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Behavior

Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.

Abstract

A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição - assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.

Introduction

Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal 1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alterada na presença de outros estímulos 3,4,5. Portanto, o comportamento gravitactic é ideal para estudar a sensação da gravidade e entender a complexa integração sensorial e a tomada de decisões do sistema nervoso.

C. elegans é um organismo modelo especialmente útil para estudar gravitaxis devido ao seu ciclo de vida polifenóico. Quando expostas a estressores durante o desenvolvimento, incluindo calor, superlotação ou falta de alimentos, as larvas C. elegans se desenvolvem em dauers, que são altamente resistentes ao estresse6. Como dauers, os vermes realizam comportamentos característicos, como a nictação, em que os vermes "ficam" em suas caudas e acenam com a cabeça, o que pode facilitar a dispersão para melhores habitats7. Ensaios gravitaxis de C. elegans e C. japonica sugerem que larvas dauer negativamente gravitax, e que este comportamento é mais facilmente observado em dauers do que em adultos 8,9. Testar gravitaxis em outras cepas de Caenorhabditis pode revelar variação natural no comportamento gravitacático.

Mecanismos para a sensação gravitacional têm sido caracterizados em Euglena, Drosophila, Ciona, e várias outras espécies usando ensaios gravitaxis 3,10,11. Enquanto isso, estudos de gravitaxis em Caenorhabditis inicialmente forneceram resultados mistos. Um estudo da preferência orientacional de C. elegans descobriu que os vermes orientam com a cabeça para baixo em solução, sugerindo preferência gravitactica positiva12. Enquanto isso, embora os dauers C. japonica tenham sido identificados no início como sendo negativamente gravitactic8, este comportamento só foi recentemente descrito em C. elegans9. Vários desafios surgem no desenvolvimento de um ensaio representativo de gravitaxis em vermes. As cepas de caenorhabditis são mantidas em placas de ágar; por essa razão, ensaios comportamentais normalmente usam placas de ágar como parte de seu projeto experimental 13,14,15. O ensaio gravitaxis mais antigo relatado em Caenorhabditis foi realizado de pé uma placa ao seu lado em um ângulo de 90° para a placa de controle horizontal8. No entanto, o comportamento gravitaxis nem sempre é robusto nessas condições. Embora os vermes adultos possam ser avaliados para preferência orientacional na solução12, essa preferência direcional também pode ser dependente do contexto, levando a diferentes comportamentos se os vermes estiverem engatinhando em vez de nadar. Além disso, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo campos leves e eletromagnéticos16,17, que interferem com suas respostas à gravidade9. Portanto, um ensaio gravitaxis atualizado que protege contra outras variáveis ambientais é importante para dissecar os mecanismos desse processo sensorial.

No presente protocolo, é descrito um ensaio para observar caenorhabditis gravitaxis. A configuração deste estudo baseia-se, em parte, em um método desenvolvido para estudar a integridade neuromuscular18,19. As larvas dauer são cultivadas e isoladas usando procedimentos padrão20. Eles são então injetados em câmaras feitas de duas pipetas sorológicas de 5 mL cheias de ágar. Estas câmaras podem ser orientadas vertical ou horizontalmente e colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday por 12-24 h para proteger contra campos claros e eletromagnéticos. A localização de cada verme nas câmaras é registrada e comparada com os táxis verticais de uma cepa de referência como C. elegans N2.

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Protocol

As cepas utilizadas no presente estudo são C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (ver Tabela de Materiais). Uma população de dauers de sexo misto foi usada para cada ensaio.

1. Preparação da câmara

  1. Trabalhe em um capuz de fumaça. Configure o espaço de trabalho com um queimador Bunsen, 1-2 lâminas de barbear, alicates, pinças e uma superfície de corte de plástico (ver Tabela de Materiais).
  2. Para cada câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mL. Remova o plugue de algodão de uma pipeta com pinça. Segure uma lâmina de barbear sobre o queimador Bunsen até ficar quente usando alicate. Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro uniforme (Figura 1A).
  3. Trabalhando rapidamente, aproxime as duas extremidades modificadas da tubulação perto da chama, derretendo-as ligeiramente. Junte essas extremidades pressionando-as firmemente, garantindo que as paredes de ambas as pipetas sejam contínuas. Se alguma lacuna for visível após a adesão, separe-as e repita esta etapa (Figura 1A,B).

