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Behavior

Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

El presente protocolo describe métodos para realizar un ensayo gravitacional a gran escala con larvas de Caenorhabditis dauer. Este protocolo permite una mejor detección del comportamiento del eje gravitacional en comparación con un ensayo basado en placas.

Abstract

La sensación de gravedad es un proceso importante y relativamente poco estudiado. La detección de la gravedad permite a los animales navegar por su entorno y facilita el movimiento. Además, la sensación de gravedad, que ocurre en el oído interno de los mamíferos, está estrechamente relacionada con la audición, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la investigación auditiva y vestibular. Existen ensayos de gravitaxis para algunos organismos modelo, incluyendo Drosophila. Los gusanos individuales han sido previamente ensayados para determinar su preferencia de orientación a medida que se asientan en solución. Sin embargo, no se ha descrito un ensayo fiable y robusto para el eje gravititario de Caenorhabditis . El presente protocolo describe un procedimiento para realizar ensayos de eje gravitacional que se puede utilizar para probar cientos de dauers de Caenorhabditis a la vez. Este ensayo a gran escala y a larga distancia permite la recopilación detallada de datos, revelando fenotipos que pueden pasarse por alto en un ensayo estándar basado en placas. El movimiento de Dauer a lo largo del eje vertical se compara con los controles horizontales para garantizar que el sesgo direccional se deba a la gravedad. La preferencia gravitáctica se puede comparar entre cepas o condiciones experimentales. Este método puede determinar los requisitos moleculares, celulares y ambientales para el eje gravitacional en gusanos.

Introduction

Detectar la atracción gravitacional de la Tierra es crucial para la orientación, el movimiento, la coordinación y el equilibrio de muchos organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y los neurocircuitos de la sensación de gravedad son poco conocidos en comparación con otros sentidos. En los animales, la sensación de gravedad interactúa y puede ser superada por otros estímulos para influir en el comportamiento. Las señales visuales, la retroalimentación propioceptiva y la información vestibular pueden integrarse para generar un sentido de conciencia corporal en relación con el entorno de un animal 1,2. Por el contrario, la preferencia gravíctica puede ser alterada en presencia de otros estímulos 3,4,5. Por lo tanto, el comportamiento gravitáctico es ideal para estudiar la sensación de gravedad y comprender la compleja integración sensorial del sistema nervioso y la toma de decisiones.

C. elegans es un organismo modelo especialmente útil para estudiar el eje gravitacional debido a su ciclo de vida polifénico. Cuando se exponen a factores estresantes durante el desarrollo, incluyendo calor, hacinamiento o falta de alimentos, las larvas de C. elegans se convierten en dauers, que son altamente resistentes al estrés6. Como dauers, los gusanos realizan comportamientos característicos, como la nictación, en la que los gusanos "se paran" sobre sus colas y agitan sus cabezas, lo que puede facilitar la dispersión a mejores hábitats7. Los ensayos de gravitaxis de C. elegans y C. japonica sugieren que las larvas de dauer gravitan negativamente, y que este comportamiento se observa más fácilmente en dauers que en adultos 8,9. Las pruebas del eje gravitacional en otras cepas de Caenorhabditis pueden revelar una variación natural en el comportamiento gravitáctico.

Los mecanismos para la sensación de gravedad se han caracterizado en Euglena, Drosophila, Ciona y varias otras especies utilizando ensayos de eje gravitacional 3,10,11. Mientras tanto, los estudios del eje gravitacional en Caenorhabditis inicialmente proporcionaron resultados mixtos. Un estudio de la preferencia orientacional de C. elegans encontró que los gusanos se orientan con la cabeza hacia abajo en solución, sugiriendo una preferencia gravitáctica positiva12. Mientras tanto, aunque los dauers de C. japonica fueron identificados desde el principio como gravitácticos negativos8, este comportamiento solo recientemente se ha descrito en C. elegans9. Varios desafíos surgen en el desarrollo de un ensayo de gravitaxis representativo en gusanos. Las cepas de Caenorhabditis se mantienen en placas de agar; Por esta razón, los ensayos de comportamiento suelen utilizar placas de agar como parte de su diseño experimental13,14,15. El primer ensayo de eje gravitacional reportado en Caenorhabditis se realizó colocando una placa de lado en un ángulo de 90 ° con respecto a la placa de control horizontal8. Sin embargo, el comportamiento del eje gravitacional no siempre es robusto en estas condiciones. Mientras que los gusanos adultos pueden ser ensayados para la preferencia orientativa en la solución12, esta preferencia direccional también puede depender del contexto, lo que lleva a diferentes comportamientos si los gusanos se arrastran en lugar de nadar. Además, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo la luz y los campos electromagnéticos16,17, que interfieren con sus respuestas a la gravedad9. Por lo tanto, un ensayo de eje gravitacional actualizado que protege contra otras variables ambientales es importante para diseccionar los mecanismos de este proceso sensorial.

