合は、将来のアッセイで寒天濃度を上げることを検討してください。
5. 結果を定量化するには、マーカーを使用して、チャンバーの各半分を注入部位から2.5 cm離れたところから7つの3.5 cmセクションに分割します(一部のピペットでは、3.5 cm = 1 mL容量)。手動集計カウンター( 資料表を参照)を使用して、各セクションで観察されたワームの数を集計します。
   注: 原点の両側に 7 つのセクションがあり、-7 (下) から +7 (上) までの番号を付けることができます。これらの番号は、チャンバーの構築方法に基づいて同じ相対位置に対応している必要があります。寒天は、ステップ2で-7末端から+7末端まで描画されます。

Representative Results

種間の重力差の比較
上記の手順に従って、 C. briggsae dauer gravitaxisは、 C. elegans gravitaxisおよび水平コントロールと比較することができる。 C. briggsae dauersの垂直分布(あずき色)はチャンバーの上部に偏っており、ワームの大部分は+7に達します(図2A)。ダウアーがチャンバーの中心の周りにほぼ釣鐘型の曲線で分布している水平コントロール(アクア)とは対照的に、この傾向は負の重力挙動を示しています。これらのデータは、同じ実験日に実施された C.エレガンス グラビタキシスと比較することができる(図2B)。

クラスカル-ウォリス検定とそれに続く多重比較のためのボンフェローニ補正によるダンの検定により、アッセイ間の有意差が決定されました^9,23。この実験では、2つの独立した実験日から3つの垂直チャンバーで1,108個のC. briggsae dauersがスコアリングされました。これらのワームは、水平コントロールよりも有意に上向きに移動しました(p < 0.001;2実験日間で3つの水平チャンバーに1,639ダウアー)。さらに、鉛直C. briggsaeと鉛直C. elegansの分布は異ならなかった(p > 0.05;2実験日間で2つの垂直チャンバーで386 C. elegansダウアー)。これらの結果から,C. briggsae dauersはC. elegans dauersと同様の負の重力作用を示すことが示唆された。

図1:グラビタキシスアッセイチャンバーのセットアップ。 グラビタキシスアッセイチャンバー調製のステップを示す写真。(A)個々の5mLピペットを単一チャンバーへの融合用に調製した。黒い矢印で示された綿プラグの取り外し。先端の除去は白い矢印で示されています。本研究で使用したチューブの内径は6mmで、長さはそれぞれ34.5cm(切断前)です。(B)NGM寒天培地を添加する前にチャンバーを完成させた。ピペットは、最初にブンゼンバーナーで溶かすことによって融合されています。(C)NGM寒天培地を充填したチャンバーの例。注射部位は矢印で示され、挿入図で拡大されます。ワームはインクでマークされており、チャンバーとともに距離を区別し、スコアリングを容易にするために線が引かれています。(D)チャンバー全体のビュー(スコアリング後に撮影)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:C. briggsae vs. C. elegansの重力タキシス。C. briggsaeとC. elegansにおける重力作用の結果。(A)C. briggsae gravitaxisのヒストグラム。垂直チャンバー(あずき色)での動きは、水平コントロール(アクア)と比較されます。注入ポイントからの距離(-7が最も下、+7が最も上)は、アッセイされたワーム全体の割合(x軸)としてプロットされます。原点(+0)のデータはプロットされず、ワームは注射部位の両側から2.5cm以内にカウントされないため、プロットされません。N = 水平状態で3本のチューブにまたがる1,639匹のワーム。垂直N = 3つのチューブにまたがる1,108ワーム。(B)C. briggsaeの水平および垂直ワームとC.エレガンス垂直ワームの分布を比較した箱ひげ図。C. briggsae サンプルサイズは上記のとおりです。C.エレガンス垂直N = 2つのチューブにまたがる386ワーム。手段は白いひし形で示されています。垂直条件は栗色で「V」とラベル付けされ、水平条件(「H」)は水色です。クラスカル-ウォリス検定を用いて比較を行い、続いてダン検定とボンフェローニ補正を用いて多重比較を行った。星なし = p > 0.05, **** = p < 0.0001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

従来工法との比較
走化性とは異なり、 カエノラブディティス のグラビタキシスは、従来の寒天プレート実験デザインを使用して確実に観察することはできません。標準的なペトリ皿は直径150mmで、ダウアーが重力の好みを示すためにどちらの方向にも75mmしか利用できません。 C. elegansの 配向選好は溶液¹²でアッセイできますが、この方法はワームを一度に1つずつ分析する必要があるため、スループットが低くなります。さらに、重力の好みや行動は、培地に浮かぶワームと表面を這うワームで異なる場合があります。これらの理由から、クロールまたはクライミングワームのグラビタキシス行動を分析するために使用できる、感度を高めたハイスループットアッセイを開発しました。 C.エレガンスは 光と電磁場に敏感であり、どちらも重力嗜好を妨害するため⁹、これらのアッセイはどちらの刺激もせずに実行する必要があります。自家製のファラデーケージを使用している場合は、ケージの強度を確認して補強する必要があり、お勧めします。