2. Enchendo as câmaras com ágar

  1. Prepare o NGM com 4% de ágar de acordo com os procedimentos padrão de vermes21. Enquanto o ágar ainda estiver derretido, encha cada câmara anexando-a a um pipettor sorológico e elaborando lentamente a solução. Sele a ponta com filme de parafina antes de remover a câmara do pipettor. Coloque a câmara plana (paralela à bancada) para esfriar.
    NOTA: Cobrir o frasco com envoltório (ver Tabela de Materiais) após a autoclavagem ajuda a evitar que bolhas se formem na solução18.
    1. Para minimizar quaisquer variações na consistência do ágar devido ao resfriamento irregular, segure o pipettor (ver Tabela de Materiais) paralelo à bancada enquanto elabora o ágar. Coloque as câmaras planas no banco e deixe o ágar endurecer antes de se mover.
      NOTA: A porcentagem de ágar e o conteúdo de mídia podem ser adaptados ao experimento. 4% de ágar é mais rígido do que a concentração de cerca de 2% usada para derramamento de placas e impede que os vermes enterrem através do meio em nossas mãos. No entanto, outros experimentadores observaram o comportamento de escavação por vermes adultos em até 9% deágar 18,19.
  2. Uma vez resfriado, aqueça uma chave hex (ou outra ferramenta metálica do mesmo tamanho, veja Tabela de Materiais) sobre um queimador bunsen. Pressione-o firmemente na parede de cada câmara cerca de 5 mm para um lado da linha média, criando uma pequena abertura no plástico (Figura 1C). Use uma lâmina aquecida para remover o algodão e extremidades afiladas da câmara e selar estas extremidades com filme de parafina.
    NOTA: Uma vez preparada, cada câmara deve ser usada dentro de 1 dia ou mantida a 4 °C por vários dias. Cubra todas as aberturas expostas com filme de parafina para evitar que o ágar seque.

3. Isolating dauer larvas

  1. 10-15 dias antes do experimento, embrulhe cada cepa em 2-3 placas grandes de NGM com bactérias OP50 e enrole com filme de parafina. Após 10-15 dias, cada prato deve estar totalmente faminto com milhares de larvas dauer presentes no ágar, paredes e tampas.
    NOTA: Faça placas com antecedência usando uma receita OP50 grossa para lotação máxima (ver Tabela de Materiais). A formação de dauer também pode ser induzida através de outros métodos, incluindo a adição de feromônios ou crescendo a temperaturas mais altas22.
  2. Colete vermes enxaguando as tampas e placas com tampão M9 e canalizando a solução em tubos de centrífugas de 15 mL. Gire a 1.600 x g para 30-60 s em temperatura ambiente e aspire a maior parte do tampão M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo.
  3. Isolador dauers por tratamento com 1% de SDS seguido de um gradiente de flutuação de sacarose de 30% após o relatório publicado anteriormente20.
    1. Adicione 7 mL 1% de solução SDS a cada pelota de worm. Deixe os vermes na SDS por 30 minutos; gire os tubos continuamente durante este tempo para permitir a aeração. Enxágüe 3-5x com M9 para remover o detergente.
    2. Em seguida, adicione 5 mL M9 seguido por 5 mL de solução fria e filtrada de 60% de sacarose. Misture bem e, em seguida, centrífuga a 1.600 x g por 5 min a temperatura ambiente para criar um gradiente de separação.
  4. Encha novos tubos de centrífugas de 15 mL com 2 mL de tampão M9. Esmague as extremidades das pipetas pasteur de vidro para ampliar o furo e use essas pipetas para transferir a camada superior da solução (contendo dauers isolados) do gradiente de sacarose para os novos tubos. Enxágüe os dauers 3-5x com M9.
    NOTA: Haverá milhares de dauers isolados em solução neste momento. Eles podem ser usados imediatamente ou mantidos arejados girando em 5-7 mL M9 durante a noite.

