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Developmental Biology

Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64063
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London
* These authors contributed equally

Summary

La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.

Abstract

Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour visualiser des cellules individuelles dans tout le corps de poissons-zèbres embryonnaires, larvaires ou juvéniles vivants. Nous montrons que les poissons vivants avec des membranes plasmiques marquées par fluorescence peuvent être scannés dans un microscope confocal à balayage laser afin de déterminer le volume de tissu musculaire et le nombre de fibres musculaires présentes. Des approches efficaces pour la mesure du nombre et de la taille des cellules chez les animaux vivants au fil du temps sont décrites et validées par rapport à des méthodes de segmentation plus ardues. Des méthodes sont décrites qui permettent le contrôle de l’activité électrique musculaire, et donc contractile. La perte de contractile des muscles squelettiques a considérablement réduit la croissance musculaire. Chez les larves, un protocole est décrit qui permet la réintroduction d’une activité contractile évoquée électriquement. Les méthodes décrites minimisent l’effet de la variabilité interindividuelle et permettront d’analyser l’effet des stimuli électriques, génétiques, médicamenteux ou environnementaux sur une variété de paramètres de croissance cellulaire et physiologique dans le contexte de l’organisme vivant. Un suivi à long terme des effets mesurés d’une intervention définie en début de vie sur les individus peut ensuite être effectué.

Introduction

La croissance tissulaire régulée, comprenant l’augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et / ou de la taille des cellules (hypertrophie), est un facteur crucial dans le développement, la régénération et l’adaptation écologique et évolutive. Malgré d’énormes progrès dans la compréhension génétique moléculaire de la biologie cellulaire et du développement au cours des dernières décennies, la compréhension mécaniste de la régulation de la taille des tissus et des organes en est encore à ses balbutiements. L’une des raisons de cette lacune dans les connaissances est la difficulté de quantifier la croissance tissulaire dans les organismes vivants avec la précision spatiale et temporelle nécessaire.

Divers aspects de la croissance d’organismes entiers peuvent être mesurés à plusieurs reprises au fil du temps, révélant des courbes de croissance pour chaque individu 1,2,3,4,5. Des méthodes de balayage de plus en plus sophistiquées, telles que l’absorptiométrie à rayons X (DXA), la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), permettent de suivre la croissance d’organes entiers et d’autres régions du corps (par exemple, les muscles squelettiques identifiés individuellement) chez des individus isolés, humains et modèles 6,7,8,9,10 . Cependant, ces méthodes n’ont pas encore la résolution de révéler des cellules individuelles et donc les liens entre les comportements cellulaires et la croissance au niveau des tissus ont été difficiles à discerner. Pour établir de tels liens, les études traditionnelles se sont souvent appuyées sur des cohortes d’animaux individuels similaires, dont quelques-uns sont sacrifiés à des moments successifs, puis analysés en détail cytologique. De telles approches nécessitent de faire la moyenne des changements observés entre des groupes d’individus (de préférence similaires, mais néanmoins variables) et souffrent donc d’un manque de résolution temporelle et spatiale, ce qui rend difficile la recherche d’événements corrélés au niveau cellulaire suggérant une cause et un effet.

Des études sur des organismes modèles d’invertébrés, initialement chez C. elegans et D. melanogaster, ont contourné ces problèmes en développant la microscopie optique pour atteindre une résolution cellulaire et mesurer avec précision la croissance au fil du temps chez des individus individuels. De telles études ont révélé des comportements de lignée cellulaire étonnamment invariants dans la croissance de ces petits organismes modèles 11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux animaux, y compris tous les vertébrés, ont des lignées cellulaires indéterminées et contrôlent la croissance des tissus par de mystérieux processus de rétroaction qui servent à transformer le programme de croissance codé génétiquement en un organisme fonctionnel tridimensionnel avec tous ses tissus constitutifs et organes de taille appropriée. Pour comprendre ces processus de croissance complexes, il est souhaitable d’imager des tissus ou des organes entiers au fil du temps chez des individus uniques qui peuvent être manipulés expérimentalement par des interventions génétiques, pharmacologiques ou autres au moment de leur choix et dont l’effet est analysé par la suite.

Chaque muscle squelettique des vertébrés a une taille, une forme et une fonction définies, et des interactions bien caractérisées avec les tissus adjacents, tels que les os, les tendons et les nerfs. Certains muscles sont petits, se trouvent juste sous la peau et sont donc de bons candidats pour les études d’imagerie à haute résolution. Comme la plupart des organes, chaque muscle se développe tout au long de la vie embryonnaire, postnatale et juvénile, avant d’atteindre une taille adulte stable. Le muscle, cependant, a également une capacité unique à changer de taille au cours de la vie adulte, en fonction de l’utilisation et de la nutrition18, et cette propriété a un impact majeur sur la forme physique de l’organisme, la performance sportive et la vie autonome. La perte de masse musculaire et de fonction chez les personnes âgées, la sarcopénie, est un problème de plus en plus préoccupant pour les sociétés confrontées à une population vieillissante 19,20,21.

