Summary
Optisk klarhed er en stor fordel for cellebiologisk og fysiologisk arbejde i zebrafisk. Der beskrives robuste metoder til måling af cellevækst hos enkelte dyr, der giver ny indsigt i, hvordan vækst af skeletmuskulatur og nabovæv integreres med hele kroppens vækst.
Abstract
En række metoder kan bruges til at visualisere individuelle celler i hele kroppen af levende embryonale, larve eller unge zebrafisk. Vi viser, at levende fisk med fluorescerende mærkede plasmamembraner kan scannes i et konfokal laserscanningsmikroskop for at bestemme mængden af muskelvæv og antallet af muskelfibre, der er til stede. Effektive metoder til måling af celleantal og -størrelse hos levende dyr over tid beskrives og valideres mod mere vanskelige segmenteringsmetoder. Der beskrives metoder, der tillader kontrol af muskelelektrisk og dermed kontraktil aktivitet. Tab af skeletmuskulatur kontraktil aktivitet reducerede muskelvæksten kraftigt. I larver beskrives en protokol, der tillader genindførelse af mønstret elektrisk fremkaldt kontraktil aktivitet. De beskrevne metoder minimerer effekten af interindividuel variabilitet og vil muliggøre analyse af effekten af elektriske, genetiske, lægemiddel- eller miljømæssige stimuli på en række cellulære og fysiologiske vækstparametre i forbindelse med den levende organisme. Langsigtet opfølgning af de målte virkninger af en defineret tidlig intervention på enkeltpersoner kan efterfølgende udføres.
Introduction
Reguleret vævsvækst, der omfatter stigning i celleantal (hyperplasi) og / eller cellestørrelse (hypertrofi), er en afgørende faktor i udvikling, regenerering og økologisk og evolutionær tilpasning. På trods af enorme fremskridt inden for molekylær genetisk forståelse af både celle- og udviklingsbiologi i de seneste årtier er mekanistisk forståelse af reguleringen af væv og organstørrelse stadig i sin vorden. En af grundene til denne lakune i viden er vanskeligheden ved at kvantificere vævsvækst i levende organismer med den nødvendige rumlige og tidsmæssige nøjagtighed.
Forskellige aspekter af vækst af hele organismer kan måles gentagne gange over tid og afsløre vækstkurver for hver enkelt 1,2,3,4,5. Stadig mere sofistikerede scanningsmetoder, såsom dobbelt røntgenabsorptiometri (DXA), computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), tillader sporing af vækst af hele organer og andre kropsregioner (for eksempel individuelle identificerede skeletmuskler) hos enkeltpersoner, både menneskelige og i modelorganismer 6,7,8,9,10 . Imidlertid har disse metoder endnu ikke opløsningen til at afsløre individuelle celler, og dermed har forbindelserne mellem cellulær adfærd og vævsniveauvækst været svære at skelne. For at skabe sådanne forbindelser har traditionelle undersøgelser ofte været afhængige af kohorter af lignende individuelle dyr, hvoraf nogle få ofres på successive tidspunkter og derefter analyseres i cytologiske detaljer. Sådanne tilgange kræver et gennemsnit af de observerede ændringer på tværs af grupper af (helst ens, men ikke desto mindre variable) individer og lider således af mangel på tidsmæssig og rumlig opløsning, hvilket gør det svært at finde korrelerede begivenheder på celleniveau, der tyder på årsag og virkning.
Undersøgelser af hvirvelløse modelorganismer, oprindeligt i C. elegans og D. melanogaster, har omgået disse problemer ved at udvikle optisk mikroskopi for at opnå cellulær opløsning og nøjagtigt måle vækst over tid hos enkeltpersoner. Sådanne undersøgelser har afsløret påfaldende invariant celleafstamningsadfærd i væksten af disse små modelorganismer 11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange dyr, herunder alle hvirveldyr, ubestemte cellelinjer og styrer vævsvækst ved mystiske feedbackprocesser, der tjener til at gøre det genetisk kodede vækstprogram til en funktionel tredimensionel organisme med alle dets bestanddele og organer, der passer til størrelse. For at forstå disse komplekse vækstprocesser er det ønskeligt at afbilde hele væv eller organer over tid hos enkeltpersoner, der kan manipuleres eksperimentelt ved genetiske, farmakologiske eller andre indgreb på et valgtidspunkt, og effekten analyseres efterfølgende.
Hver hvirveldyr skeletmuskel har en defineret størrelse, form og funktion og velkarakteriserede interaktioner med tilstødende væv, såsom knogler, sener og nerver. Nogle muskler er små, ligger lige under huden og er derfor gode kandidater til billeddannelsesundersøgelser i høj opløsning. I lighed med de fleste organer vokser hver muskel gennem embryonalt, postnatalt og ungdomsliv, før de når en stabil voksenstørrelse. Muskler har imidlertid også en unik evne til at ændre størrelse i voksenlivet, afhængig af brug og ernæring18, og denne egenskab har stor indflydelse på organismens fitness, sportslige præstationer og uafhængig levevis. Tab af muskelmasse og funktion i alderdommen, sarkopeni, er et spørgsmål om stigende bekymring for samfund, der står over for en aldrende befolkning 19,20,21.
Vi og andre har fokuseret på væksten af definerede blokke af skeletmuskelvæv i den segmentalt gentagende krop af zebrafisklarver, som et tilsyneladende lukket system indeholdende flere hundrede celler, hvor vævsvækst, vedligeholdelse og reparation kan observeres og manipuleres 22,23,24,25,26. Mens noget kvantitativt arbejde tidligere er blevet rapporteret 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, er der ingen detaljeret og valideret metode til måling af muskelvækst i cellulære detaljer i individuelle hvirveldyrorganismer over tid. Her beskrives en effektiv protokol for, hvordan man udfører sådanne gentagne målinger sammen med validering, og der gives et eksempel på dets anvendelse til at analysere ændringer i både hypertrofisk og hyperplastisk vækst som reaktion på ændret elektrisk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al beskrevet forskning blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og under passende licenser fra det britiske indenrigsministerium i overensstemmelse med Animal (Scientific Procedures) Act 1986 og efterfølgende ændringer. Embryoner/larver bør opdrættes ved 28,5 °C, indtil gastruleringen er afsluttet, men kan derefter holdes ved 22-31 °C for at kontrollere udviklingshastigheden. Fisk kan scannes eller stimuleres ved stuetemperatur.
1. Anæstetik zebrafisklarver
- Kryds egnede fluorescerende reporter voksne fisk såsom Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg reference 36 eller Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg reference37 og opsaml embryoner som beskrevet38.
- På valgtidspunktet, såsom 2 dage efter befrugtning (dpf), skal du bedøve embryoner kort ved hjælp af trikainholdigt fiskemedium (enten fiskevand eller E3-medium) og screene for EGFP eller mCherry under et fluorescensmikroskop, såsom en Leica MZ16F. Hvis man har mange embryoner, skal du vælge dem med det lyseste signal. Returner embryoner til normalt fiskemedium umiddelbart efter screening.
2. Montering af fisk til konfokal scanning
- Tænd for det konfokale laserscanningssystem og lasere, så systemet stabiliseres i 30-60 min.
BEMÆRK: Her brugte vi et Zeiss LSM 5 Exciter mikroskop med opretstående materialestativ (hvilket forbedrer arbejdsafstanden) udstyret med et 20x / 1,0 W vandnedsænkningsmål. - Forbered 1% lavsmeltende agarose (LMA) og opbevar i en 37 ° C varmeblok til gentagen brug i et 1,5 ml rør. For at undgå varmechok skal du fjerne LMA-aliquoten fra varmeblokken og lade den køle af til lige over indstillingen, før den påføres larven, og teste mod ens hud for at bedømme den passende temperatur, som ved vurdering af temperaturen på modermælkserstatning.
- Vælg fisk, der skal monteres, og bedøm hver fisk på skift med Tricaine (0,6 mM i fiskemedium).
- Tag en petriskål med en diameter på 60 mm, der er belagt med et lag på 1% agarose, og læg den på scenen af et dissekerende mikroskop.
- Overfør larven med en 1 ml plastik Pasteur-pipette på den 60 mm belagte petriskål og fjern så meget overført medium som muligt. Derefter, stadig ved hjælp af Pasteur-pipetten, skal du placere 5 til 10 dråber LMA på fisken og hurtigt placere vandret i lateral visning med tang (eller en ildpoleret fin glasnål), før LMA sætter sig. For optimal billeddannelse er det ønskeligt at placere larven tæt på LMA's øvre overflade.
- Alternativt kan du bruge en 1 ml plastikpipette til at samle larven med så lidt fiskemedium som muligt og overføre larven til aliquoten af afkølet LMA. Lad larven synke i 5 s for at blive fuldt omgivet af LMA. Hent derefter larven og overfør den i en dråbe LMA på den agarosebelagte petriskål. Orientering hurtigt og placer larven som beskrevet ovenfor.
- Larven orienteres med både dens anteroposterior- og dorsoventrale akser inden for 10° fra vandret (se bemærkningen »Om fejl og korrektion« i punkt 4.6 nedenfor).
- Hvis larven ikke er korrekt monteret vandret nær overfladen af agarosedråben, skal du fjerne og genindlejre. Larver kan let hentes ved blid sugning ved hjælp af en mikrofin 1 ml plastik Pasteur pipette, og LMA kan forsigtigt fjernes ved hjælp af Kimwipes. Øvelse gør virkelig mester i monteringsproceduren; Brug en eftermiddag på at indlejre nogle uvigtige larver, før du prøver dette på et rigtigt eksperiment.
BEMÆRK: Om mikroskopdesign: Mange laboratorier bruger omvendte konfokale mikroskoper til billeddannelse gennem en dækslip. Vi har konstateret, at gentagen indlejring og fjernelse af fisk, der holdes i agarose under en dækslip til observation i et omvendt mikroskop, fører til større tab af prøver under gentagen scanning end i den beskrevne procedure med et opretstående mikroskop. Af denne grund anbefales brugen af et opretstående system, hvis det er tilgængeligt. Ikke desto mindre er en nøgle til data af høj kvalitet korrekt udvælgelse og brug af objektive og scanningsparametre, et emne, der er for stort til diskussion her.
- Hvis larven ikke er korrekt monteret vandret nær overfladen af agarosedråben, skal du fjerne og genindlejre. Larver kan let hentes ved blid sugning ved hjælp af en mikrofin 1 ml plastik Pasteur pipette, og LMA kan forsigtigt fjernes ved hjælp af Kimwipes. Øvelse gør virkelig mester i monteringsproceduren; Brug en eftermiddag på at indlejre nogle uvigtige larver, før du prøver dette på et rigtigt eksperiment.
3. Konfokal scanning
- Når LMA er sat, oversvømmes skålen med ca. 10 ml trikainholdigt fiskemedium. Hvis du planlægger at fange konfokale stakke, skal du lade den monterede fisk hvile i mindst 10 minutter, før du fortsætter med at scanne, da der opstår en vis hævelse.
- Læg prøveskålen til stadiet af det konfokale system, find larven og fokuser på den ønskede somit. Somite 17 kan vælges på grund af dets lette lokalisering nær analventilen og lette billeddannelse. Tjek ved at tælle somitter fra anterior.
BEMÆRK: Den første somit er smeltet bag øret og har ingen forreste kant, men kan let observeres at have stribede muskelfibre. - Sæt op som for at fange en Z-stak ved at definere top (dvs. lige over huden) og bund (dvs. lige under notokorden, så hele somitten inkluderes, selvom fisken er monteret lidt skævt). Både venstre og højre side kan fanges efter ønske. Dette vil sikre, at alle de hurtige YZ-scanninger fanger den eller de ønskede regioner.
- Tag et XY-billede som følger. Orienter scanningsområdet med hensyn til fisken, som den konfokale software tillader. Placer fisken med anteroposterioraksen parallelt med den afbildede X-akse og dorsoventralaksen parallelt med Y-aksen med somit 17 i midten af feltet som vist i supplerende fil 1. Fokuser på et mellemniveau plan i det øverste myotom, hvor hele epaxial og hypaxial somite halvdele sammen med den lodrette og vandrette myosepta er synlige og fange et XY-billede i høj opløsning. Husk at navngive og gemme billedet.
- Tag et eller flere YZ-billeder som følger. I de repræsentative resultater (nedenfor) sammenlignes nøjagtigheden af 2-skive- og 4-skivemetoder. I 2-skive-tilgangen anvendes enkelt XY - og YZ-scanninger . I 4-skive-tilgangen er tre YZ-scanninger i gennemsnit for at give et mere præcist skøn over myotomvolumen. Hvis det kræves af den konfokale software, skal du omorientere scanningsfeltet.
- Tegn en præcis dorsal til ventral linje over den valgte somit vinkelret på fiskens anteroposterior akse på en valgt anteroposterior position. Udfør en Z-stack linjescanning.
- Gentag YZ-linjescanningen tre gange på definerede anteroposteriorpositioner langs det valgte myotom for at fange YZa, YZm og YZp. Repræsentative resultater er vist i figur 2A. Navngiv og gem disse billeder sammen med det relaterede XY-billede.
BEMÆRK: Ved valg af YZ-planer: Mynotomet er V-formet, og dets form ændres under vækst. For at opnå den mest nøjagtige vurdering af myotom 17 volumen med 4-skivemetoden skal du placere YZa på myotomets forreste spids, YZp på myotomets bageste spidser ved dorsale og ventrale ekstremer og YZm halvvejs mellem YZa og YZp. Hvis man antager, at somitten tilspidses ensartet, vil gennemsnittet af målinger fra hver YZ-sektion repræsentere myotomet som helhed. For 2-skivemetoden skal den enkelte YZ-scanning placeres i den bageste ende af det vandrette myoseptum, hvilket stort set svarer til det anteroposterior centrum af myotomet af interesse (såsom YZm). Alternativt kan et sæt af tre YZ-sektioner tages ved anterior, midterste og bageste af det vandrette myoseptum, men som vist nedenfor vil en sådan måling lidt over- eller undervurdere myotomvolumen (for henholdsvis rostral og kaudale somitter på grund af myotomtilspidsning). Grundlæggende er konsistens i positionering af YZ-skiveplan (er) mellem fisk og eksperimenter nøglen til reproducerbarhed.
4. Bedømmelse
- Da myotomet ændrer størrelse langs fisken på en gradueret måde, skal du altid arbejde med den samme somit i sammenlignende undersøgelser.
- For at måle og beregne myotomvolumenet skal du bruge confokal-softwaren (såsom .lsm-filer oprettet ved hjælp af Zeiss ZEN-mikroskopsoftware) eller open source universel billedanalysesoftware, såsom Fiji / ImageJ.
BEMÆRK: Hvis du ændrer filformater, skal du sørge for, at Z-trinsstørrelsen overføres korrekt, da ikke al software kan læse proprietære konfokale filformater korrekt. Hvis du f.eks. vil importere et ZEN-linjescanningsbillede til Fiji, skal du først bruge kommandoen Fil/eksport til at eksportere som .tif i billedvinduet Fuld opløsning - enkeltplanformat og derefter importere til Fiji. Selvom YZ scan.lsm kan åbnes direkte i Fiji, komprimeres de resulterende YZ-billeder generelt i Z-dimensionen på grund af forkert evaluering af Z-trinstørrelsen. - Analyse ved hjælp af ZEN
- Åbn først XY scan.lsm-filerne i ZEN. Gå til fanen Grafik , og vælg linjeværktøjet. Tegn en linje mellem de to lodrette myosepta af somit 17, der spænder over hele myotomlængden (parallelt med fiskens anteroposterior akse). Marker afkrydsningsfeltet M for at afsløre måleværdierne (Længde = 89,71 μm, se Supplerende fil 2).
- Åbn YZ scan.lsm-filerne. Under fanen Grafik skal du vælge værktøjet Lukket Bezier . Tegn rundt om myotomets omkreds. Når du er færdig, skal du markere feltet M, dette vil afsløre værdien af målingen (Areal = 11980,01 μm2, se Supplerende fil 3).
- Registrer værdierne for hver måling manuelt i et regneark. Gennemsnit CSA-målingerne efter behov. Myotomets volumen kan beregnes som volumen = myotomlængde x CSA, dvs. 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
- Analyse ved hjælp af Fiji/ImageJ
- Åbn XY scan.lsm-filerne i Fiji/ImageJ. Kontroller, om XY-billeder , der åbnes direkte i Fiji, er korrekt kalibreret i skala, som de burde være.
- Vælg værktøjet Lige linje fra ikonerne. Tegn en linje langs længden af somite 17 som beskrevet i trin 4.3.1. Angiv måleparametre ved at gå til Analyser, vælg derefter Indstil målinger..., og marker følgende felter Område og Vis etiket. For at måle skal du blot trykke på genvejstasten M eller gå til menuen Analysér og vælge Måling. Et resulterende pop op-vindue viser alle måleværdier (dvs. Længde = 90,023 μm; se Supplerende fil 4). Resultaterne kan gemmes i form af .csv og åbnes i Microsoft Excel eller lignende til efterfølgende analyse.
- Hvis du vil måle CSA på YZ-billederne, skal du åbne YZ-billeder i .tif format som beskrevet i trin 4.2.
- Kalibrer YZ .tif-billederne, da de ikke kalibreres, når de eksporteres. Parametre til kalibreringen kan fås i ZEN ved at gå til Info for de valgte billeder: Optag Scaling X (0,489 μm) og Skalering Z værdier (0,890 μm; se Supplerende fil 5). Derefter, mens billederne er åbne i Fiji, skal du gå til Billede og vælge Egenskaber .... Indtast 0,489 μm for pixelbredden og pixelhøjden og 0,890 μm for Voxeldybden. Marker afkrydsningsfeltet Global for at anvende kalibreringen universelt, hvis der forventes gentagen måling af YZ-billeder (se Supplerende fil 6).
BEMÆRK: Sørg for, at alle YZ-billeder er taget ved hjælp af de samme scanningsparametre; genstart Fiji/ImageJ, eller rediger kalibreringsværdierne, hvis der kræves et nyt sæt kalibrering. - Hvis du vil måle CSA'en for de kalibrerede YZ-billeder , skal du vælge værktøjet Polygonvalg fra ikonerne. Tegn rundt om somittens omkreds, og tryk på M for at afsløre måleværdierne (Areal = 11980.395 μm2; se Supplerende fil 7). Myotomets volumen kan beregnes som volumen = myotomlængde x CSA, dvs. 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
- Gentag målingerne på de andre XY- og YZ-billeder. Det anbefales at bruge den samme software til alle målinger inden for en eksperimentel serie for konsistens. Volumenestimatet fra hver software er ens, men ikke identisk på grund af de forskellige tegneværktøjer, dvs. ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 og Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3. Vækst af myotomet mellem to tidspunkter (dvs. 3 til 4 dpf) kan beregnes som: (Volumen 4 dpf - Volumen 3 dpf)/ Volumen 3 dpf × 100%.
BEMÆRK: Om fejl og dens korrektion. Under monteringen skal fisken orienteres med sit sagittale plan (dvs. anteroposterior og dorsoventral akse) så tæt som muligt på vandret for at undgå henholdsvis yaw og roll. Dette skyldes, at både myotomlængden L målt fra XY-scanningen og CSA målt fra en YZ-scanning vil blive overvurderet, hvis fisken viser krøje (rotation omkring dorsoventralaksen) på grund af skrå anteroposterior montering. Hverken stigning eller rulle under montering bør påvirke målingerne efter scanning som beskrevet i afsnit 3. Ikke desto mindre forringer dorsoventral rotation (rulle) billedkvaliteten. Simpel trigonometri viser, at op til 10° krøjelig vil give 3% fejl i volumenmåling, da målt L og CSA hver stiger i forhold til (cosq)-1, hvor q er vinklen væk fra anteroposterior vandret (yaw). 15° og 20° off vil give henholdsvis 7% og 13% overestimater af volumen.
Da notokordet er cylindrisk, kan inkludering af hele notokordet i YZ-scanningen bruges til at beregne vinklen og omfanget af skrå ud fra orienteringen og størrelsen af de store og mindre akser og derved korrigere den målte L og CSA for at maksimere nøjagtigheden. Korrigeret CSA = Målt CSA x Notochord mindre akse / Notochord hovedakse. Korrigeret L = Målt L x Notochord mindre akse/Notochord akse i mikroskop Z retning.
En yderligere overvejelse tillader yderligere korrektion af L. Når myotomet vokser, skæver det i koronaplanet (normalt til dorsoventralaksen), således at det mediale myotom er lidt anterior til det laterale myotom. Set fra dorsal danner den lodrette myosepta på venstre og højre side en bred vinkel, der peger anterior. Hvis gabet er lavt, påvirker denne morfologi ikke måling af L. Men hvis yaw er signifikant, bliver trigonometrisk korrektion udfordrende, og en bedre tilgang er at måle True L direkte ved at estimere XYZ-koordinaterne for de to punkter, hvor den forreste og bageste lodrette myosepta møder notokordet ved det vandrette myoseptum. Simpel trigonometri tillader beregning af True L fra disse koordinater som L = SQRT [(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Svagheder ved denne sidste tilgang er, at a) udvælgelsen af punkterne kan variere med operatøren, og b) der ikke bevares nogen visuel registrering af de valgte punkter. Denne overvejelse påvirker ikke CSA-korrektionen.
5. Valgfri metode: Fjern og genindfør muskelelektrisk aktivitet
- Opret et stimuleringskammer.
- Tag en 6 x 35 mm brøndplade, skab to små åbninger (<5 mm i diameter, 1 cm fra hinanden) på hver side af hver brønd (se figur 1) ved hjælp af et smalt loddejern.
BEMÆRK: Håndter det varme loddejern med omhu og arbejd i en røghætte, hvis det ønskes for at undgå indånding af damp. - Træk et par sølv- eller platintråde (~ 20 cm lange) gennem åbningerne i hver brønd (se figur 1). Genanvendeligt klæbemateriale (f.eks. BluTack) kan påføres nær åbningerne for at holde ledningerne på plads og sikre en afstand på 1 cm mellem ledningerne (se figur 1).
- Tag en 6 x 35 mm brøndplade, skab to små åbninger (<5 mm i diameter, 1 cm fra hinanden) på hver side af hver brønd (se figur 1) ved hjælp af et smalt loddejern.
- Ved 3 dpf opdeles fisk i tre betingelser: fiskemedium Control, Inactive og Inactive + Stim.
- For inaktive og inaktive + Stim-grupper bedøves larver 72 timer efter befrugtning (hpf) med Tricaine (0,6 mM).
BEMÆRK: Efter reference38 optøes frosne alikvoter af tricainbestanden og fortyndes (40 μL/ml fiskemedium, til en endelig koncentration på 0,6 mM), inden de tilsættes fisk. Tilsæt ikke tricain direkte i vandet, der indeholder fisk, da nogle fisk kan modtage høje doser. Tricainbestanden skal bruges inden for en måned og aldrig genfryses. - For fiskemediet Kontrolfisk, lad dem være ubedøvede.
- For inaktive og inaktive + Stim-grupper bedøves larver 72 timer efter befrugtning (hpf) med Tricaine (0,6 mM).
- På udvalgte tidspunkter efter tricaineksponeringens begyndelse (dvs. ved 80 hpf) skal du forberede Inactive+Stim-gruppen til stimulering.
- Forbered 60 ml 2% agarose (1,2 g agarosepulver i 60 ml fiskemedium), og smelt fuldt ud ved hjælp af mikrobølgeovn, afkøles, tilsæt tricain og hæld 4 ml i hver brønd i stimuleringskammeret (figur 1).
- Tilføj straks specialfremstillede 4-brøndskamme mellem elektroderne (skabt ved at skære plast (f.eks. Polypropylen) af ønskede dimensioner ud og klæbe sammen ved hjælp af Superglue; se figur 1). Lad 10 min til gel sætter sig. Fjern kamme omhyggeligt for at skabe fire rektangulære brønde.
- Fyld hver brønd med tricainvand og læg en enkelt bedøvet inaktiv + Stim larve i hver brønd ved hjælp af en mikropipette med deres anteroposterior akse vinkelret på elektroderne (se figur 1).
- Kontroller under dissekerende fluorescerende mikroskop, om hver fisk er fuldt bedøvet i hver brønd i kammeret.
- Tilslut en justerbar elektrofysiologisk mønstergenererende stimulator til kammeret via en polaritetscontroller ved hjælp af krokodilleclips, der er forbundet til hver af elektroderne på den ene side af kammeret (se figur 1).
BEMÆRK: Polaritetsregulatoren bruges til at vende polariteten hver 5. s for at forhindre elektrolyse og korrosion af elektroderne. - Stimulere fisk. For eksempel giver 1'er med et tog på 200, 20 V impulser, med 0,5 ms pulsvarighed og 4,5 ms pulsseparation, en gang hver 5. s et effektivt gentagen-tetanisk sammentrækningsresistensregime.
- Kontroller regelmæssigt under mikroskopet for at bekræfte, at fisken stimuleres; Eksemplet elektrisk stimulus skal fremkalde en synlig bilateral sammentrækning og let bevægelse en gang hver 5. s.
- For et modstands-/højkraftregime stimuleres fisken med en høj frekvens i et anfald på 5 min, tre gange, med hver kamp adskilt af 5 minutters hvile.
BEMÆRK: Mens fisk på den ene side af kammeret hviler, kan krokodilleklemmerne forbindes til elektrodeparret på den anden side af kammeret, og de ekstra fisk stimuleres. - Efter stimulering fjernes fisk forsigtigt fra hver brønd ved forsigtigt at skylle dem ud med en plastpipette og vende tilbage til inkubatoren i frisk tricainholdigt fiskemedium.
- Hæld tricainvandet væk inde fra kammeret og brug tang til at skære rundt og fjerne agarosen fra hver brønd. Skyl brøndene med ledningsvand og lad dem tørre.
BEMÆRK: Hvis du bruger sølvtrådelektroder, kan sølvoxid lejlighedsvis ophobes på trådens overflade efter et stimuleringseksperiment. Da sølvoxid er mindre ledende end sølv, skal du forsigtigt gnide sølvoxid af ledningen ved hjælp af Kimwipes for at opretholde reproducerbarheden, før opsætningen genbruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et hurtigt og præcist mål for somitvolumen
En metode til prøveforberedelse, dataindsamling og volumetrisk analyse, der muliggør hurtig måling af muskelvækst i zebrafisklarver, beskrives. Muskelstørrelse kan måles hos levende dyr ved hjælp af fisk mærket på deres plasmamembraner med en membranmålrettet GFP (β-actin: HRAS-EGFP) eller mCherry (α-actin: mCherry-CAAX). Larver blev forbigående bedøvet ved hjælp af tricain, monteret i lavsmeltepunktsagarose og afbildet ved hjælp af konfokal fluorescensmikroskopi. Somite 17 blev valgt til analyse af muskelstørrelse på grund af dens tilgængelighed ved bagagerums-hale-grænsefladen31. I praksis, som i teorien, kan myotomvolumen beregnes som produktet af myotomlængde (L) og gennemsnittet af tre tværsnitsarealmål (CSA) (figur 2A, der kaldes 4-skivemetoden).
For at validere denne metode blev der opnået hele myotome konfokale Z-stakke af levende zebrafisklarver (figur 2B), og somitvolumen blev beregnet ved at gange summen af somit 17 profilområder i hver skive (80-100 skiver) med mellemsnitsafstanden (1-1,2 μm). Der blev observeret en stærk sammenhæng mellem beregningsmetoderne med 4 skiver og full stack (figur 2C). Imidlertid gav 4-skivemetoden generelt et lidt større volumenestimat (~ 2% større i gennemsnit) (figur 2D). Denne forskel kan enten skyldes a) skråsikkerhed af prøverne, der giver fejlagtigt stor volumenmåling eller b) observationen af, at zebrafiskmyotomer tilspidses langs anteroposterioraksen, idet de er mindre mod dyrets hale. Da YZa-, YZm- og YZp CSA-målingerne er mod den forreste del af somit 17 myotom-chevron (figur 2A), blev sidstnævnte fortolkning testet ved volumetrisk analyse af myotomerne af somitter 16 og 18. Hver somite var ca. 7% større end den bagvedliggende (figur 2E). Yderligere analyse afslørede, at en 2-skivemetode, der kun kræver en enkelt YZ-måling, placeret midt i somitten, hvor de epaxiale og hypaxiale halvdele mødes ved det vandrette myoseptum (YZm) og XY-skiven, giver et rimeligt nøjagtigt skøn over myotomvolumen (figur 2F, G). 2-slice-tilgangen muliggør hurtigere dataindsamling, når tidsbegrænsninger begrænser antallet af fisk, der kan scannes. Sammenfattende viser disse data, at myotomvolumen kan måles hurtigt og præcist i levende zebrafisklarver. Enkeltlarver blev med succes gentagne gange målt over en 6-dages periode med denne metode.
Til sammenlignende undersøgelse af væksten af en identificeret vævsenhed giver den beskrevne metode pålidelige og præcise volumenestimater. For at opnå nøjagtige absolutte mængder kan der dog anvendes en række ændringer. For det første kan der korrigeres for fejl forårsaget af skrå montering enten ved at vippe skålen eller mikroskoptrinnet for at opnå bedre tværgående YZ- og parasagittale XY-skiver under billeddannelse eller ved at bruge notokordprofilen i YZ-skiver; tværsnitsaksen afslører den cylindriske notokords sande diameter, mens dens hovedakse afslører skråvinklen og størrelsen af skråvæggen (se bemærkning i punkt 4.6 ovenfor). For det andet skal placeringen af XY- og YZ-sektionering under scanning vælges for nøjagtigt at afspejle det eller de ønskede myotomer. (Se bemærkning i punkt 4.6 ovenfor). Bemærk dog, at formen af myotome chevrons ændres afhængigt af udviklingsstadiet, og dette skal tages i betragtning ved valg af YZ-scanninger. Endelig kan myotomer længere ind i bagagerummet eller haleområderne måles ved den beskrevne metode for at afgøre, om ændringer i myotom 17 afspejler muskelvækst i hele aksen.
Gentagne målinger afslører somitvækst
En fordel ved den beskrevne metode er den lette gentagne analyse på enkeltfisk. Individuelle embryoner og larver kan gentagne gange indlejres, måles og frigives uden at lide åbenlyse langsigtede virkninger (figur 2H). Mynotomet vokser påviseligt både i L og CSA mellem 2 og 5 dpf, hvilket fører til en jævn stigning i volumen (figur 2H). Vækst blev afbildet på denne måde mellem 1 og 8 dpf, og larver blev også frigivet efter billeddannelse og vokset til voksenalderen. Analyser længere ind i den sene larveperiode forventes at være mulige, selvom effekter af gentagen billeddannelse på fodringsadfærd skal overvåges nøje ved sammenligning med søskende, der ikke er afbildet. Det er vigtigt, at udvikling af pigmentering kan skjule billeddannelse. Mens pigmentering ikke er et problem i korrekt orienterede fisk, da melanoforstriberne ikke forhindrer de nødvendige målinger, kan pigment være mere problematisk i skråt monterede prøver. Brugen af pigmenteringsmutantlinjer, såsom roy;mitfa39, forventes, hvilket vil forlænge tidsvinduet for vækstmålinger, indtil grænserne for praktisk mulig konfokal scanningsdybde er nået.
En yderligere fordel ved den beskrevne procedure er den lette detaljerede analyse af væksten af enkeltfibre i sammenligning med deres hele myotome over korte perioder. Ved mosaikmærkning af fibre gennem DNA-injektion blev der udviklet en metode til at detektere nuklear erhvervelse og vækst i individuelle identificerede fibre over 4 timer og derefter tillade genanalyse på senere tidspunkter (figur 2I). Desuden kan væksten af hele myotomet måles over 12 timer eller mindre26 (og data vises ikke). Ved gentagne gange at måle den samme fisk elimineres interindividuel variabilitet, og et lille antal dyr kan give statistisk robuste resultater26.
Manipulationer, der ændrer somitvolumen, kan let detekteres
Den nuværende protokol gør det muligt at forhøre ændringer i muskelvækst under forskellige biologiske og fysiologiske forhold, såsom ændret fysisk inaktivitet. Anæstetisk tricain, som blokerer nerveaktionspotentialer ved at hæmme spændingsstyrede Na + -kanaler40, blev brugt til at inducere muskelinaktivitet i β-actin: HRAS-EGFP larver. Som tidligere vist26 reducerede inaktivitet i 24 timer mellem tredje og fjerde dpf i høj grad myotomvolumen, hvilket indikerer, at larvemuskelvækst er aktivitetsafhængig (figur 3A). Effekten af inaktivitet kan også undersøges ved hjælp af andre detektionsmetoder, der afslører somittens struktur, såsom mCherry-CAAX (enten i en transgen linje eller ved mRNA-injektion) eller ved nedsænkning af larver i BODPY-farvestof natten over (figur 3A). Sidstnævnte tilgang, samtidig med at behovet for at krydse fisk på transgene baggrunde eller injicere embryoner fjernes, kan ikke anvendes til gentagne målinger på grund af toksicitet af BODIPY. Således tillader den nuværende metode en reproducerbart at måle ændringer i mængden af muskelvæv.
Som beskrevet ovenfor kan genetiske mærkningsmetoder bruges til at foretage gentagne målinger af myotomvolumen, hvilket muliggør sporing af ændring i muskelstørrelse over successive dage hos individuelle fisk. Da individuelle fisk og hele lag på samme udviklingsstadium adskiller sig i absolut myotomvolumen (figur 3A; måske på grund af ægens størrelse eller sundhed), reducerer evnen til at måle væksten af hvert individ virkningerne af individuel variation ved at tillade parrede prøvestatistiske analyser. Gentagne målinger af den samme fisk reducerer antallet af fisk, der er nødvendige for at opdage effekter robust. For at illustrere denne effekt blev resultater fra analyse af væksten af hvert individ fra 3 til 4 dpf i populationer af aktive og inaktive larver sammenlignet med analyse af de samme to populationer ved kun at anvende det enkelte mål for myotomstørrelse foretaget ved 4 dpf. Fra læg til læg blev der observeret større variation i tilsyneladende reduktion af myotomstørrelse ved måling af myotomvolumen ved 4 dpf kun sammenlignet med måling af 4/3 dpf-volumen for hver enkelt person (figur 3B). Bemærk det større reduktionsinterval (68%-91%) i målingerne kun 4 dpf sammenlignet med 4/3 dpf-metoden (78%-89%) og den svage korrelation mellem de to mål. Selv om den gennemsnitlige reduktion på tværs af alle 13 biologiske replikater som forventet var ens i hver vurdering (figur 3C) på 82,62 ± 1,01 % (gennemsnit ± SEM, n = 13) for 4/3 dpf-metoden og 82,31 ± 1,92 % for 4 dpf-metoden, var den anslåede fejl med den eneste 4 dpf-metode næsten dobbelt så stor som med 4/3 dpf-metoden. Kvantificering af individuel vækst gennem gentagen måling er således den mere nøjagtige metode ved at eliminere størrelsesvariation mellem fisk inden for samme læg, som vist tidligere26. Ikke desto mindre, da der ikke blev observeret nogen signifikant forskel i reduktionen i myotomvolumen forårsaget af inaktivitet ved måling af myotomvolumen ved 4 dpf kun (figur 3C), tyder dataene på, at ~ 6-8 fisk er tilstrækkelige til at gennemsnit ud interindividuel størrelsesforskel inden for et lay. Det er klart, at når størrelsesændringer er små, foretrækkes 4/3 dpf-metoden.
Analyse af det cellulære grundlag for vækst
Myotome CSA bestemmes af muskelfibernummer og fiberstørrelse. Fiberantal kan estimeres ved at tælle antallet af hurtige og langsomme fibre på tre YZ-sektioner (YZ a, YZ m, YZp). Selvom regioner af to tilstødende myotomer er indeholdt i sådanne YZ-sektioner, som det fremgår af tilstedeværelsen af lodret myosepta (VM) i de fleste sektioner (figur 2A), afspejler disse tal nøjagtigt fibernummer. Overtælling sker ved VM'er på grund af nedtrapning af fiberpar fra hvert tilstødende segment ved VM (figur 4A). En sådan overtælling kan redegøres for ved hjælp af følgende ligning: Fibertal = Samlet fiberantal - (fibre i kontakt med VM) / 2 reference33. Desuden kan det gennemsnitlige fibervolumen bestemmes ved at dividere myotomvolumen med antallet af fibre. Vi har brugt disse analyser til at afsløre, at aktivitet styrer begge cellulære aspekter af vækst (figur 4B, C).
Det fremgår af figur 2A, at fibre varierer i størrelse på tværs af myotomet, en virkelighed, der ikke afspejles i beregnede gennemsnitlige fibervolumenmålinger. Ved at tegne omkring hver fiber af somit 17 fra to fisk blev det vist sig, at det målte fibertværsnitsareal varierede fra 28 μm 2 til 217 μm2 (figur 4D). I virkeligheden er mange fibre imidlertid vinklet skråt inden for myotomet, så sådanne CSA-målinger afspejler ikke den sande CSA for en fiber vinkelret på dens lange akse. Omvendt, på grund af de varierende vinkler af fibre i myotomet, har alle fibre, der løber i orienteringer, der ikke er justeret anteroposteriort, længder, der adskiller sig fra myotomlængden. På trods af disse forbehold, som kun kan omgås enten ved fuldstændig segmentering af myotomet i enkeltfibervolumener eller ved beregning efter måling af skråvinklen på hver fiber, giver de målte CSA'er et skøn over fiberstørrelsesdiversitet i hver fisk. For eksempel faldt individuelle fibre i CSA med inaktivitet, hvilket resulterede i et skift til venstre i den kumulative frekvenskurve med hensyn til aktive (ubedøvede) kontrollarver (figur 4E). Da inaktive fisk har ~10 færre fibre end aktive fisk (figur 4B), blev enten de 10 mindste fibre fra aktive ikke-bedøvede fisk (ud fra den antagelse, at de er de nye) eller de 10 største (som den alternative ekstrem) udeladt fra sammenligningen, som viste, at det meste tab af myotomvolumen skyldes manglende fibervækst, snarere end svigt af ny fiberdannelse (figur 4F). Samlet set viser disse data, at den beskrevne metode muliggør detaljeret undersøgelse af fysisk aktivitets rolle på dannelsen og væksten af muskelvæv.
Genindførelse af aktivitet ved elektrisk stimulering
Fysisk aktivitet er nødvendig for muskelvækst (figur 3A). En metode til at genindføre muskelsammentrækninger ved elektrisk stimulering i ellers inaktive larver, der fremkalder et stærkt kontraktilt respons, er beskrevet (figur 5A, supplerende fil 8). Selvom præcise stimuleringsparametre er beskrevet her (figur 5B) for maksimalt at aktivere muskulaturen, kan protokollen ændres (ved at ændre strømamplitude, frekvens, pulsvarighed osv.) for at kontrollere muskelaktivering og træningsdosering. Således giver den nuværende metode en kontrolleret aktivitetsstimulering med standardiseret adfærd mellem aktivitetskampe og overvinder en vigtig begrænsning af nuværende dyremodeller for motion18.
De beskrevne metoder viser potentialet i at bruge zebrafisklarver til at studere forskellige aspekter af muskelvækst (fx hyperplasi og hypertrofi). Især myogenese i zebrafisklarver har vist sig at kunne analyseres gennem farmakologisk induceret inaktivitet og elektrisk induceret kontraktilitet. Fremgangsmåden tillader undersøgelse af de molekylære mekanismer, hvormed fysisk aktivitet fører til muskelvækst in vivo.
Figur 1: Design af et stimuleringskammer til genindførelse af muskelelektrisk aktivitet til zebrafisklarver. En 6-brønds cellekulturplade udstyret med elektroder tillader vedligeholdelse af larver i brønde fremstillet inden for 2% agarosegel. Brugerdefinerede 4-brøndskamme er lavet til at skabe rektangelbrønde (dimensioner som angivet) i agarose for at opretholde position og orientering af individuelle fiskelarver og for at forhindre dem i at komme i kontakt med sølvtrådene under kraftig trækning ved elektrisk stimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Måling af muskelvolumen i levende zebrafisk α-actin:mCherry-CAAX (A,B,E) eller β-actin:HRAS-EGFP transgene larver (H,I). Larver afbildet fra lateral visning og vist dorsal til top, forreste til venstre i øverste paneler (A, B, E). (A) I 4-skivemetoden blev myotomvolumen beregnet ved at gange længden af somit 17 (L) målt mellem lodret myosepta (VM) på et XY-plan (blå pil) med gennemsnittet af tre tværsnitsarealer (CSA) målt på YZ-planer (YZm , YZa og YZp; stiplede gule linjer). (B) I Full Stack-metoden blev arealet af somit 17 myotome målt (eksempler skitseret med gult) i hver skive af en hel Z-stak af en levende zebrafisklarve, og summen af myotomale områder blev ganget med afstanden mellem skiver. (C) Høj overensstemmelse mellem 4-skive og Full Stack metoder. Farver angiver individuel β-actin: HRAS-EGFP (firkanter) eller α-actin: mCherry-CAAX (cirkler) fisk. (D) Myotomvolumen er lidt, men betydeligt, større, når det beregnes ved hjælp af 4-skivemetoden. (E) I de tilspidsede zebrafisklarver er flere forreste somitter større end bageste somitter, målt ved 4-skivemetoden. (F,G) Stærk korrelation mellem volumenmålinger foretaget ved hjælp af gennemsnittet af tre CSA-sektioner (4-skivemetode) eller en enkelt YZm CSA (2-skivemetode). p-værdier viser resultater af to tailed t-tests med samme varians (D,G) eller envejs ANOVA med Bonferroni post hoc tests (E). ns, ikke signifikant. (H) Måling af myotom 16 volumen, længde (L) og tværsnitsareal (CSA) fra 2 til 5 dpf i tre individuelle fisk (farver), der udtrykker β-actin: HRAS-EGFP og myog: H2B-mRFP. YZm-billeder af den grønne person på hvert tidspunkt er vist ovenfor. (I) Enkeltfibervækst målt ved automatiseret segmentering med konstant tærskel. En β-actin:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP fisk mosaik mærket ved injektion af et CMV:Cerulean plasmid på 1-2 cellestadiet. En enkelt Cerulean markeret fiber i somite 10 blev scannet med høj opløsning fuld XYZ stakke gentagne gange på en Zeiss LSM880. De viste billeder er repræsentative enkeltskiver (til venstre) og projektionen af det tredimensionelle segmenterede volumen (højre). Hvert datapunkt på grafen repræsenterer en enkelt scanning af den samme fiber ved 3 dpf (0 timer), efter 4 timer og ved 5 dpf (54 timer). Tredobbelte scanninger blev foretaget og segmenteret efter tidspunkt for at vise reproducerbarhed. Hvide pilespidser peger på fiberkerner; Bemærk, at to kerner tilsættes mellem 3 og 5 DPF. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Aktivitetsafhængig muskelvækst hos somit 17. (A) Hæmmende aktivitet i 24 timer ved anvendelse af tricain (pink) mellem 3 og 4 dpf reducerer myotomvolumen både i transgene linjer og i ikke-transgene fisk farvet med BODIPY sammenlignet med køretøjskontrol på søskende (blå). Volumen kvantificeret ved 4-skive metode. Symbolform angiver replikate eksperimenter fra forskellige lag (biologiske replikater). Store symboler angiver middel ± SEM-værdier. Små svage symboler viser mængden af individuelle replikate larver. (B) Sammenligning af myotomvolumenreduktion hos inaktive fisk sammenlignet med kontrolsøskende bestemt ved enkelt måling af myotomvolumen ved 4 dpf (kun 4 dpf, øvre skematisk) eller ændring i myotomvolumen mellem 3 og 4 dpf (4/3 dpf, lavere skematisk). Hvert symbol repræsenterer det gennemsnitlige volumen af myotome 17 i ~ 5 inaktive fisk fra en enkelt læg divideret med det gennemsnitlige myotom 17 volumen af ~ 5 aktive kontrolsøskende. (C) Der blev ikke observeret nogen forskel i den gennemsnitlige reduktion i muskelvækst hos inaktive fisk, når man målte med 4 dpf eller 4/3 dpf metoder. Tal inden for søjler repræsenterer det samlede antal analyserede fisk. p-værdier viser resultater af tovejs ANOVA med Bonferroni post hoc test (A) eller to tailed t-test med ulige varians (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Celleniveauændringer i muskelvækst forårsaget af inaktivitet. (A) Skematisk, der viser, hvordan overtælling sker ved VM'er på grund af dobbelttælling af tilspidsede fibre, hvor de blå og røde myotomer mødes. Bemærk, at det gennemsnitlige fiberantal er 6, men den sande middelværdi er 5,5. Det korrigerede antal giver en bedre tilnærmelse. (B,C) Fiberantal (B) og gennemsnitligt fibervolumen (C) reduceres i inaktive (lyserøde) sammenlignet med aktive (bue) larver. Symbolform angiver replikate eksperimenter fra forskellige lag (biologiske replikater). Store symboler angiver middel ± SEM-værdier. Mindre svage symboler viser værdien af individuelle replikate larver. Tal inden for søjler repræsenterer det samlede antal analyserede fisk. (D) I enkelte larver blev hver fiberprofil i myotom 17 skitseret og CSA bestemt. Felter viser middelværdi ± SEM. p-værdier viser resultater af tovejs ANOVA med Bonferroni post hoc-test (B,C) eller to-halet t-test med samme varians (D). (E,F) Kumulative frekvenskurver, der viser fiberstørrelsesfordeling i aktiv kontrol (blå) og inaktive (lyserøde) larver. Sammenligning af alle fibre (E) eller efter udeladelse af formodede spirende små eller i den alternative ekstreme ekstreme store fibre (F) viser, at fiberstørrelsesforøgelse, ikke stigning i fiberantal, primært tegner sig for aktivitetsdrevet vækst af myotomet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kort elektrisk stimulering fremkalder tetaniske muskelsammentrækninger i bedøvede zebrafisklarver . (A) Fortløbende billeder (taget fra video i supplerende fil 8), der viser, hvordan elektrisk stimulering udløser maksimale sammentrækninger af en bedøvet larve ved 3 dpf. Tidsskala i sekunder. Røde bokse angiver bevægelser i starten af tre på hinanden følgende 1 s stimuleringstog. Hvert billede er en eksponering på 40 ms. (B) Skematisk viser det elektriske stimuleringsregime, hvor der gives et 1 s tog med 200 højfrekvente, 20 V elektriske impulser hver 5. s. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Skemaer over fangede billeder af perfekt (øverst til venstre) og ufuldkomment monterede larver med hensyn til mikroskopet XYZ referenceramme (sorte akser). Myotome (grøn), notochord (gul), neuralrør (tan), målte myotomale parametre (rød), målte notokordparametre (sorte pile) og mulige eller faktiske fiskerotationer (blå). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Skærmbillede, der viser somitlængdemåling fra XY-billeder i ZEN. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Skærmbillede, der viser CSA-måling fra YZ-billeder i ZEN. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Skærmbillede, der viser somitlængdemåling fra XY-billeder i Fiji / ImageJ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil: Skærmbillede, der viser ekstraktion af kalibreringsparametre for YZ-billeder fra ZEN. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Skærmbillede, der viser kalibrering af YZ-billeder i Fiji / ImageJ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Skærmbillede, der viser CSA-måling fra YZ-billeder i Fiji/ImageJ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: Repræsentativ video, der viser muskelsammentrækning fremkaldt af direkte elektrisk stimulering (længde 1 s) af en tricainbedøvet 3 dpf larve. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporterer vi en metode til nøjagtig og effektiv estimering af muskelvolumenet hos levende zebrafisklarver i stadier eller i genetiske varianter, hvor pigmentering ikke er en stor hindring for billeddannelse, og når forbigående anæstesi og / eller immobilisering tolereres godt. Mens vi har anvendt laserscanning af konfokal mikroskopi, er de beskrevne tilgange anvendelige til spinding af diskkonfokal eller lysarkmikroskopi og til enhver anden metode, der skaber stakke af billeder på forskellige fokusplaner. En række stadig mere sofistikerede tilgange til vævsstørrelse og estimering af celleindhold beskrives. Hver metode har fordele og begrænsninger, som vi viser kan kvantificeres. En væsentlig begrænsning i at studere vævsvækst er vanskeligheden ved at analysere vækstændringer i realtid, da vækstraterne ændres som reaktion på en række molekylære eller subcellulære hændelser katalyseret af akut administrerede stimuli. Desuden kan individuel variation skabe problemer, når separate individer sammenlignes. Den nuværende tilgang gør det muligt at måle vævsvækst over perioder på mindre end en dag hos enlige levende individer. Anvendelse af fremgangsmåden kan overvejes inden for den korte tidshorisont.