4. Adicionando dauers à câmara

  1. Dauers centrífugas a 1.600 x g por 5 min à temperatura ambiente e aspiram a maior parte da solução M9 com um aspirador de pipeta ou vácuo. Para estimar a densidade dos vermes, conte manualmente o número de vermes em três gotículas separadas de 1 μL sob um microscópio dissecado. Use a média dessas contagens para aproximar o número de vermes por μL.
    NOTA: Alguns pipettores de pequeno volume podem ser incapazes de atingir o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL; neste caso, uma gota concentrada de vermes pode ser transferida primeiro para um pedaço de filme de parafina.
  2. Corte a ponta de pipeta de 10, 20 ou 200 μL para ampliar o furo. Ajuste a micropipette em um volume ligeiramente maior do que o volume de aspiração pretendido. Aspire aproximadamente 1-2 μL da solução concentrada de vermes (idealmente entre 100-300 worms) e permita que uma pequena quantidade de ar entre na ponta.
    NOTA: Um grande número de vermes (mais de 1.000) em uma câmara pode aumentar a faixa de distâncias percorrida devido à superlotação9.
  3. Empurre suavemente a ponta da pipeta para dentro do ágar enquanto deprimi a micropipette. Isso criará um site de injeção no ágar sem entupir a ponta. Solte os vermes no ágar. Use filme de parafina para selar a abertura.

5. Correr e marcar o ensaio

NOTA: A gravitaxis pode ser testada em várias condições que podem afetar o comportamento9.

  1. Para eliminar o maior número possível de variáveis, coloque as câmaras dentro de uma gaiola escura de Faraday (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.
  2. Rotule cada câmara e pendure-a verticalmente dentro da gaiola de Faraday (execute isso usando fita de rotulagem). Teste controles horizontais simultaneamente colocando algumas câmaras planas dentro das mesmas condições ambientais. Teste as cepas experimentais contra vermes N2 verticalmente orientados como um controle positivo. Use câmaras orientadas horizontalmente contendo dauers N2 como um controle negativo adicional.
    NOTA: Os ensaios horizontais e verticais devem ser realizados no mesmo ambiente dentro do laboratório para minimizar a variabilidade ambiental entre as duas condições. Uma grande incubadora pode ser usada para abrigar ambas as gaiolas de Faraday.
  3. Dauers começam a se dispersar do local de partida após algumas horas e levam várias horas para chegar a ambos os lados da câmara. Deixe as câmaras intactas durante este tempo e marque dentro de 12-24 h após a injeção.
    NOTA: Não use um paralítico (como o azida de sódio) para imobilizar vermes que chegaram às extremidades das câmaras. Como a distribuição geral de vermes está sendo medida em vez de um índice de preferência (como em um ensaio de duas escolhas), o azida de sódio é desnecessário e pode alterar os resultados.
  4. Remova e marque câmaras gravitaxis uma de cada vez. Procure por dauers vivos sob um microscópio dissecando e marque suas localizações em tinta (Figura 1C,D). Não marque vermes dentro de 2,5 cm para ambos os lados do local da injeção, pois esses vermes não estão demonstrando uma preferência direcional.
    1. Além disso, evite marcar vermes que pareçam mortos ou estão presos no líquido. Descarte quaisquer câmaras contendo >50% de vermes mortos ou nadando.
      NOTA: Uma vez que a câmara tenha sido removida da área de teste, ela precisa ser pontuada prontamente para precisão. Dauers só devem ser visíveis entre a superfície do ágar e a parede da pipeta. Se o comportamento de escavação for observado, considere aumentar a concentração de ágar em ensaios futuros.
  5. Para quantificar os resultados, use um marcador para dividir cada metade da câmara em sete seções de 3,5 cm a partir de 2,5 cm do local da injeção (em algumas pipetas, 3,5 cm = 1 mL de volume). Use um contador de contagem manual (ver Tabela de Materiais) para contabilizar o número de worms observados em cada seção.
    NOTA: Deve haver sete seções em cada lado da origem, que podem ser numeradas de -7 (inferior) a +7 (superior). Esses números devem corresponder aos mesmos locais relativos com base na forma como as câmaras foram construídas; ágar é desenhado do -7 final para o +7 final na etapa 2.

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Representative Results

Comparando gravitaxis entre espécies
Seguindo o procedimento descrito acima, C. briggsae dauer gravitaxis pode ser comparado com C. elegans gravitaxis e controles horizontais. A distribuição vertical (marrom) de dauers C. briggsae é inclinada em direção ao topo das câmaras, com uma grande porcentagem de vermes atingindo +7 (Figura 2A). Contrastada com controles horizontais (aqua), em que os dauers são distribuídos em uma curva em forma de sino ao redor do centro das câmaras, essa tendência indica comportamento gravitativo negativo. Esses dados podem ser comparados com C. elegans gravitaxis realizados nos mesmos dias experimentais (Figura 2B).