En el presente protocolo, se describe un ensayo para observar el eje gravitacional de Caenorhabditis. La configuración para este estudio se basa en parte en un método desarrollado para estudiar la integridad neuromuscular18,19. Las larvas de Dauer se cultivan y aíslan utilizando procedimientos estándar20. Luego se inyectan en cámaras hechas de dos pipetas serológicas de 5 ml llenas de agar. Estas cámaras pueden orientarse vertical u horizontalmente y colocarse dentro de una jaula de Faraday oscura durante 12-24 h para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. La ubicación de cada gusano en las cámaras se registra y se compara con los taxis verticales de una cepa de referencia como C. elegans N2.

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Protocol

Las cepas utilizadas en el presente estudio son C. elegans (N2) y C. briggsae (AF16) (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una población mixta de dauers para cada ensayo.

1. Preparación de la cámara

  1. Trabajar en una campana extractora. Configure el espacio de trabajo con un mechero Bunsen, 1-2 cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico (consulte la Tabla de materiales).
  2. Para cada cámara, reunir dos pipetas serológicas de 5 ml. Retire el tapón de algodón de una pipeta con pinzas. Sostenga una cuchilla de afeitar sobre el quemador Bunsen hasta que esté caliente con unos alicates. Utilice la cuchilla calentada para cortar el extremo cónico de la segunda pipeta de modo que toda la pipeta tenga un diámetro uniforme (figura 1A).
  3. Trabajando rápidamente, acerque los dos extremos de pipeta modificados a la llama, derritiéndolos ligeramente. Une estos extremos presionándolos firmemente entre sí, asegurándote de que las paredes de ambas pipetas sean continuas. Si hay huecos visibles después de unirse, sepárelos y repita este paso (Figura 1A, B).

2. Llenado de las cámaras con agar

  1. Preparar NGM con agar al 4% de acuerdo con los procedimientos estándar de lombriz21. Mientras el agar aún está fundido, llene cada cámara uniéndolo a una pipeta serológica y extrayendo lentamente la solución. Selle la punta con una película de parafina antes de retirar la cámara del pipetedor. Coloque la cámara plana (paralela a la mesa de trabajo) para que se enfríe.
    NOTA: Cubrir el matraz con envoltura adhesiva (ver Tabla de materiales) después del autoclave ayuda a evitar que se formen burbujas en la solución18.
    1. Para minimizar cualquier variación en la consistencia del agar debido a un enfriamiento desigual, sostenga la pipeta (consulte la Tabla de materiales) paralela a la mesa de trabajo mientras dibuja el agar. Coloque las cámaras planas en la mesa de trabajo y deje que el agar se endurezca antes de moverse.
      NOTA: El porcentaje de agar y el contenido multimedia se pueden adaptar al experimento. El agar al 4% es más rígido que la concentración de aproximadamente el 2% utilizada para verter la placa y evita que los gusanos excaven a través del medio en nuestras manos. Sin embargo, otros experimentadores han observado el comportamiento de madriguera de gusanos adultos en hasta un 9% de agar18,19.
  2. Una vez enfriado, caliente una llave hexagonal de 3 mm (u otra herramienta metálica del mismo tamaño, consulte la Tabla de materiales) sobre un mechero Bunsen. Presiónelo firmemente en la pared de cada cámara a unos 5 mm a un lado de la línea media, creando una pequeña abertura en el plástico (Figura 1C). Use una cuchilla calentada para quitar el algodón y los extremos cónicos de la cámara y selle estos extremos con una película de parafina.
    NOTA: Una vez preparada, cada cámara debe utilizarse en un plazo de 1 día o mantenerse a 4 °C durante varios días. Cubra cualquier abertura expuesta con una película de parafina para evitar que el agar se seque.

3. Aislar larvas de dauer

  1. 10-15 días antes del experimento, troce cada cepa en 2-3 placas grandes de NGM con bacterias OP50 y envuélvalas con una película de parafina. Después de 10-15 días, cada plato debe estar completamente hambriento con miles de larvas de dauer presentes en el agar, las paredes y las tapas.
    NOTA: Haga platos con anticipación usando una receta OP50 gruesa para obtener el máximo hacinamiento (consulte la Tabla de materiales). La formación de Dauer también puede ser inducida a través de otros métodos, incluyendo la adición de feromonas o creciendo a temperaturas más altas22.
  2. Recoja los gusanos enjuagando las tapas y placas con tampón M9 y pipeteando la solución en tubos centrífugos de 15 ml. Girar a 1.600 x g durante 30-60 s a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte del tampón M9 con una pipeta o aspirador de vacío.
  3. Aislar los dauers tratando con SDS al 1% seguido de un gradiente de flotación de sacarosa al 30% siguiendo el informe publicado anteriormente20.
    1. Agregue 7 ml de solución SDS al 1% a cada pellet de lombriz. Deje los gusanos en SDS durante 30 minutos; Gire los tubos continuamente durante este tiempo para permitir la aireación. Enjuague 3-5x con M9 para eliminar el detergente.
    2. A continuación, agregue 5 ml de M9 seguido de 5 ml de solución fría de sacarosa filtrada al 60%. Mezclar bien y luego centrifugar a 1.600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para crear un gradiente de separación.
  4. Llene los nuevos tubos de centrífuga de 15 ml con 2 ml de tampón M9. Aplastar los extremos de las pipetas de vidrio Pasteur para ensanchar el orificio y utilizar estas pipetas para transferir la capa superior de la solución (que contiene dauers aislados) del gradiente de sacarosa a los nuevos tubos. Enjuague los dauers 3-5x con M9.
    NOTA: Habrá miles de dauers aislados en solución en este punto. Pueden usarse inmediatamente o mantenerse aireados girando en 5-7 ml M9 durante la noche.

4. Adición de dauers a la cámara

  1. Centrífuga a 1.600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte de la solución M9 con una pipeta o aspirador de vacío. Para estimar la densidad de gusanos, cuente manualmente el número de gusanos en tres gotas separadas de 1 μL bajo un microscopio de disección. Utilice el promedio de estos recuentos para aproximar el número de gusanos por μL.
    NOTA: Es posible que algunas pipetas de pequeño volumen no puedan alcanzar el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml; En este caso, una gota concentrada de gusanos se puede transferir primero a un trozo de película de parafina.
  2. Corte el extremo de una punta de pipeta de 10, 20 o 200 μL para ensanchar el orificio. Ajuste la micropipeta a un volumen ligeramente mayor que el volumen de aspiración previsto. Aspire aproximadamente 1-2 μL de la solución de gusano concentrada (idealmente entre 100-300 gusanos) y permita que una pequeña cantidad de aire entre en la punta.
    NOTA: Un gran número de gusanos (1,000+) en una cámara puede aumentar el rango de distancias recorridas debido al hacinamiento9.
  3. Empuje suavemente la punta de la pipeta en el agar mientras presiona la micropipeta. Esto creará un sitio de inyección en el agar sin obstruir la punta. Libera los gusanos en el agar. Use una película de parafina para sellar la abertura.

5. Ejecución y puntuación del ensayo

NOTA: La gravitaxis puede ser probada bajo diversas condiciones que pueden afectar el comportamiento9.