このプロトコルに記載されているアッセイチャンバーの長さは約54cmで、光や電磁界から保護するためにファラデーケージ内に配置されています。重力走の行動を観察するための「アリーナ」を変更することには、いくつかの利点があることがわかりました。まず、詳細な定量化と記述分析が可能になります。移動した相対距離、およびワームの全体的な分布を収集して比較し、負の重力ワームと正の重力ワームの数をカウントする代わりに比較できます。第二に、寒天充填ピペットの密閉された環境は、野生の重力症を促進する可能性のある条件をより厳密に再現します。上記のように、ダウアーステージは、好ましくない条件からの脱出を可能にする分散段階^です6。Caenorhabditisは、光などのガイドキューが利用できない可能性のある堆肥に住んでいるため、重力により、ワームが表面に移動できる可能性があります^6,9。2次元プレートベースのアッセイは、他の刺激なしでテストされたとしても、これらの状態を再現する可能性は低いです。最後に、この大型装置は、1回のアッセイで大量のワームをテストします。

制限事項とその他の考慮事項
このプロトコルは、多数のダウアーの重力嗜好を効果的に測定しますが、各チャンバーの構築に必要な時間と材料のために、小規模または単一のワーム実験には実用的ではありません。重力上昇指数を使用するのではなく、試験間でカウントを組み合わせることで、各ワームが独立したイベントとして扱われるため、統計的検出力が高まります。この強化された感度は、重力線虫と非重力線虫を区別するのに役立ちますが、 C.エレガンスダウアーは社会的行動^{を示す 7,24} それは全体的な重力に影響を与える可能性があります。我々は、より高いワーム密度は、大規模なアッセイ上の移動距離のより広い範囲と相関しているが、この影響は、総数が約1,000ワーム未満である場合に最小であることがわかった⁹。データを分析する際には、各チャンバー内のワームの総数などの要因に起因する相互作用効果を監視する必要があります。すべての行動アッセイと同様に、スコアリングは可能な場合は盲検化する必要があります。

溶液中のワームの平均密度を見つけることで、チャンバーからチャンバーに注入されるワームの数の変動を最小限に抑えることができます。ワームはすぐに溶液に定着するため、ピペッティングする前に、チューブをフリックするか、ワイドボアチップで上下にピペッティングして、ワームを混合することが重要です。一定の密度を達成した場合でも、プラスチックピペットチップの内面にワームが付着する可能性があるため、追加されるワームの数は異なる場合があります。ピペットチップをBSAまたは他の溶液でコーティングすると、この影響を最小限に抑えることができます。ワームはできるだけ少ない溶液を注入する必要があります。チャンバーに大量の液体を追加すると、ワームが溶液に閉じ込められ、ドリフトすることさえあります。このため、生きているクロールワームのみをスコアリングすることができ、50%を超える死んだワームまたは泳いでいるワームを含むチャンバーは使用しないでください。チャンバーは一度に1つずつファラデーケージから取り外し、最高の精度を得るために10〜15分以内にスコアを付けます。

適用例
このアッセイは、さまざまなカエノラブディティス株のグラビタキシスの環境的、遺伝的、および細胞的要件をテストするために使用できます。これまでのところ、光と電磁場は重力作用を妨害する刺激として特定されています⁹。しかし、C.エレガンスは、温度、揮発性および不揮発性の化学物質、テクスチャ、湿度、および音を含む他の刺激に敏感であり、それらはそれらの行動に影響を与えます^25,26,27,28。さまざまな感覚入力が神経系内でどのように統合されるかを理解することは、特に統合が個々のニューロン⁹、²⁹、^30、31、³²のレベルで発生する場合^、神経科学における未解決の問題です。感覚統合は固有受容感覚において特に重要であり、それ自体が複数の感覚的手がかりから引き出される統合モダリティである¹。

カエノラブディティスの重力感覚を理解することは、人間の健康に影響を及ぼします。米国だけで何百万人もの個人が前庭機能障害に苦しんでおり³³、これらの障害の多くは根本的な遺伝的原因を持っています^34,35。このため、遺伝子候補と標的療法の同定は活発な研究分野です³⁶。さらに、脊椎動物の前庭系と聴覚系は発達的および進化的に密接に関連しているため^33,36,37、重力感覚の解明は、聴覚および聴覚障害の洞察も提供できる可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers