Summary
Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.
Abstract
Een aantal methoden kan worden gebruikt om individuele cellen in het hele lichaam van levende embryonale, larvale of juveniele zebravissen te visualiseren. We laten zien dat levende vissen met fluorescerend gemarkeerde plasmamembranen kunnen worden gescand in een confocale laserscanmicroscoop om het volume spierweefsel en het aantal aanwezige spiervezels te bepalen. Efficiënte benaderingen voor het meten van het aantal en de grootte van cellen bij levende dieren in de loop van de tijd worden beschreven en gevalideerd tegen moeilijkere segmentatiemethoden. Er worden methoden beschreven die de controle van spierele elektrische en dus contractiele activiteit mogelijk maken. Verlies van skeletspiercontractiele activiteit verminderde de spiergroei sterk. Bij larven wordt een protocol beschreven dat herintroductie van patroongevoede elektrisch opgewekte contractiele activiteit mogelijk maakt. De beschreven methoden minimaliseren het effect van interindividuele variabiliteit en maken analyse mogelijk van het effect van elektrische, genetische, medicamenteuze of omgevingsstimuli op een verscheidenheid aan cellulaire en fysiologische groeiparameters in de context van het levende organisme. Langdurige follow-up van de gemeten effecten van een gedefinieerde interventie in het vroege leven op individuen kan vervolgens worden uitgevoerd.
Introduction
Gereguleerde weefselgroei, bestaande uit toename van het aantal cellen (hyperplasie) en /of celgrootte (hypertrofie), is een cruciale factor in ontwikkeling, regeneratie en ecologische en evolutionaire aanpassing. Ondanks de enorme vooruitgang in moleculair genetisch begrip van zowel cel- als ontwikkelingsbiologie in de afgelopen decennia, staat het mechanistische begrip van de regulatie van weefsel en orgaangrootte nog in de kinderschoenen. Een reden voor deze lacune in kennis is de moeilijkheid om weefselgroei in levende organismen te kwantificeren met de nodige ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid.
Verschillende aspecten van de groei van hele organismen kunnen herhaaldelijk in de loop van de tijd worden gemeten, waarbij groeicurven voor elk individu 1,2,3,4,5 worden onthuld. Steeds geavanceerdere scanmethoden, zoals dubbele röntgenabsorptie (DXA), computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), maken het mogelijk de groei van hele organen en andere lichaamsregio's (bijvoorbeeld individueel geïdentificeerde skeletspieren) bij afzonderlijke individuen, zowel menselijke als in modelorganismen, te volgen 6,7,8,9,10 . Deze methoden hebben echter nog niet de resolutie om individuele cellen te onthullen en dus zijn de verbanden tussen cellulair gedrag en groei op weefselniveau moeilijk te onderscheiden. Om dergelijke verbanden te leggen, hebben traditionele studies vaak vertrouwd op cohorten van vergelijkbare individuele dieren, waarvan er een paar op opeenvolgende tijdstippen worden geofferd en vervolgens in cytologisch detail worden geanalyseerd. Dergelijke benaderingen vereisen het gemiddelde van de waargenomen veranderingen over groepen van (bij voorkeur vergelijkbare, maar niettemin variabele) individuen en lijden dus aan een gebrek aan temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het moeilijk is om gecorreleerde gebeurtenissen op cellulair niveau te vinden die wijzen op oorzaak en gevolg.
Studies op ongewervelde modelorganismen, aanvankelijk in C. elegans en D. melanogaster, hebben deze problemen omzeild door optische microscopie te ontwikkelen om cellulaire resolutie te bereiken en nauwkeurig de groei in de loop van de tijd te meten bij individuele individuen. Dergelijke studies hebben opvallend invariant cellijngedrag onthuld in de groei van deze kleine modelorganismen 11,12,13,14,15,16,17. Veel dieren, waaronder alle gewervelde dieren, hebben echter onbepaalde cellijnlijnen en beheersen weefselgroei door mysterieuze feedbackprocessen die dienen om het genetisch gecodeerde groeiprogramma om te zetten in een functioneel driedimensionaal organisme met al zijn samenstellende weefsels en organen die qua grootte op de juiste manier zijn afgestemd. Om deze complexe groeiprocessen te begrijpen, is het wenselijk om hele weefsels of organen in de loop van de tijd in afzonderlijke individuen in beeld te brengen die experimenteel kunnen worden gemanipuleerd door genetische, farmacologische of andere interventies op een tijdstip naar keuze en het effect vervolgens geanalyseerd.
Elke gewervelde skeletspier heeft een gedefinieerde grootte, vorm en functie, en goed gekarakteriseerde interacties met aangrenzende weefsels, zoals bot, pees en zenuwen. Sommige spieren zijn klein, liggen net onder de huid en zijn daarom goede kandidaten voor hoge resolutie beeldvormingsstudies. Net als de meeste organen groeit elke spier gedurende het embryonale, postnatale en juveniele leven, voordat het een stabiele volwassen grootte bereikt. Spieren hebben echter ook een uniek vermogen om van grootte te veranderen tijdens het volwassen leven, afhankelijk van gebruik en voeding18, en deze eigenschap heeft een grote invloed op de conditie van het organisme, sportprestaties en onafhankelijk leven. Verlies van spiermassa en functie op oudere leeftijd, sarcopenie, is een kwestie van toenemende zorg voor samenlevingen die worden geconfronteerd met een vergrijzende bevolkingvan 19,20,21.
Wij en anderen hebben ons gericht op de groei van gedefinieerde blokken skeletspierweefsel in het segmentaal herhalende lichaam van zebravislarven, als een schijnbaar gesloten systeem met enkele honderden cellen waarin weefselgroei, onderhoud en reparatie kunnen worden waargenomen en gemanipuleerd 22,23,24,25,26. Hoewel enig kwantitatief werk eerder is gemeld 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, is er geen gedetailleerde en gevalideerde methode beschikbaar voor het meten van spiergroei in cellulair detail in individuele gewervelde organismen in de loop van de tijd. Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het uitvoeren van dergelijke herhaalde metingen, samen met validatie, en een voorbeeld van het gebruik ervan om veranderingen in zowel hypertrofische als hyperplastische groei te analyseren als reactie op veranderde elektrische activiteit wordt gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het beschreven onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en onder geschikte licenties van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken in overeenstemming met de Animal (Scientific Procedures) Act 1986 en daaropvolgende wijzigingen. Embryo's/larven moeten bij 28,5 °C worden grootgebracht totdat de gastrulatie is voltooid, maar mogen dan bij 22-31 °C worden gehouden om de ontwikkelingssnelheid te beheersen. Vissen kunnen bij kamertemperatuur worden gescand of gestimuleerd.
1. Verdoof zebravislarven
- Kruis geschikte fluorescerende reporter volwassen vissen zoals Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referentie36 of Tg(α-actine:mCherry-CAAX)pc22Tg referentie37 en verzamel embryo's zoals beschreven38.
- Op het moment van keuze, zoals 2 dagen na de bevruchting (dpf), verdoof embryo's kort met behulp van Tricaine-bevattend vismedium (viswater of E3-medium) en screen op EGFP of mCherry onder een fluorescentiemicroscoop, zoals een Leica MZ16F. Als men veel embryo's heeft, selecteer dan die met het helderste signaal. Breng embryo's onmiddellijk na screening terug naar normaal vismedium.
2. Montage vis voor confocale scanning
- Schakel het confocale laserscansysteem en lasers in om het systeem gedurende 30-60 minuten te laten stabiliseren.