  1. Para eliminar tantas variables como sea posible, coloque las cámaras dentro de una jaula oscura de Faraday (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
  2. Etiquete cada cámara y cuélguela verticalmente dentro de la jaula de Faraday (realice esto usando cinta de etiquetado). Pruebe los controles horizontales simultáneamente colocando algunas cámaras planas dentro de las mismas condiciones ambientales. Pruebe las cepas experimentales contra gusanos N2 orientados verticalmente como control positivo. Utilice cámaras orientadas horizontalmente que contengan dauers N2 como control negativo adicional.
    NOTA: Los ensayos horizontales y verticales deben realizarse en el mismo entorno dentro del laboratorio para minimizar la variabilidad ambiental entre las dos condiciones. Se puede usar una incubadora grande para albergar ambas jaulas de Faraday.
  3. Los Dauers comienzan a dispersarse desde el sitio de inicio después de unas horas y tardan varias horas en llegar a cada extremo de la cámara. Deje las cámaras sin molestias durante este tiempo y marque dentro de las 12-24 h siguientes a la inyección.
    NOTA: No use un paralítico (como azida de sodio) para inmovilizar gusanos que han alcanzado los extremos de las cámaras. Debido a que se mide la distribución general de los gusanos en lugar de un índice de preferencia (como en un ensayo de dos opciones), la azida de sodio es innecesaria y puede alterar los resultados.
  4. Retire y marque las cámaras del eje gravitacional una a la vez. Busque dauers vivos bajo un microscopio de disección y marque sus ubicaciones con tinta (Figura 1C, D). No marque los gusanos dentro de los 2,5 cm a cada lado del sitio de inyección, ya que es probable que estos gusanos no demuestren una preferencia direccional.
    1. Además, evite marcar gusanos que parecen muertos o están atrapados en el líquido. Deseche cualquier cámara que contenga >50% de gusanos muertos o nadadores.
      NOTA: Una vez que la cámara se ha retirado del área de prueba, debe puntuarse rápidamente para mayor precisión. Los dauers solo deben ser visibles entre la superficie del agar y la pared de la pipeta. Si se observa un comportamiento de madriguera, considere aumentar la concentración de agar en futuros ensayos.
  5. Para cuantificar los resultados, utilice un marcador para dividir cada mitad de la cámara en siete secciones de 3,5 cm a partir de 2,5 cm de distancia del lugar de inyección (en algunas pipetas, 3,5 cm = 1 ml de volumen). Utilice un contador de conteo manual (consulte la Tabla de materiales) para calcular el número de gusanos observados en cada sección.
    NOTA: Debe haber siete secciones a cada lado del origen, que se pueden numerar de -7 (abajo) a +7 (arriba). Estos números deben corresponder a las mismas ubicaciones relativas basadas en cómo se construyeron las cámaras; El agar se extrae desde el extremo -7 hasta el extremo +7 en el paso 2.

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Representative Results

Comparando el graviteje entre especies
Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, el eje gravitacional de C. briggsae dauer se puede comparar con el eje gravitacional y los controles horizontales de C. elegans. La distribución vertical (granate) de C. briggsae dauers está sesgada hacia la parte superior de las cámaras, con un gran porcentaje de gusanos que alcanzan +7 (Figura 2A). En contraste con los controles horizontales (aqua), en los que los dauers se distribuyen en una curva en forma de campana alrededor del centro de las cámaras, esta tendencia indica un comportamiento gravitáctico negativo. Estos datos pueden compararse con el eje gravitacional de C. elegans realizado en los mismos días experimentales (Figura 2B).

Una prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Dunn con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples determinó cualquier diferencia significativa entre los ensayos 9,23. En este experimento, 1.108 Dauers de C. briggsae fueron puntuados en tres cámaras verticales de dos días experimentales independientes. Estos gusanos migraron significativamente hacia arriba que los controles horizontales (p < 0,001; 1.639 dauers en tres cámaras horizontales durante 2 días experimentales). Además, las distribuciones verticales de C. briggsae y C. elegans verticales no difirieron (p > 0,05; 386 dauers de C. elegans en dos cámaras verticales durante 2 días experimentales). Estos resultados sugieren que los dauers de C. briggsae muestran un comportamiento negativo del eje gravitacional similar al de los dauers de C. elegans.

Figure 1
Figura 1: Configuración de la cámara de ensayo de gravitaxis. Fotos que representan los pasos de la preparación de la cámara de ensayo del eje gravitatorio. (A) Se prepararon pipetas individuales de 5 ml para su fusión en una sola cámara. Extracción del tapón de algodón indicado con punta de flecha negra; Extracción de la punta indicada con una punta de flecha blanca. Los tubos utilizados en este estudio tienen un diámetro interior de 6 mm y tienen cada uno 34,5 cm de largo (antes del corte). (B) Cámara completa antes de la adición de agar NGM. Las pipetas se han fusionado fundiendo primero sobre un mechero Bunsen. (C) Cámaras de ejemplo llenas de agar NGM. El sitio de inyección se indica con una flecha y se agranda en el recuadro. Los gusanos se han marcado con tinta, y las líneas se dibujan para distinguir las distancias junto con la cámara, así como para facilitar la puntuación. (D) Vista de las cámaras en su totalidad (tomada después de la puntuación). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Gravitaxis en C. briggsae vs. C. elegans. Resultados del eje gravitacional en C. briggsae y C. elegans. (A) Histograma del eje gravitacional de C. briggsae. El movimiento en cámaras verticales (granate) se compara con los controles horizontales (aqua). La distancia desde el punto de inyección (-7 es el más alejado por debajo, +7 más arriba) se representa como el porcentaje del total de gusanos ensayados (eje x). No se representan datos para el origen (+0) ya que los gusanos no se cuentan a menos de 2,5 cm a cada lado del lugar de inyección. N = 1.639 gusanos a través de tres tubos en la condición horizontal; vertical N = 1.108 gusanos en tres tubos. (B) Diagramas de caja que comparan la distribución de gusanos horizontales y verticales de C. briggsae versus gusanos verticales de C. elegans. Los tamaños de muestra de C. briggsae se dan arriba. C. elegans vertical N = 386 gusanos a través de dos tubos. Los medios se indican con diamantes blancos; las condiciones verticales están en granate y están etiquetadas como "V", y las condiciones horizontales ("H") están en aguamarina. Las comparaciones se realizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn con corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Sin estrellas = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Comparación con métodos anteriores
A diferencia de la quimiotaxis, el eje gravitacional en Caenorhabditis no se puede observar de manera confiable utilizando un diseño experimental tradicional de placa de agar. Una placa de Petri estándar tiene 150 mm de diámetro, lo que resulta en solo 75 mm disponibles en cualquier dirección para que los dauers demuestren la preferencia del eje gravitatorio. Aunque la preferencia orientativa de C. elegans se puede ensayar en la solución12, este método es de bajo rendimiento ya que los gusanos deben analizarse uno a la vez. Además, las preferencias y comportamientos gravitácticos pueden diferir entre los gusanos que flotan en los medios frente a los que se arrastran sobre una superficie. Por estas razones, desarrollamos un ensayo de alto rendimiento con sensibilidad mejorada que se puede utilizar para analizar el comportamiento del eje gravitacional en gusanos rastreros o trepadores. Debido a que C. elegans es sensible a la luz y a los campos electromagnéticos, los cuales interfieren con la preferencia gravitáctica9, estos ensayos deben realizarse sin ningún estímulo. Si se utiliza una jaula de Faraday casera, es necesario y recomendable comprobar la resistencia de la jaula y reforzarla.

Las cámaras de ensayo descritas en este protocolo miden aproximadamente 54 cm de longitud y se colocan dentro de jaulas de Faraday para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. Se encontró que cambiar la "arena" para observar el comportamiento del eje gravitacional tiene varias ventajas. En primer lugar, permite la cuantificación detallada y el análisis descriptivo. Las distancias relativas recorridas y las distribuciones generales de gusanos se pueden recolectar y comparar en lugar de contar el número de gusanos gravitácticos negativos versus positivos. En segundo lugar, el entorno cerrado de una pipeta llena de agar replica más de cerca las condiciones que pueden promover el eje gravitacional en la naturaleza. Como se indicó anteriormente, la etapa de dauer es una fase de dispersión que permite escapar de condiciones desfavorables6. Debido a que Caenorhabditis vive en compost, donde las señales guía como la luz pueden no estar disponibles, la gravedad puede permitir que los gusanos naveguen hacia la superficie 6,9. Es poco probable que los ensayos bidimensionales basados en placas repliquen estas condiciones, incluso si se prueban sin otros estímulos. Finalmente, este aparato más grande prueba grandes cantidades de gusanos en un solo ensayo.

Limitaciones y otras consideraciones
Si bien este protocolo mide efectivamente la preferencia gravitáctica en un gran número de dauers, no es práctico para experimentos de gusanos pequeños o individuales debido al tiempo y los materiales necesarios para construir cada cámara. Al combinar los recuentos entre los ensayos en lugar de utilizar un índice gravitaxial, se aumenta el poder estadístico porque cada gusano se trata como un evento independiente. Si bien esta sensibilidad mejorada es útil para diferenciar gusanos gravitácticos y no gravitácticos, es importante tener en cuenta que los dauers de C. elegans exhiben comportamientos sociales 7,24 que podrían afectar el eje gravitacional general. Encontramos que las densidades de gusanos más altas se correlacionan con un mayor rango en la distancia recorrida durante el ensayo a gran escala, aunque este efecto es mínimo cuando el recuento total es inferior a aproximadamente 1,000 gusanos9. Los efectos de interacción resultantes de factores tales como el total de gusanos en cada cámara deben ser monitoreados al analizar los datos. Al igual que con todos los ensayos de comportamiento, la puntuación debe ser ciega cuando sea posible.

Encontrar una densidad promedio de gusanos en la solución puede minimizar la variabilidad en el número de gusanos inyectados de una cámara a otra. Los gusanos se asientan rápidamente en solución, por lo que es importante mezclar los gusanos antes del pipeteo, ya sea moviendo los tubos o pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta de gran calibre. Incluso cuando se logra una densidad constante, el número de gusanos añadidos puede variar porque es probable que los gusanos se adhieran a la superficie interior de las puntas de pipeta de plástico. El recubrimiento de las puntas de pipeta con BSA u otras soluciones podría minimizar este efecto. Los gusanos deben inyectarse con la menor solución posible; Si se agrega demasiado líquido a la cámara, los gusanos quedarán atrapados en la solución e incluso pueden derivar. Por esta razón, solo se pueden marcar gusanos vivos y rastreros, y no se debe usar ninguna cámara que contenga más del 50% de gusanos muertos o nadadores. Las cámaras deben retirarse de la jaula de Faraday una a la vez y puntuarse dentro de los 10-15 minutos para obtener la mayor precisión.

Aplicaciones potenciales
Este ensayo se puede utilizar para probar los requisitos ambientales, genéticos y celulares para el eje gravitacional en una variedad de cepas de Caenorhabditis. Hasta ahora, la luz y los campos electromagnéticos han sido identificados como estímulos que interfieren con el eje gravitacional9. Sin embargo, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo temperatura, químicos volátiles y no volátiles, textura, humedad y sonido, que influyen en su comportamiento25,26,27,28. Comprender cómo se integran varias entradas sensoriales dentro del sistema nervioso es una pregunta pendiente en neurociencia, particularmente cuando la integración ocurre a nivel de neuronas individuales 9,29,30,31,32. La integración sensorial es especialmente importante en la propiocepción, que es en sí misma una modalidad integradora que se basa en múltiples señales sensoriales1.

Comprender la sensación de gravedad en Caenorhabditis tiene implicaciones para la salud humana. Millones de personas sufren de disfunción vestibular sólo en los Estados Unidos33, y muchos de estos trastornos tienen causas genéticas subyacentes34,35. Por esta razón, la identificación de candidatos génicos y terapias dirigidas es un área activa de investigación36. Además, debido a que los sistemas vestibular y auditivo de los vertebrados están estrechamente relacionados desde el punto de vista del desarrollo y la evolución33,36,37, dilucidar la sensación de gravedad también podría proporcionar información sobre la audición y los trastornos auditivos.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud a JHR (#R01 5R01HD081266 y #R01GM141493). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Nos gustaría agradecer a Pradeep Joshi (UCSB) por su aporte editorial. Consulta estadística proporcionada por el DATALAB de UCSB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comportamiento Número 183
Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de <em>Caenorhabditis</em> dauer
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Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

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