Um teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn com correção de Bonferroni para múltiplas comparações determinou diferenças significativas entre os ensaios 9,23. Neste experimento, 1.108 dauers C. briggsae foram pontuados em três câmaras verticais de dois dias experimentais independentes. Esses vermes migraram significativamente para cima do que os controles horizontais (p < 0,001; 1.639 dauers em três câmaras horizontais ao longo de 2 dias experimentais). Além disso, as distribuições verticais C. briggsae e vertical C. elegans não diferem (p > 0,05; 386 C. elegans dauers em duas câmaras verticais ao longo de 2 dias experimentais). Esses resultados sugerem que os dauers de C. briggsae mostram um comportamento gravitaxis negativo semelhante ao de C. elegans dauers.

Figure 1
Figura 1: Configuração da câmara de ensaio gravitaxis. Fotos que retratam passos de preparação de câmara de ensaio gravitaxis. (A) As pipetas individuais de 5 mL foram preparadas para fusão em uma única câmara. Remoção de tampão de algodão indicado com ponta de flecha preta; remoção de ponta indicada com uma ponta de flecha branca. Os tubos utilizados neste estudo têm um diâmetro interno de 6 mm e têm cada um 34,5 cm de comprimento (antes do corte). (B) Câmara concluída antes da adição do Ágar NGM. As pipetas foram fundidas pela primeira vez derretendo sobre um queimador Bunsen. (C) Câmaras de exemplo cheias de ágar NGM. O local da injeção é indicado com uma seta e aumentado no início. Os vermes foram marcados em tinta, e as linhas são desenhadas para distinguir distâncias junto com a câmara, bem como para facilitar a pontuação. (D) Ver as câmaras em sua totalidade (tomadas após a pontuação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gravitaxis em C. briggsae vs. C. elegans. Resultados de gravitaxis em C. briggsae e C. elegans. (A) Histograma de C. briggsae gravitaxis. O movimento nas câmaras verticais (marrom) é comparado com os controles horizontais (aqua). A distância do ponto de injeção (-7 sendo o mais distante abaixo, +7 mais distante acima) é traçada como a porcentagem do total de vermes avaliados (x-eixo). Nenhum dado é traçado para a origem (+0) pois os worms não são contados dentro de 2,5 cm para ambos os lados do local da injeção. N = 1.639 vermes em três tubos na condição horizontal; N vertical = 1.108 vermes em três tubos. (B) Boxplots comparando a distribuição de vermes horizontais e verticais C. briggsae versus vermes verticais C. elegans . C. briggsae tamanhos amostrais são dados acima. C. elegans vertical N = 386 vermes em dois tubos. Os meios são indicados com diamantes brancos; as condições verticais estão em marrom e são rotuladas como "V", e as condições horizontais ("H") estão em aqua. Comparações foram feitas utilizando-se o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn com correção de Bonferroni para múltiplas comparações. Sem estrelas = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Comparação com métodos anteriores
Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução12, este método é de baixa produtividade, pois os vermes devem ser analisados um de cada vez. Além disso, preferências e comportamentos gravitacticos podem diferir entre vermes flutuando na mídia versus rastejando em uma superfície. Por essas razões, desenvolvemos um ensaio de alto rendimento com sensibilidade aprimorada que pode ser usado para analisar o comportamento gravitaxis em vermes rastejantes ou escaladores. Como os C. elegans são sensíveis aos campos leves e eletromagnéticos, ambos interferem na preferência gravitactica9, esses ensaios precisam ser realizados sem nenhum estímulo. Se uma gaiola faraday caseira estiver sendo usada, verificar a força da gaiola e reforçá-la são necessárias e recomendadas.