De beskrevne metoder muliggør analyser, der hidtil ikke har været praktisk gennemførlige. Ved hjælp af 4-skivemetoden kan billeddannelsesdelen af muskelvækstanalysen afsluttes på en prøvestørrelse på ca. 20 fisk inden for en time af en uddannet operatør. Dette står i skarp kontrast til den konventionelle Full Stack-metode, som tager mindst 3 timer for det samme antal fisk (dvs. tre gange længere). Hvis der kræves billeder i høj opløsning til efterfølgende subcellulære analyser, kan Full Stack-metoden let kræve 30 minutter pr. fisk, hvilket gør vækstassays af kohorter af dyr på et lignende udviklingsstadium umulig. I modsætning hertil tillader 2- eller 4-skivemetoderne hurtig billedoptagelse i høj kvalitet. Når vi går over til overvejelse af billedanalyse, er fordelene ved 2- eller 4-skivemetoden til at spare operatørtid (i mangel af automatiseret billedsegmentering) i forhold til Full Stack-metoden enorme. Hver fisk kræver ca. 20 minutter til Full Stack-analyse, men kun 3-4 minutter til 4-skive analyse. Operatørtiden kan bevares yderligere ved hjælp af den næsten lige så nøjagtige 2-skive-metode. Den beskrevne metode er således effektiv og øger dermed fleksibiliteten i eksperimentelt design.
Den største begrænsning ved 4- eller 2-skivemetoderne er, at begge metoder er estimater på grund af den overlappende chevronform af somitter (f.eks. Mængden af regioner i to nærliggende somitter (f.eks. Myoteom 16 og 17). Det er vist, at dette kan overvurdere det faktiske myotome 17 volumen med omkring 2%, afhængigt af præcis hvor YZ skiver blev valgt. Desuden kan manuel sporing af somitgrænserne under målinger bidrage til variationer i estimater, selv om der kun blev fundet en lille forskel mellem eksperimentatorer (data ikke vist). Målefejl kan løses ved hjælp af tærskel-, filtrerings- og segmenteringsalgoritmer for at erhverve overfladeareal på en mere objektiv og reproducerbar måde. Der vil dog stadig være behov for tilpasninger for at tage højde for variationer i baggrundsfluorescensen (f.eks. på grund af indlejring og/eller tykkelse af LMA) og ekspressionsniveauet for fluorescensproteiner hos den enkelte larve over tid. Bemærk, at sådanne automatiserede målinger vil være endnu mere udfordrende, hvis der anvendes en ikke-muskelspecifik reporter, såsom linjen β-actin:HRAS-EGFP . Ikke desto mindre kan unøjagtigheden under mange omstændigheder, for eksempel når man sammenligner virkningerne af manipulationer mellem fisk, der udsættes for forskellige behandlinger, der forventes at påvirke alt muskelvæv, være uden betydning. Men hvis der kræves maksimal nøjagtighed til sammenligning med fiber- eller nukleare tal, der udelukkende tælles fra myotom 17, for eksempel, kan 'skive' -metoderne forbedres. Dette kan opnås enten ved at bruge den vanskelige Full Stack-metode, ved matematisk korrektion ved at gange de målte 4-skivevolumener med 0,98 eller ved at flytte placeringen af YZ CSA-scanningerne bagud for mere præcist at afspejle den sande CSA for myotome 17.
En anden begrænsning af metoden er dens følsomhed over for fiskens monteringsorientering. I praksis kan dygtige operatører orientere fisk inden for rimelige grænser det meste af tiden, selv når de arbejder hurtigt for at indlejre mange prøver. Ændringer af udstyr på mikroskopstadiet kan overvejes, der gør det muligt at korrigere yaw og roll inden scanning. Uden et sådant apparat beskrives en metode til kvantificering af fejlorientering, som derefter kan bruges til at korrigere de målte volumener. Selv om fejlorientering øger variabiliteten i målt volumen og dermed reducerer chancen for at observere små effektstørrelser, vil en sådan variation i mange situationer påvirke kontrol- og eksperimentelle prøver på samme måde. Så falske positive resultater er usandsynlige, hvis operatørerne er opmærksomme på problemet.
De beskrevne metoder er oprindeligt blevet anvendt til at analysere rollen som elektrisk aktivitet i muskelvækst, et emne med en lang analysehistorie inden for en lang række arter (gennemgået i18). Til dette formål beskrives enkle metoder til at blokere endogent udløst aktivitet detaljeret og erstattes med kontrolleret mønstret elektrisk stimulering i zebrafisklarven. Fordelene ved denne tilgang er fjernelsen af neurale feedbackkontroller40, eliminering af virkningerne af ændret ernæring og evnen til at analysere cirkadiske virkninger på selve væksten snarere end på vækstproxyer, såsom proteinomsætning26. Da forskellige mønstre af elektrisk aktivitet udløser forskellige muskelresponser, der regulerer fibertype, størrelse og metabolisme 41,42,43,44,45,46,47,48, åbner de nuværende metoder zebrafisken for sådanne analyser.
De beskrevne metoder tilbyder en række teknikker, hvormed mange aspekter af muskelfysiologi, cellebiologi og patologi kan analyseres i hidtil uset tidsmæssig og rumlig opløsning ved at drage fordel af den relativt uudforskede zebrafisk. De nuværende tilgange kunne klart anvendes på andre arter, regioner i kroppen og udviklingsstadier. Den hurtige tidlige vækst af zebrafisklarver gør påvisning af akutte virkninger af manipulationer på vævsvækst og morfogenese særligt attraktive undersøgelsesområder. Desuden har zebrafiskmusklen vist sig at dele forskellige vækstmekanismer og kontroller med pattedyr. Mens zebrafisk er hvirveldyr, der bevarer mange aspekter af muskelmolekylær genetik, celle- og udviklingsbiologi med mennesker, er der også betydelige forskelle i kontrollen med muskelvækst. For eksempel er langsomme og hurtige fibertyper tydeligere rumligt adskilt i fisk, og innerveringen af muskler viser forskelle. Desuden skal man huske på, at vi hidtil kun har været i stand til at analysere de tidlige udviklingsstadier. Der er planlagt lignende analyser på et senere stadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne står i dyb gæld til indsatsen fra Hughes-laboratoriemedlemmerne Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin og Vladimir Snetkov for udvikling af de beskrevne protokoller og til Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau og Peter Currie for at dele plasmider eller zebrafisklinjer. SMH er en medicinsk forskningsråd (MRC) videnskabsmand med programbevilling G1001029, MR / N021231/1 og MR / W001381/1support. MA havde et MRC-ph.d.-uddannelsesprogram ph.d.-studerende fra King's College London. Dette arbejde nød godt af det trigonometriske input fra David M. Robinson, lærd, mentor og ven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