OPMERKING: Hier gebruikten we een Zeiss LSM 5 Exciter-microscoop met rechtopstaande materiaalstandaard (die de werkafstand verbetert) uitgerust met een 20x / 1,0 W waterdompelingsobject. - Bereid 1% low melting agarose (LMA) en bewaar in een warmteblok van 37 °C voor herhaald gebruik in een buis van 1,5 ml. Om hitteschok te voorkomen, verwijdert u de LMA-aliquot uit het warmteblok en laat u deze afkoelen tot net boven de instelling voordat u deze op de larve aanbrengt, test u tegen de huid om de juiste temperatuur te beoordelen, zoals bij het beoordelen van de temperatuur van babyvoedingsmelk.
- Selecteer vissen die moeten worden gemonteerd en verdoof elke vis tijdelijk om de beurt met Tricaine (0,6 mM in vismedium).
- Neem een petrischaaltje met een diameter van 60 mm dat is bedekt met een laag van 1% agarose en plaats het op het podium van een ontleedmicroscoop.
- Breng de larve met een 1 ml plastic Pasteur pipet over op de 60 mm gecoate petrischaal en verwijder zoveel mogelijk overgebracht medium. Plaats vervolgens, nog steeds met behulp van de Pasteur pipet, 5 tot 10 druppels LMA op de vis en positioneer snel horizontaal in lateraal zicht met een tang (of een vuurgepolijste naald van fijn glas) voordat de LMA uitzet. Voor optimale beeldvorming is het wenselijk om de larve dicht bij het bovenoppervlak van de LMA te plaatsen.
- Als alternatief, met behulp van een 1 ml plastic Pasteur-pipet, verzamel de larve met zo min mogelijk vismedium en breng de larve over in de aliquot van gekoelde LMA. Laat de larve 5 s zinken om volledig omringd te worden door LMA. Haal vervolgens de larve op en breng deze in een druppel LMA over op de met agarose gecoate petrischaal. Oriënteer en positioneer de larve snel zoals hierboven beschreven.
- Oriënteer de larve met zowel zijn anteroposterior als dorsoventrale assen binnen 10° van het horizontale vlak (zie de opmerking "Over fout en de correctie ervan", punt 4.6 hieronder).
- Als de larve niet correct horizontaal in de buurt van het oppervlak van de agarose-druppel is gemonteerd, verwijder en herinfundeer dan opnieuw. Larven kunnen gemakkelijk worden opgehaald door voorzichtige zuigkracht met behulp van een microfijne 1 ml plastic Pasteur-pipet en LMA kan voorzichtig worden verwijderd met Kimwipes. Oefening baart echt kunst in de montageprocedure; breng een middag door met het inbedden van enkele onbelangrijke larven voordat je dit op een echt experiment probeert.
OPMERKING: Over microscoopontwerp: Veel laboratoria gebruiken omgekeerde confocale microscopen voor beeldvorming via een coverslip. We hebben ontdekt dat het herhaaldelijk insluiten en verwijderen van vissen die in agarose onder een deklip worden gehouden voor observatie in een omgekeerde microscoop leidt tot een groter verlies van monsters tijdens herhaald scannen dan in de beschreven procedure met een rechtopstaande microscoop. Om deze reden wordt het gebruik van een rechtopstaand systeem aanbevolen, indien beschikbaar. Niettemin is een sleutel tot gegevens van hoge kwaliteit de juiste selectie en het gebruik van objectieve en scanparameters, een onderwerp dat te groot is om hier te bespreken.
- Als de larve niet correct horizontaal in de buurt van het oppervlak van de agarose-druppel is gemonteerd, verwijder en herinfundeer dan opnieuw. Larven kunnen gemakkelijk worden opgehaald door voorzichtige zuigkracht met behulp van een microfijne 1 ml plastic Pasteur-pipet en LMA kan voorzichtig worden verwijderd met Kimwipes. Oefening baart echt kunst in de montageprocedure; breng een middag door met het inbedden van enkele onbelangrijke larven voordat je dit op een echt experiment probeert.
3. Confocale scanning
- Wanneer LMA is ingesteld, overspoelt u het gerecht met ongeveer 10 ml Tricaine-bevattend vismedium. Als u van plan bent om confocale stapels te vangen, laat de gemonteerde vis dan minstens 10 minuten rusten voordat u overgaat tot scannen, omdat er enige agarose zwelling optreedt.
- Laad de monsterschaal in het stadium van het confocale systeem, lokaliseer de larve en concentreer u op de gewenste somiet. Somite 17 kan worden gekozen vanwege het gemak van lokalisatie in de buurt van de anale opening en het gemak van beeldvorming. Controleer door somites van anterior te tellen.
OPMERKING: De eerste somiet is vergroeid achter het oor en heeft geen voorste rand, maar kan gemakkelijk worden waargenomen met dwarsgestreepte spiervezels. - Stel in alsof je een Z-stack wilt vangen door de bovenkant (d.w.z. net boven de huid) en de onderkant (d.w.z. net onder het notochord) te definiëren, zodat de hele somiet wordt opgenomen, zelfs als de vis enigszins scheef is gemonteerd). Zowel de linker- als de rechterkant kunnen naar wens worden vastgelegd. Dit zorgt ervoor dat alle snelle YZ-scans de gewenste regio('s) vastleggen.
- Leg een XY-afbeelding als volgt vast. Oriënteer het scangebied ten opzichte van de vis, zoals de confocale software toestaat. Plaats de vis met de anteroposterior-as evenwijdig aan de afgebeelde X-as en de dorsoventrale as parallel aan de Y-as met somiet 17 in het midden van het veld zoals weergegeven in aanvullend bestand 1. Focus op een middenvlak in het bovenste myotoom waarin de hele epaxiale en hypaxiale somiethelften samen met de verticale en horizontale myosepta zichtbaar zijn en een XY-beeld met hoge resolutie vastleggen. Vergeet niet om de afbeelding een naam te geven en op te slaan.
- Leg een of meer YZ-afbeeldingen als volgt vast. In de representatieve resultaten (hieronder) wordt de nauwkeurigheid van 2-delige en 4-delige methoden vergeleken. In de 2-slice benadering worden enkele XY - en YZ-scans gebruikt. In de 4-slice benadering worden drie YZ-scans gemiddeld om een nauwkeuriger schatting van het myotoomvolume te geven. Indien vereist door de confocale software, heroriënteert u het scanveld.
- Teken een precies dorsale tot ventrale lijn over de gekozen somiet loodrecht op de anteroposterior-as van de vis op een geselecteerde anteroposteriorpositie. Voer een Z-stack lijnscan uit.
- Herhaal de YZ-lijnscan drie keer op gedefinieerde anteroposteriorposities langs het geselecteerde myotoom om YZa, YZm en YZp vast te leggen. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 2A. Geef deze afbeeldingen een naam en sla deze op samen met de bijbehorende XY-afbeelding .
OPMERKING: Bij selectie van YZ-vlakken : Het myotoom is V-vormig en de vorm verandert tijdens de groei. Om de meest nauwkeurige beoordeling van myotoom 17 volume te verkrijgen met de 4-slice methode, plaatst u YZa op de voorste punt van het myotoom, YZp op de achterste uiteinden van het myotoom op dorsale en ventrale uitersten, en YZm halverwege tussen YZa en YZp. Ervan uitgaande dat de somiet gelijkmatig taps toeloopt, zal het gemiddelde van de metingen van elke YZ-sectie het myotoom als geheel vertegenwoordigen. Voor de 2-delige methode moet de enkele YZ-scan worden geplaatst aan het achterste uiteinde van het horizontale myoseptum, dat ruwweg overeenkomt met het anteroposterior centrum van het myotoom van belang (zoals YZm). Als alternatief kan een set van drie YZ-secties worden genomen op de voorste, middelste en achterste van het horizontale myoseptum, maar, zoals hieronder weergegeven, zal een dergelijke meting het myotoomvolume iets over- of onderschatten (voor respectievelijk rostrale en caudale somiten als gevolg van myotome tapering). Fundamenteel is consistentie in de positionering van YZ-plakvlak (en) tussen vissen en experimenten de sleutel tot reproduceerbaarheid.
4. Analyse
- Omdat het myotoom langs de vis op een graduele manier van grootte verandert, werk dan altijd met hetzelfde somiet in vergelijkende studies.
- Om het myotoomvolume te meten en te berekenen, gebruikt u de confocale software (zoals de .lsm-bestanden die zijn gemaakt met Zeiss ZEN-microscoopsoftware) of open-source universele beeldanalysesoftware, zoals Fiji / ImageJ.
OPMERKING: Als u bestandsindelingen wijzigt, zorg er dan voor dat de Z-stapgrootte correct wordt overgedragen, omdat niet alle software propriëtaire confocale bestandsindelingen correct kan lezen. Als u bijvoorbeeld een ZEN-lijnscanafbeelding in Fiji wilt importeren, gebruikt u eerst de opdracht Bestand/exporteren om te exporteren zoals .tif in het venster Afbeelding met volledige resolutie - indeling met één vliegtuig en importeert u vervolgens in Fiji. Hoewel YZ scan.lsm direct in Fiji kan worden geopend, worden de resulterende YZ-afbeeldingen over het algemeen gecomprimeerd in de Z-dimensie vanwege een onjuiste evaluatie van de Z-stapgrootte. - Analyse met ZEN
- Open eerst de XY scan.lsm-bestanden in ZEN. Ga naar het tabblad Afbeeldingen en selecteer het gereedschap Lijn. Teken een lijn tussen de twee verticale myosepta van somiet 17 over de gehele myotoomlengte (evenwijdig aan de anteroposterior-as van de vis). Vink het vakje M aan om de waarden van de meting weer te geven (Lengte = 89,71 μm, zie Aanvullend bestand 2).
- Open de YZ scan.lsm-bestanden. Selecteer op het tabblad Afbeeldingen het gereedschap Geslotenzier . Teken rond de omtrek van het myotoom. Eenmaal voltooid, vinkt u het M-vakje aan, dit zou de waarde van de meting onthullen (Gebied = 11980,01 μm2, zie Aanvullend bestand 3).
- Noteer de waarden van elke meting handmatig in een spreadsheet. Gemiddelde van de CSA-metingen zoals vereist. Volume van het myotoom kan worden berekend als Volume = Myotoomlengte x CSA, d.w.z. 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
- Analyse met Fiji/ImageJ
- Open de XY scan.lsm-bestanden in Fiji/ImageJ. Controleer of XY-afbeeldingen die direct in Fiji zijn geopend, correct zijn gekalibreerd in schaal, zoals ze zouden moeten zijn.
- Selecteer het gereedschap Rechte lijn in de pictogrammen. Teken een lijn over de lengte van somiet 17 zoals beschreven in stap 4.3.1. Stel meetparameters in door naar Analyseren te gaan, selecteer vervolgens Metingen instellen... en vink de volgende vakjes Gebied en Weergavelabel aan. Als u wilt meten, drukt u op de sneltoets M of gaat u naar het menu Analyseren en selecteert u Meten. Een resulterend pop-upvenster bevat alle meetwaarden (d.w.z. Lengte = 90,023 μm; zie Aanvullend bestand 4). De resultaten kunnen worden opgeslagen in de vorm van .csv en worden geopend in Microsoft Excel of iets dergelijks voor latere analyse.
- Als u CSA op de YZ-afbeeldingen wilt meten, opent u YZ-afbeeldingen in .tif indeling zoals beschreven in stap 4.2.
- Kalibreer de YZ -.tif afbeeldingen omdat ze niet worden gekalibreerd wanneer ze worden geëxporteerd. Parameters voor de kalibratie kunnen in ZEN worden verkregen door naar de Info van de geselecteerde afbeeldingen te gaan: noteer de waarden Scaling X (0,489 μm) en Scaling Z (0,890 μm; zie Supplemental File 5). Vervolgens, terwijl de afbeeldingen open zijn in Fiji, gaat u naar Afbeelding en selecteert u Eigenschappen .... Invoer 0,489 μm voor de pixelbreedte en pixelhoogte en 0,890 μm voor de Voxel-diepte. Schakel het selectievakje Globaal in om de kalibratie universeel toe te passen als herhaalde meting van YZ-afbeeldingen wordt verwacht (zie Aanvullend bestand 6).
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle YZ-afbeeldingen zijn vastgelegd met dezelfde scanparameters; start Fiji/ImageJ opnieuw op of wijzig de kalibratiewaarden als een nieuwe kalibratieset vereist is. - Als u de CSA van de gekalibreerde YZ-afbeeldingen wilt meten, selecteert u het gereedschap Polygoonselecties in de pictogrammen. Teken rond de omtrek van de somiet en druk op M om de waarden van de meting weer te geven (Area = 11980.395 μm2; zie Supplemental File 7). Volume van het myotoom kan worden berekend als Volume = Myotoomlengte x CSA, d.w.z. 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
- Herhaal de metingen op de andere XY - en YZ-afbeeldingen . Het wordt aanbevolen om dezelfde software te gebruiken voor alle metingen binnen een experimentele reeks voor consistentie. De volumeschatting van elke software is vergelijkbaar, maar niet identiek vanwege de verschillende tekengereedschappen, d.w.z. ZEN = 1,074 × 106 μm3 en Fiji / ImageJ = 1,079 × 106 μm3. De groei van het myotoom tussen twee tijdspunten (d.w.z. 3 tot 4 dpf) kan worden berekend als: (Volume 4 dpf - Volume 3 dpf)/ Volume 3 dpf × 100%.
OPMERKING: Over fout en de correctie ervan. Tijdens het monteren moet de vis worden georiënteerd met zijn sagittale vlak (d.w.z. de anteroposterior en dorsoventrale assen) zo dicht mogelijk bij horizontaal, om respectievelijk gier en rol te voorkomen. Dit komt omdat zowel de myotome lengte L gemeten uit de XY-scan als de CSA gemeten met een YZ-scan worden overschat als de vis gier (rotatie rond de dorsoventrale as) vertoont als gevolg van schuine anteroposterior montage. Pitch of roll tijdens de montage mogen geen invloed hebben op de metingen na het scannen zoals beschreven in rubriek 3. Niettemin vermindert dorsoventrale rotatie (rol) de beeldkwaliteit. Eenvoudige trigonometrie toont aan dat tot 10° gier 3% fout in volumemeting zal geven, zoals gemeten L en CSA elke toename in verhouding tot (cosq)-1, waarbij q de hoek is weg van anteroposterior horizontaal (gier). 15° en 20° korting geven respectievelijk 7% en 13% overschattingen van het volume.
Omdat het notochord cilindrisch is, kan opname van het hele notochord in de YZ-scan worden gebruikt om de hoek en omvang van obliquiteit te berekenen uit de oriëntatie en grootte van de grote en kleine assen en daardoor de gemeten L en CSA te corrigeren om de nauwkeurigheid te maximaliseren. Gecorrigeerde CSA = Gemeten CSA x Notochord mineur as/Notochord majeur as. Gecorrigeerd l = gemeten L x notochord kleine as/notochord as in microscoop Z richting.
Een verdere overweging maakt een aanvullende correctie van L. mogelijk. Naarmate het myotoom groeit, scheef het in het coronale vlak (normaal voor de dorsoventrale as) zodat het mediale myotoom iets anterieur is ten opzichte van het laterale myotoom. Gezien vanaf het dorsaal vormen de verticale myosepta aan de linker- en rechterkant een brede chevron die naar voren wijst. Als de gier laag is, heeft deze morfologie geen invloed op de meting van L. Maar als de geeuw significant is, wordt trigonometrische correctie een uitdaging en een betere benadering is om True L direct te meten door de XYZ-coördinaten te schatten van de twee punten waar de voorste en achterste verticale myosepta het notochord ontmoeten bij het horizontale myoseptum. Eenvoudige trigonometrie maakt het mogelijk om true L van deze coördinaten te berekenen als L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]. Zwakke punten van deze laatste benadering zijn dat a) de selectie van de punten kan variëren met de operator en b) er geen visueel verslag van de gekozen punten wordt bewaard. Deze overweging heeft geen invloed op csa-correctie.
5. Optionele methode: verwijder en introduceer spier elektrische activiteit opnieuw
- Maak een stimulatiekamer.
- Neem een putplaat van 6 x 35 mm, maak twee kleine openingen (<5 mm in diameter, 1 cm uit elkaar) aan elke kant van elke put (zie figuur 1) met behulp van een smalle soldeerbout.
OPMERKING: Behandel de hete soldeerbout met zorg en werk indien gewenst in een zuurkast om inademing van damp te voorkomen. - Rijg een paar zilveren of platina draden (~20 cm lang) door de openingen van elke put (zie figuur 1). Herbruikbaar lijmmateriaal (bijv. BluTack) kan in de buurt van de openingen worden aangebracht om de draden op hun plaats te houden en een scheiding van 1 cm tussen de draden te garanderen (zie figuur 1).
- Neem een putplaat van 6 x 35 mm, maak twee kleine openingen (<5 mm in diameter, 1 cm uit elkaar) aan elke kant van elke put (zie figuur 1) met behulp van een smalle soldeerbout.
- Bij 3 dpf, splits de vis in drie condities: vismedium Control, Inactive en Inactive+Stim.
- Voor inactieve en inactieve+stimgroepen verdooft u larven 72 uur na de bevruchting (hpf) met Tricaine (0,6 mM).
OPMERKING: Na referentie38 worden bevroren aliquots van tricaïnebouillon ontdooid en verdund (40 μL/ml vismedium, tot een eindconcentratie van 0,6 mM) voordat ze aan vis worden toegevoegd. Voeg tricaïne niet rechtstreeks toe aan het water met vis, omdat sommige vissen hoge doses kunnen krijgen. Tricaine-bouillon moet binnen een maand worden gebruikt en nooit opnieuw worden ingevroren. - Voor het vismedium Controlevissen, laat ze onverdoofd.
- Voor inactieve en inactieve+stimgroepen verdooft u larven 72 uur na de bevruchting (hpf) met Tricaine (0,6 mM).
- Bereid op geselecteerde tijdstippen na het begin van de blootstelling aan tricaïne (d.w.z. bij 80 pkf) de Inactive+Stim-groep voor op stimulatie.
- Bereid 60 ml 2% agarose (1,2 g agarosepoeder in 60 ml vismedium) en smelt volledig met behulp van de magnetron, koel af, voeg tricaine toe en giet 4 ml in elk putje van de stimulatiekamer (figuur 1).
- Voeg onmiddellijk op maat gemaakte 4-well kammen toe tussen de elektroden (gemaakt door kunststoffen (bijv. polypropyleen) van de gewenste afmetingen uit te snijden en aan elkaar te plakken met behulp van secondelijm; zie figuur 1). Wacht 10 minuten voordat de gel is uitgehard. Verwijder kammen voorzichtig om vier rechthoekige putten te maken.
- Vul elke put met tricaïnewater en plaats een enkele verdoofde Inactive+Stim-larve in elke put met behulp van een micropipette, met hun anteroposterior-as loodrecht op de elektroden (zie figuur 1).
- Controleer onder de ontleedende fluorescerende microscoop of elke vis volledig verdoofd is in elke put van de kamer.
- Sluit een instelbare elektrofysiologische patroongenererende stimulator aan op de kamer via een polariteitsregelaar, met behulp van krokodillenklemmen die zijn aangesloten op elk van de elektroden aan één kant van de kamer (zie figuur 1).
OPMERKING: De polariteitsregelaar wordt gebruikt om de polariteit om de 5 s om te keren, om elektrolyse en corrosie van de elektroden te voorkomen. - Stimuleer vissen. Bijvoorbeeld, 1s met een trein van 200, 20 V pulsen, met 0,5 ms pulsduur en 4,5 ms pulsscheiding, eenmaal per 5 s geeft een effectief herhaald-tetanisch contractieweerstandsregime.
- Controleer regelmatig onder de microscoop om te bevestigen dat de vissen worden gestimuleerd; het voorbeeld elektrische stimulus moet een zichtbare bilaterale samentrekking en lichte beweging induceren, eens in de 5 s.
- Voor een weerstands-/krachtregime, stimuleer de vis met een hoge frequentie gedurende een aanval van 5 minuten, drie keer, waarbij elke aanval wordt gescheiden door 5 minuten rust.
OPMERKING: Terwijl vissen aan de ene kant van de kamer rusten, kunnen de krokodillenklemmen worden aangesloten op het elektrodenpaar aan de andere kant van de kamer en die extra vissen stimuleren. - Verwijder na stimulatie voorzichtig vissen uit elke put door ze voorzichtig uit te spoelen met een plastic pipet en keer terug naar de broedmachine in vers tricaïnebevattend vismedium.
- Giet het tricainewater uit de kamer weg en gebruik een tang om rond te snijden en de agarose uit elke put te verwijderen. Spoel de putjes af met kraanwater en laat drogen.
OPMERKING: Als u zilverdraadelektroden gebruikt, kan zich af en toe zilveroxide ophopen op het oppervlak van de draad na een stimulatie-experiment. Omdat zilveroxide minder geleidend is dan zilver, moet u, om de reproduceerbaarheid te behouden, zilveroxide voorzichtig van de draad wrijven met Kimwipes voordat u de opstelling opnieuw gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een snelle en nauwkeurige meting van het somietvolume
Een methode voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling en volumetrische analyse die de snelle meting van spiergroei in zebravislarven mogelijk maakt, wordt beschreven. Spiergrootte kan worden gemeten bij levende dieren met behulp van vissen die op hun plasmamembranen zijn gelabeld met een membraangerichte GFP (β-actine: HRAS-EGFP) of mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). Larven werden tijdelijk verdoofd met behulp van tricaïne, gemonteerd in agarose met een laag smeltpunt en in beeld gebracht met confocale fluorescentiemicroscopie. Somiet 17 werd gekozen voor de analyse van de spieromvang gezien de toegankelijkheid op de romp-staart interface31. In de praktijk kan, net als in theorie, het myotoomvolume worden berekend als het product van de myotoomlengte (L) en het gemiddelde van drie cross-sectionele gebiedsmetingen (CSA) (figuur 2A, die de 4-slice methode wordt genoemd).
Om deze methode te valideren, werden hele myotome confocale Z-stacks van levende zebravislarven (figuur 2B) verkregen en werd somietvolume berekend door de somiet 17 profielgebieden in elke plak (80-100 plakjes) te vermenigvuldigen met de inter-slice afstand (1-1,2 μm). Er werd een sterke correlatie waargenomen tussen de 4-slice en full stack berekeningsmethoden (figuur 2C). De 4-slice methode gaf echter over het algemeen een iets grotere volumeschatting (gemiddeld ~ 2% groter) (figuur 2D). Dit verschil kan te wijten zijn aan a) obliquiteit van de monsters die ten onrechte grote volumemetingen geven of b) de waarneming dat zebravismyotomen taps toelopen langs de anteroposterior-as, kleiner naar de staart van het dier. Aangezien de CSA-metingen van YZa, YZm en YZp zich in de richting van het voorste deel van de somiet 17 myotome chevron bevinden (figuur 2A), werd de laatste interpretatie getest door volumetrische analyse van de myotomen van somiten 16 en 18. Elke somiet was ongeveer 7% groter dan de somiet erachter (figuur 2E). Verdere analyse toonde aan dat een 2-desige methode die slechts een enkele YZ-meting vereist, gelegen in het midden van de somiet waar de epaxiale en hypaxiale helften elkaar ontmoeten bij het horizontale myoseptum (YZm) en de XY-plak , een redelijk nauwkeurige schatting geeft van het myotoomvolume (figuur 2F, G). De 2-slice benadering maakt snellere gegevensverzameling mogelijk wanneer tijdsbeperkingen het aantal vissen beperken dat kan worden gescand. Samenvattend laten deze gegevens zien dat het myotomevolume snel en nauwkeurig kan worden gemeten in levende zebravislarven. Enkele larven werden met succes, herhaaldelijk, gemeten over een periode van 6 dagen met deze methode.
Voor vergelijkende studie van de groei van een geïdentificeerde weefseleenheid biedt de beschreven methode betrouwbare en nauwkeurige volumeschattingen. Om nauwkeurige absolute volumes te verkrijgen, kunnen echter een aantal wijzigingen worden toegepast. Ten eerste kan correctie worden aangebracht voor fouten veroorzaakt door schuine montage door de schotel- of microscoopfase te kantelen om betere transversale YZ - en parasagittale XY-plakjes te verkrijgen tijdens beeldvorming of door het notochordprofiel in YZ-plakjes te gebruiken; de secundaire dwarsdoorsnede toont de ware diameter van het cilindrische notochord, terwijl de hoofdas de hoek en de omvang van de obliquiteit onthult (zie noot in punt 4.6 hierboven). Ten tweede moet de locatie van XY - en YZ-secties tijdens het scannen worden geselecteerd om nauwkeurig het gewenste myotoom (en) weer te geven. (Zie noot in punt 4.6 hierboven). Merk echter op dat de vorm van de myotome chevrons verandert afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en hiermee moet rekening worden gehouden bij het selecteren van YZ-scans . Ten slotte, om te bepalen of veranderingen in myotoom 17 spiergroei over de hele as weerspiegelen, kunnen myotomen verder in de romp- of staartgebieden worden gemeten met de beschreven methode.
Herhaalde metingen onthullen somietgroei
Een voordeel van de beschreven methode is het gemak van herhaalde analyse op enkele vissen. Individuele embryo's en larven kunnen herhaaldelijk worden ingebed, gemeten en vrijgegeven zonder duidelijke langetermijneffecten (figuur 2H). Het myotoom groeit detecteerbaar zowel in L als CSA tussen 2 en 5 dpf, wat leidt tot een gestage toename van het volume (figuur 2H). De groei werd op deze manier in beeld gebracht tussen 1 en 8 dpf en larven werden ook na beeldvorming vrijgegeven en volwassen geworden. Analyses verder in de late larvale periode zullen naar verwachting mogelijk zijn, hoewel effecten van herhaalde beeldvorming op voedingsgedrag zorgvuldig moeten worden gevolgd bij vergelijking met broers en zussen die niet in beeld zijn gebracht. Belangrijk is dat de ontwikkeling van pigmentatie de beeldvorming kan vertroebelen. Terwijl pigmentatie geen probleem is bij goed georiënteerde vissen, omdat de melanofore strepen de vereiste metingen niet verhinderen, kan pigment problematischer zijn in schuin gemonteerde monsters. Het gebruik van pigmentmutatiemutantlijnen, zoals roy;mitfa39, wordt verwacht, wat het tijdvenster van groeimetingen zou verlengen totdat de grenzen van de uitvoerbare confocale scandiepte zijn bereikt.
Een ander voordeel van de beschreven procedure is het gemak van gedetailleerde analyse van de groei van enkele vezels in vergelijking met hun hele myotoom gedurende korte perioden. Door mozaïeketikettering van vezels door middel van DNA-injectie werd een methode ontwikkeld om nucleaire acquisitie en groei in individuele geïdentificeerde vezels gedurende 4 uur te detecteren en vervolgens op latere tijdstippen opnieuw te analyseren (figuur 2I). Bovendien kan de groei van het hele myotoom worden gemeten over 12 uur of minder26 (en gegevens niet getoond). Door herhaaldelijk dezelfde vissen te meten, wordt interindividuele variabiliteit geëlimineerd en kan een klein aantal dieren statistisch robuuste resultaten opleveren26.
Manipulaties die het somietvolume veranderen, kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd
Het huidige protocol maakt het mogelijk om veranderingen in spiergroei onder verschillende biologische en fysiologische omstandigheden te ondervragen, zoals veranderde fysieke inactiviteit. Anesthetisch tricaïne, dat zenuwactiepotentialen blokkeert door spanningsafhankelijke Na + -kanalen40 te remmen, werd gebruikt om spierinactiviteit te induceren in β-actine: HRAS-EGFP-larven . Zoals eerder aangetoond26, verminderde inactiviteit gedurende 24 uur tussen de derde en vierde dpf het myotoomvolume sterk, wat aangeeft dat de larvale spiergroei activiteitsafhankelijk is (figuur 3A). Het effect van inactiviteit kan ook worden onderzocht met behulp van andere detectiemethoden die de structuur van het somiet onthullen, zoals mCherry-CAAX (hetzij in een transgene lijn of door mRNA-injectie) of door nachtelijke onderdompeling van larven in BODIPY-kleurstof (figuur 3A). Deze laatste benadering, terwijl het niet nodig is om vissen op transgene achtergronden te kruisen of embryo's te injecteren, kan niet worden gebruikt voor herhaalde metingen vanwege de toxiciteit van BODIPY. De huidige methode maakt het dus mogelijk om reproductief veranderingen in het volume spierweefsel te meten.
Zoals hierboven beschreven, kunnen genetische markeringsmethoden worden gebruikt om herhaalde metingen van myotoomvolume uit te voeren, waardoor de verandering in spiergrootte gedurende opeenvolgende dagen bij individuele vissen kan worden gevolgd. Aangezien individuele vissen en hele lagen in hetzelfde ontwikkelingsstadium verschillen in absoluut myotoomvolume (figuur 3A; misschien vanwege de grootte of gezondheid van eieren), vermindert het vermogen om de groei van elk individu te meten de effecten van individuele variatie door statistische analyses van gepaarde monsters toe te staan. Het herhaaldelijk meten van dezelfde vis vermindert het aantal vissen dat nodig is om effecten robuust te detecteren. Om dit effect te illustreren, werden de resultaten van het analyseren van de groei van elk individu van 3 tot 4 dpf in populaties van actieve en inactieve larven vergeleken met analyse van dezelfde twee populaties met behulp van alleen de enkele maat van myotoomgrootte gemaakt bij 4 dpf. Van leg tot lay werd een grotere variatie in schijnbare vermindering van myotoomgrootte waargenomen bij het meten van myotoomvolume bij slechts 4 dpf in vergelijking met het meten van 4/3 dpf-volume voor elk individu (figuur 3B). Let op het grotere reductiebereik (68%-91%) in de 4 dpf only metingen, vergeleken met de 4/3 dpf methode (78%-89%) en de zwakke correlatie tussen de twee metingen. Hoewel, zoals verwacht, de gemiddelde reductie over alle 13 biologische replicaties vergelijkbaar was in elke beoordeling (figuur 3C) met 82,62 ± 1,01% (gemiddelde ± SEM, n = 13) voor de 4/3 dpf-methode en 82,31 ± 1,92% voor de 4 dpf only-methode, was de geschatte fout met de 4 dpf only-methode bijna het dubbele van die met de 4/3 dpf-methode. Het kwantificeren van individuele groei door herhaalde meting is dus de nauwkeurigere methode, door het elimineren van groottevariabiliteit tussen vissen binnen dezelfde lay, zoals eerder aangetoond26. Aangezien er echter geen significant verschil in de vermindering van het myotoomvolume veroorzaakt door inactiviteit werd waargenomen bij het meten van myotoomvolume bij slechts 4 dpf (figuur 3C), suggereren de gegevens dat ~ 6-8 vissen voldoende zijn om het interindividuele grootteverschil binnen een leg te gemiddelden. Het is duidelijk dat wanneer de grootteveranderingen klein zijn, de 4/3 dpf-methode de voorkeur heeft.
Analyse van de cellulaire basis van groei
Myotome CSA wordt bepaald door het aantal spiervezels en de vezelgrootte. Vezelaantal kan worden geschat door het aantal snelle en langzame vezels op drie YZ-secties (YZa, YZm, YZ p) tetellen. Hoewel regio's van twee aangrenzende myotomen zich in dergelijke YZ-secties bevinden, zoals blijkt uit de aanwezigheid van verticale myosepta (VM) in de meeste secties (figuur 2A), weerspiegelen deze tellingen nauwkeurig het vezelgetal. Overtelling vindt plaats bij VM's als gevolg van het taps toelopen van paren vezels van elk aangrenzend segment op de VM (figuur 4A). Een dergelijke overtelling kan worden verklaard met behulp van de volgende vergelijking: Vezelgetal = Totaal aantal vezels - (vezels in contact met VM) / 2 referentie33. Bovendien kan het gemiddelde vezelvolume worden bepaald door het myotoomvolume te delen door het aantal vezels. We hebben deze analyses gebruikt om aan te tonen dat activiteit beide cellulaire aspecten van groei regelt (figuur 4B, C).
Het is duidelijk uit figuur 2A dat vezels variëren in grootte over het myotoom, een realiteit die niet wordt weerspiegeld in berekende gemiddelde vezelvolumemetingen. Door elke vezel van somiet 17 van twee vissen te trekken, bleek het gemeten vezeldoorsnedegebied te variëren van 28 μm2 tot 217 μm2 (figuur 4D). In werkelijkheid zijn veel vezels echter schuin in het myotoom geplaatst, dus dergelijke CSA-metingen weerspiegelen niet de ware CSA van een vezel loodrecht op zijn lange as. Omgekeerd, vanwege de verschillende hoeken van vezels in het myotoom, hebben alle vezels die lopen op oriëntaties die niet anteroposteriorisch zijn uitgelijnd lengtes die verschillen van de myotoomlengte. Ondanks deze kanttekeningen, die alleen kunnen worden omzeild door volledige segmentatie van het myotoom in enkele vezelvolumes of door berekening na het meten van de hoek van obliquiteit van elke vezel, bieden de gemeten CSA's een schatting van de diversiteit van de vezelgrootte in elke vis. Individuele vezels namen bijvoorbeeld af in CSA met inactiviteit, wat resulteerde in een verschuiving naar links in de cumulatieve frequentiecurve met betrekking tot actieve (niet-verdoofde) controlelarven (figuur 4E). Omdat inactieve vissen ~ 10 minder vezels hebben dan actieve vissen (figuur 4B), werden ofwel de 10 kleinste vezels van actieve niet-verdoofde vissen (in de veronderstelling dat ze de nieuwe zijn) of de 10 grootste (als het alternatieve uiterste) weggelaten uit de vergelijking, waaruit bleek dat het meeste verlies van het myotoomvolume te wijten is aan een gebrek aan vezelgroei, in plaats van falen van nieuwe vezelvorming (figuur 4F). Samen tonen deze gegevens aan dat de beschreven methode gedetailleerd onderzoek mogelijk maakt naar de rol van fysieke activiteit op de vorming en groei van spierweefsel.
Herpositionering van activiteit door elektrische stimulatie
Fysieke activiteit is vereist voor spiergroei (figuur 3A). Een methode beschreven om spiercontracties opnieuw op te leggen door elektrische stimulatie bij anders inactieve larven, die een sterke contractiele respons oproepen (figuur 5A, aanvullend dossier 8). Hoewel hier nauwkeurige stimulatieparameters worden beschreven (figuur 5B) om de spieren maximaal te activeren, kan het protocol worden gewijzigd (door de huidige amplitude, frequentie, pulsduur, enz.) te wijzigen om de spieractivatie en trainingsdosering te regelen. De huidige methode biedt dus een gecontroleerde activiteitsprikkel met gestandaardiseerd gedrag tussen activiteitsaanvallen, waardoor een belangrijke beperking van de huidige diermodellen van oefening18 wordt overwonnen.
De beschreven methoden tonen het potentieel aan van het gebruik van zebravislarven om verschillende aspecten van spiergroei te bestuderen (bijv. Hyperplasie en hypertrofie). In het bijzonder blijkt myogenese bij zebravislarven vatbaar te zijn voor analyse door farmacologisch geïnduceerde inactiviteit en elektrisch geïnduceerde contractiliteit. De aanpak maakt de studie mogelijk van de moleculaire mechanismen waardoor fysieke activiteit leidt tot spiergroei in vivo.
Figuur 1: Ontwerp van een stimulatiekamer voor het opnieuw introduceren van spierkrachtactiviteit bij zebravislarven. Een 6-well celkweekplaat uitgerust met elektroden maakt het onderhoud van larven in putten gemaakt binnen 2% agarose gel mogelijk. Aangepaste 4-well kammen zijn gemaakt om rechthoekige putten (afmetingen zoals aangegeven) in agarose te creëren om de positie en oriëntatie van individuele vislarven te behouden en om te voorkomen dat ze contact maken met de zilveren draden tijdens krachtig trillen bij elektrische stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Spiervolume meten bij levende zebravissen α-actine:mCherry-CAAX (A,B,E) of β-actine:HRAS-EGFP transgene larven (H,I). Larven afgebeeld vanuit lateraal zicht en dorsaal naar boven, van voor naar links in de bovenste panelen (A,B,E). (A) In de 4-delige methode werd het myotoomvolume berekend door de lengte van somiet 17 (L), gemeten tussen verticale myosepta (VM) op een XY-vlak (blauwe pijl), te vermenigvuldigen met het gemiddelde van drie dwarsdoorsnedegebieden (CSA) gemeten op YZ-vlakken (YZm, YZa en YZp; onderbroken gele lijnen). (B) Bij de Full Stack-methode werd het gebied van somiet 17 myotoom gemeten (voorbeelden in geel geschetst) in elk segment van een hele Z-stack van een levende zebravislarve en de som van myotomale gebieden werd vermenigvuldigd met de inter-slice afstand. (C) Hoge concordantie tussen de 4-slice en Full Stack methoden. Kleuren geven individuele β-actine:HRAS-EGFP (vierkanten) of α-actine:mCherry-CAAX (cirkels) vissen aan. (D) Het myotoomvolume is iets, maar aanzienlijk groter wanneer het wordt berekend met behulp van de 4-delige methode. (E) In de taps toelopende zebravislarven zijn meer anterieure somites groter dan posterieure somites, zoals gemeten met de 4-slice methode. (F,G) Sterke correlatie tussen volumemetingen met behulp van het gemiddelde van drie CSA-secties (4-slice methode) of een enkele YZm CSA (2-slice methode). p-waarden tonen resultaten van twee tailed t-tests met gelijke variantie (D, G) of eenrichtings ANOVA met Bonferroni post hoc tests (E). ns, niet significant. (H) Meting van myotoom 16 volume, lengte (L) en dwarsdoorsnede (CSA) van 2 tot 5 dpf in drie individuele vissen (kleuren) die β-actine:HRAS-EGFP en myog:H2B-mRFP uitdrukken. YZm-afbeeldingen van het groene individu op elk tijdstip worden hierboven weergegeven. (I) Single fiber groei gemeten door geautomatiseerde segmentatie met constante drempel. Een β-actine:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP vis mozaïek gelabeld door injectie van een CMV:Cerulean plasmide in het 1-2 celstadium. Een enkele Cerulean gemarkeerde vezel in somite 10 werd gescand met hoge resolutie volledige XYZ stacks herhaaldelijk op een Zeiss LSM880. De getoonde afbeeldingen zijn representatieve enkele segmenten (links) en de projectie van het driedimensionale gesegmenteerde volume (rechts). Elk datapunt op de grafiek vertegenwoordigt een enkele scan van dezelfde vezel, op 3 dpf (0 h), na 4 h en op 5 dpf (54 h). Drievoudige scans werden gemaakt en gesegmenteerd per tijdspunt om reproduceerbaarheid aan te tonen. Witte pijlpunten wijzen naar vezelkernen; merk op dat twee kernen worden toegevoegd tussen 3 en 5 dpf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Activiteitsafhankelijke spiergroei in somiet 17. (A) Remming van de activiteit gedurende 24 uur door toepassing van tricaïne (roze) tussen 3 en 4 dpf vermindert het myotoomvolume zowel in transgene lijnen als in niet-transgene vissen gekleurd met BODIPY in vergelijking met voertuigcontroles op broers en zussen (blauw). Volume gekwantificeerd met behulp van de 4-delige methode. Symboolvorm geeft replicatie-experimenten aan van verschillende lagen (biologische replicaties). Grote symbolen geven gemiddelde ± SEM-waarden aan. Kleine vage symbolen tonen het volume van individuele replicerende larven. (B) Vergelijking van myotome volumereductie in inactieve vissen in vergelijking met controlebroers en -zussen bepaald door eenmalige meting van myotoomvolume bij 4 dpf (alleen 4 dpf, bovenste schematisch) of verandering in myotoomvolume tussen 3 en 4 dpf (4/3 dpf, onderste schematisch). Elk symbool vertegenwoordigt het gemiddelde volume van myotoom 17 in ~ 5 inactieve vissen uit een enkele lay gedeeld door het gemiddelde myotome 17 volume van ~ 5 actieve controle broers en zussen. (C) Er werd geen verschil waargenomen in de gemiddelde vermindering van de spiergroei bij inactieve vissen, bij metingen met alleen 4 dpf of 4/3 dpf-methoden. Getallen binnen balken vertegenwoordigen het totale aantal geanalyseerde vissen. p-waarden tonen resultaten van tweeweg ANOVA met Bonferroni post hoc tests (A) of twee tailed t-test met ongelijke variantie (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Veranderingen op cellulair niveau in spiergroei veroorzaakt door inactiviteit. (A) Schematisch dat laat zien hoe overtelling optreedt bij VM's als gevolg van dubbeltelling van taps toelopende vezels waar de blauwe en rode myotomen elkaar ontmoeten. Merk op dat het gemiddelde aantal vezels 6 is, maar de werkelijke gemiddelde waarde is 5,5. De gecorrigeerde telling geeft een betere benadering. (B,C) Vezelgetal (B) en gemiddeld vezelvolume (C) worden verminderd in inactief (roze) in vergelijking met actieve (bue) larven. Symboolvorm geeft replicatie-experimenten aan van verschillende lagen (biologische replicaties). Grote symbolen geven gemiddelde ± SEM-waarden aan. Kleinere vage symbolen tonen de waarde van individuele replicatielarven. Getallen binnen balken vertegenwoordigen het totale aantal geanalyseerde vissen. (D) Bij enkele larven werd elk vezelprofiel in myotoom 17 geschetst en CSA bepaald. Vakken tonen gemiddelde ± SEM. p-waarden tonen resultaten van tweeweg ANOVA met Bonferroni post hoc tests (B,C) of twee tailed t-test met gelijke variantie (D). (E,F) Cumulatieve frequentiecurven die de vezelgrootteverdeling weergeven in actieve controle (blauw) en inactieve (roze) larven. Vergelijking van alle vezels (E), of na weglating van veronderstelde ontluikende kleine of, aan het alternatieve uiterste, grote vezels (F) laat zien dat de toename van de vezelgrootte, niet de toename van het vezelaantal, voornamelijk verantwoordelijk is voor activiteitsgestuurde groei van het myotoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Korte elektrische stimulatie roept tetanische spiercontracties op bij verdoofde zebravislarven. (A) Sequentiële beelden (vastgelegd uit video in Supplemental File 8) die laten zien hoe elektrische stimulatie maximale samentrekkingen van een verdoofde larve veroorzaakt bij 3 dpf. Tijdschaal in seconden. Rode vakjes geven bewegingen aan aan het begin van drie opeenvolgende 1 s stimulatietreinen. Elke afbeelding heeft een belichting van 40 ms. (B) Schema met het elektrische stimulatieregime, waarbij elke 5 s een 1 s trein van 200 hoogfrequente, 20 V elektrische impulsen wordt gegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Schema's van vastgelegde beelden van perfect (linksboven) en onvolmaakt gemonteerde larven ten opzichte van het microscoop XYZ referentiekader (zwarte assen). Myotoom (groen), notochord (geel), neurale buis (tan), gemeten myotomale parameters (rood), gemeten notochordparameters (zwarte pijlen) en mogelijke of werkelijke visrotaties (blauw). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Screenshot met somite lengtemeting van XY-afbeeldingen in ZEN. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Screenshot met CSA-meting van YZ-afbeeldingen in ZEN. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Screenshot met somite lengtemeting van XY-afbeeldingen in Fiji / ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand: Screenshot met extractie van kalibratieparameters voor YZ-afbeeldingen van ZEN. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: Screenshot met kalibratie van YZ-afbeeldingen in Fiji / ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 7: Screenshot met CSA-meting van YZ-afbeeldingen in Fiji / ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 8: Representatieve video met spiercontractie opgeroepen door directe elektrische stimulatie (lengte 1 s) van een tricaïne-verdoofde 3 dpf larve. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier rapporteren we een methode voor een nauwkeurige en efficiënte schatting van het spiervolume van levende zebravislarven in stadia of in genetische varianten waarin pigmentatie geen grote belemmering vormt voor beeldvorming en wanneer voorbijgaande anesthesie en / of immobilisatie goed wordt verdragen. Terwijl we laserscanning confocale microscopie hebben gebruikt, zijn de beschreven benaderingen van toepassing op draaiende schijf confocale of lichtbladmicroscopie en op elke andere methode die stapels afbeeldingen op verschillende brandpuntsvlakken creëert. Een reeks steeds geavanceerdere benaderingen van weefselgrootte en schatting van de celinhoud wordt beschreven. Elke methode heeft voordelen en beperkingen, waarvan we laten zien dat ze kunnen worden gekwantificeerd. Een belangrijke beperking bij het bestuderen van weefselgroei is de moeilijkheid om groeiveranderingen in realtime te analyseren, omdat de groeisnelheden veranderen als reactie op een reeks moleculaire of subcellulaire gebeurtenissen die worden gekatalyseerd door acuut toegediende stimuli. Bovendien kan individuele variatie problemen veroorzaken wanneer afzonderlijke individuen worden vergeleken. De huidige aanpak maakt het mogelijk om weefselgroei te meten over perioden van minder dan een dag bij enkele levende individuen. Toepassing van de aanpak kan worden overwogen op het minieme tijdschema.
De beschreven methoden maken analyses mogelijk die tot nu toe onuitvoerbaar waren. Met behulp van de 4-slice methode kan het beeldvormingsgedeelte van de spiergroeitest binnen een uur worden voltooid op een steekproefgrootte van ongeveer 20 vissen door een getrainde operator. Dit staat in schril contrast met de conventionele Full Stack-methode, die minstens 3 uur duurt voor hetzelfde aantal vissen (d.w.z. drie keer langer). Als beelden met een hoge resolutie nodig zijn voor latere subcellulaire analyses, kan de Full Stack-methode gemakkelijk 30 minuten per vis vereisen, waardoor groeitests van cohorten dieren in een vergelijkbaar ontwikkelingsstadium onmogelijk zijn. De 2- of 4-delige methoden maken daarentegen een snelle opname van afbeeldingen van hoge kwaliteit mogelijk. Wat betreft de overweging van beeldanalyse, de voordelen van de 2- of 4-slice-methode bij het besparen van operatortijd (bij afwezigheid van geautomatiseerde beeldsegmentatie) ten opzichte van de Full Stack-methode zijn enorm. Elke vis heeft ongeveer 20 minuten nodig voor Full Stack-analyse, maar slechts 3-4 minuten voor 4-slice analyse. Operatortijd kan verder worden bespaard met behulp van de bijna even nauwkeurige 2-slice methode. De beschreven methode is dus efficiënt en verhoogt daardoor de flexibiliteit in experimenteel ontwerp.
De belangrijkste beperking van de 4- of 2-delige methoden is dat beide methoden schattingen zijn, vanwege de overlappende chevronvorm van somites (bijvoorbeeld het volume van regio's van twee naburige somites (bijv. Myotoom 16 en 17). Het is aangetoond dat dit het werkelijke myotoom 17-volume met ongeveer 2% kan overschatten, afhankelijk van waar precies YZ-plakjes werden geselecteerd. Bovendien kan handmatige tracering van de somietgrenzen tijdens metingen bijdragen aan variaties in schattingen, hoewel er weinig verschil tussen experimenten werd gevonden (gegevens niet getoond). Meetfouten kunnen worden aangepakt met behulp van drempel-, filter- en segmentatiealgoritmen om oppervlakte op een meer objectieve en reproduceerbare manier te verkrijgen. Er zijn echter nog steeds aanpassingen nodig om rekening te houden met variaties in de achtergrondfluorescentie (zoals als gevolg van inbedding en / of dikte van de LMA) en het expressieniveau van fluorescentie-eiwitten van individuele larven in de loop van de tijd. Merk op dat dergelijke geautomatiseerde metingen nog uitdagender zullen zijn als een niet-spierspecifieke reporter wordt gebruikt, zoals de β-actine: HRAS-EGFP-lijn . Niettemin, onder veel omstandigheden, bijvoorbeeld bij het vergelijken van effecten van manipulaties tussen vissen die worden onderworpen aan verschillende behandelingen die naar verwachting al het spierweefsel zullen beïnvloeden, kan de onnauwkeurigheid niet van belang zijn. Als echter maximale nauwkeurigheid vereist is voor vergelijking met vezel- of nucleaire getallen die alleen worden geteld uit myotoom 17, bijvoorbeeld, kunnen de 'slice'-methoden worden verbeterd. Dit kan worden bereikt door de zware Full Stack-methode te gebruiken, door wiskundige correctie door de gemeten 4-slice volumes met 0,98 te vermenigvuldigen, of door de locatie van de YZ CSA-scans naar achteren te verplaatsen om de ware CSA van myotoom 17 nauwkeuriger weer te geven.
Een tweede beperking van de methode is de gevoeligheid voor de montageoriëntatie van de vis. In de praktijk kunnen ervaren operators vissen meestal binnen redelijke grenzen oriënteren, zelfs wanneer ze snel werken om veel monsters in te bedden. Aanpassingen aan apparatuur op de microscoopfase kunnen worden overwogen die correctie van gier en rol voorafgaand aan het scannen mogelijk maken. Zonder een dergelijk apparaat wordt een methode beschreven om verkeerde oriëntatie te kwantificeren die vervolgens kan worden gebruikt om de gemeten volumes te corrigeren. Bovendien, zelfs als verkeerde oriëntatie de variabiliteit in gemeten volume verhoogt en dus de kans op het waarnemen van kleine effectgroottes vermindert, zal een dergelijke variatie in veel situaties de controle- en experimentele monsters op dezelfde manier beïnvloeden. Vals-positieve resultaten zijn dus onwaarschijnlijk, als operators zich bewust zijn van het probleem.
De beschreven methoden zijn aanvankelijk toegepast om de rol van elektrische activiteit in spiergroei te analyseren, een onderwerp met een lange geschiedenis van analyse in een breed scala van soorten (besproken in18). Hiertoe worden eenvoudige methoden om endogene geactiveerde activiteit te blokkeren in detail beschreven en vervangen door gecontroleerde patroonvormige elektrische stimulatie in de zebravislarve. Voordelen van deze aanpak zijn het verwijderen van neurale feedbackcontroles40, de eliminatie van de effecten van veranderde voeding en het vermogen om circadiane effecten op de groei zelf te analyseren, in plaats van op groeiproxy's, zoals eiwitomzet26. Aangezien verschillende patronen van elektrische activiteit verschillende spierreacties veroorzaken, regulerend vezeltype, grootte en metabolisme 41,42,43,44,45,46,47,48, openen de huidige methoden de zebravis voor dergelijke analyses.
De beschreven methoden bieden een reeks technieken waarmee vele aspecten van spierfysiologie, celbiologie en pathologie in ongekende temporele en ruimtelijke resolutie kunnen worden geanalyseerd door gebruik te maken van de relatief onontgonnen zebravis. De huidige benaderingen kunnen duidelijk worden toegepast op andere soorten, delen van het lichaam en ontwikkelingsstadia. De snelle vroege groei van zebravislarven maakt de detectie van acute effecten van manipulaties op weefselgroei en morfogenese bijzonder aantrekkelijk. Bovendien blijkt zebravisspier verschillende groeimechanismen en controles te delen met zoogdieren. Hoewel zebravissen gewervelde dieren zijn die veel aspecten van spiermoleculaire genetica, cel- en ontwikkelingsbiologie bij mensen behouden, zijn er ook significante verschillen in de controle van spiergroei. Langzame en snelle vezeltypen zijn bijvoorbeeld duidelijker ruimtelijk gescheiden in vissen en de innervatie van spieren vertoont verschillen. Bovendien moet in gedachten worden gehouden dat we tot nu toe alleen de vroege stadia van ontwikkeling hebben kunnen analyseren. Soortgelijke analyses in latere stadia worden overwogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs zijn diep schatplichtig aan de inspanningen van Hughes-lableden Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin en Vladimir Snetkov voor de ontwikkeling van de beschreven protocollen, en aan Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau en Peter Currie voor het delen van plasmiden of zebravislijnen. SMH is een Medical Research Council (MRC) Scientist met Programme Grant G1001029, MR/N021231/1 en MR/W001381/1support. MA hield een MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship van King's College London. Dit werk profiteerde van de goniometrische inbreng van David M. Robinson, geleerde, mentor en vriend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