As câmaras de ensaio descritas neste protocolo medem aproximadamente 54 cm de comprimento e são colocadas dentro de gaiolas faraday para proteger contra campos leves e eletromagnéticos. Verificou-se que mudar a "arena" para observar o comportamento gravitaxis tem várias vantagens. Primeiro, permite quantificação detalhada e análise descritiva. As distâncias relativas percorridas, e distribuições gerais de vermes podem ser coletadas e comparadas em vez de contar o número de vermes negativamente versus positivamente gravitativos. Em segundo lugar, o ambiente fechado de uma pipeta cheia de ágar replica mais de perto as condições que podem promover gravitaxis na natureza. Como dito acima, o estágio dauer é uma fase de dispersão que permite escapar de condições desfavoráveis6. Como a Caenorhabditis vive em composto, onde pistas orientantes como a luz podem não estar disponíveis, a gravidade pode permitir que os vermes naveguem até a superfície 6,9. Ensaios bidimensionais baseados em placas são improváveis de replicar essas condições mesmo que sejam testados sem outros estímulos. Finalmente, este aparelho maior testa grandes quantidades de vermes em um único ensaio.

Limitações e outras considerações
Embora este protocolo efetivamente mede a preferência gravitactic em um grande número de dauers, é impraticável para pequenos ou únicos experimentos de vermes devido ao tempo e materiais necessários para construir cada câmara. Combinando contagens entre os ensaios em vez de usar um índice de gravitaxis, o poder estatístico é aumentado porque cada verme é tratado como um evento independente. Embora essa sensibilidade aprimorada seja útil na diferenciação de vermes gravitacticos e não-gravitacionais, é importante notar que os dauers C. elegans exibem comportamentos sociais 7,24 que poderiam afetar a gravitaxis globais. Descobrimos que densidades de vermes mais altas estão correlacionadas com uma maior faixa na distância percorrida sobre o ensaio em larga escala, embora este efeito seja mínimo quando a contagem total é inferior a aproximadamente 1.000 vermes9. Os efeitos de interação resultantes de fatores como o total de vermes em cada câmara devem ser monitorados ao analisar os dados. Como em todos os ensaios comportamentais, a pontuação deve ser cegada quando possível.

Encontrar uma densidade média de vermes na solução pode minimizar a variabilidade no número de vermes injetados de câmara em câmara. Os vermes rapidamente se acomodam na solução, por isso é importante misturar os vermes antes de pipetar, seja apertando os tubos ou pipetting para cima e para baixo com uma ponta de furo largo é importante. Mesmo quando uma densidade consistente é alcançada, o número de vermes adicionados pode variar porque os vermes provavelmente grudam na superfície interna das pontas de pipeta de plástico. Dicas de pipeta de revestimento com BSA ou outras soluções podem minimizar esse efeito. Os vermes devem ser injetados com o mínimo de solução possível; se muito líquido for adicionado à câmara, os vermes ficarão presos na solução e podem até à deriva. Por esta razão, apenas vermes vivos e rastejantes podem ser pontuados, e qualquer câmara contendo mais de 50% de vermes mortos ou nadando não deve ser usada. As câmaras devem ser removidas da jaula de Faraday uma de cada vez e pontuadas dentro de 10-15 minutos para a maior precisão.

Aplicações potenciais
Este ensaio pode ser usado para testar os requisitos ambientais, genéticos e celulares para gravitaxis em uma variedade de cepas de Caenorhabditis. Até agora, campos leves e eletromagnéticos foram identificados como estímulos que interferem com a gravitaxis9. No entanto, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo temperatura, produtos químicos voláteis e não voláteis, textura, umidade e som, que influenciam seu comportamento 25,26,27,28. Entender como várias entradas sensoriais são integradas dentro do sistema nervoso é uma questão notável na neurociência, particularmente quando a integração ocorre no nível de neurônios individuais 9,29,30,31,32. A integração sensorial é especialmente importante na propriocepção, que é em si uma modalidade integrativa que se baseia em múltiplas pistas sensoriais1.

Entender a sensação da gravidade na Caenorhabditis tem implicações para a saúde humana. Milhões de indivíduos sofrem de disfunção vestibular apenas nos Estados Unidos33, e muitos desses distúrbios têm causas genéticas subjacentes34,35. Por essa razão, a identificação de candidatos a genes e terapias-alvo é uma área ativa de pesquisa36. Além disso, como os sistemas vestibulares e auditivos vertebrados estão intimamente ligados ao desenvolvimento e evolutivamente 33,36,37, a sensação de gravidade elucidante também poderia fornecer insights sobre distúrbios auditivos e auditivos.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde ao JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Gostaríamos de reconhecer Pradeep Joshi (UCSB) por sua contribuição editorial. Consulta estatística fornecida pelo UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comportamento Questão 183
Ensaio gravitaxis em larga escala de <em>Larvas de Caenorhabditis</em> Dauer
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Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

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