Nous et d’autres nous sommes concentrés sur la croissance de blocs définis de tissu musculaire squelettique dans le corps segmenté des larves de poisson zèbre, en tant que système apparemment fermé contenant plusieurs centaines de cellules dans lequel la croissance, l’entretien et la réparation des tissus peuvent être observés et manipulés 22,23,24,25,26. Bien que certains travaux quantitatifs aient déjà été rapportés 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, aucune méthode détaillée et validée de mesure de la croissance musculaire dans les détails cellulaires chez les organismes vertébrés individuels au fil du temps n’est disponible. Ici, un protocole efficace sur la façon d’effectuer de telles mesures répétées est décrit, ainsi que la validation, et un exemple de son utilisation pour analyser les changements dans la croissance hypertrophique et hyperplasique en réponse à une activité électrique altérée est fourni.

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Protocol

Toutes les recherches décrites ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles et sous les licences appropriées du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni conformément à la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et aux modifications ultérieures. Les embryons/larves doivent être élevés à 28,5 °C jusqu’à la fin de la gastrulation, mais peuvent ensuite être maintenus à 22-31 °C pour contrôler le taux de développement. Les poissons peuvent être scannés ou stimulés à température ambiante.

1. Anesthésier les larves de poisson zèbre

  1. Croisez les poissons adultes rapporteurs fluorescents appropriés tels que Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg référence 36 ou Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg référence37 et collectez des embryons comme décrit38.
  2. Au moment de votre choix, par exemple 2 jours après la fécondation (dpf), anesthésiez brièvement les embryons à l’aide d’un milieu de poisson contenant de la tricaïne (eau de poisson ou milieu E3) et dépister l’EGFP ou le mCherry au microscope à fluorescence, tel qu’un Leica MZ16F. Si l’on a beaucoup d’embryons, sélectionnez ceux qui ont le signal le plus lumineux. Remettre les embryons dans un milieu de poisson normal immédiatement après le dépistage.

2. Montage de poissons pour balayage confocale

  1. Allumez le système de balayage laser confocale et les lasers, pour laisser le système se stabiliser pendant 30-60 min.
    REMARQUE: Ici, nous avons utilisé un microscope Zeiss LSM 5 Exciter avec support en matériaux verticaux (qui améliore la distance de travail) équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x / 1,0 W.
  2. Préparer l’agarose à bas point de fusion (AGM) à 1 % et conserver dans un bloc de chaleur à 37 °C pour une utilisation répétée dans un tube de 1,5 mL. Pour éviter les chocs thermiques, retirez la partie aliquote LMA du bloc thermique et laissez-la refroidir juste au-dessus du réglage avant de l’appliquer sur la larve, en testant contre la peau pour juger de la température appropriée, comme lors de l’évaluation de la température du lait maternisé.
  3. Sélectionner les poissons à monter et anesthésier transitoirement chaque poisson à tour de rôle avec Tricaine (0,6 mM dans le milieu poisson).
  4. Prenez une boîte de Petri de 60 mm de diamètre recouverte d’une couche d’agarose à 1% et placez-la sur la scène d’un microscope à dissection.
  5. Transférer la larve à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 1 ml sur la boîte de Petri revêtue de 60 mm et retirer autant de milieu transféré que possible. Ensuite, toujours à l’aide de la pipette Pasteur, placez 5 à 10 gouttes de LMA sur le poisson et positionnez-le rapidement horizontalement en vue latérale avec une pince (ou une aiguille en verre fin polie au feu) avant que le LMA ne se fixe. Pour une imagerie optimale, il est souhaitable de positionner la larve près de la surface supérieure du LMA.
    1. Sinon, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 1 mL, prélever la larve avec le moins de milieu de poisson possible et transférer la larve dans la partie aliquote du LMA refroidi. Laissez la larve couler pendant 5 s pour être complètement entourée de LMA. Ensuite, récupérez la larve et transférez-la dans une goutte de LMA sur la boîte de Petri enrobée d’agarose. Orienter et positionner rapidement la larve comme décrit ci-dessus.
  6. Orientez la larve avec ses axes antéropostérieur et dorso-ventral à moins de 10° de l’horizontale (voir la note « Sur l’erreur et sa correction », point 4.6 ci-dessous).
    1. Si la larve n’est pas correctement montée horizontalement près de la surface de la goutte d’agarose, retirez-la et réintégrez-la. Les larves peuvent être facilement récupérées par aspiration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique microfine de 1 mL, et le LMA peut être retiré doucement à l’aide de Kimwipes. La pratique rend vraiment parfait dans la procédure de montage; Passez un après-midi à intégrer des larves sans importance avant d’essayer cela dans une expérience réelle.
      REMARQUE: Lors de la conception du microscope: De nombreux laboratoires utilisent des microscopes confocaux inversés pour l’imagerie à travers un couvercle. Nous avons constaté que l’enrobage et l’enlèvement répétés de poissons conservés dans l’agarose sous une lamelle de couverture pour observation dans un microscope inversé entraînent une plus grande perte d’échantillons lors d’un balayage répété que dans la procédure décrite avec un microscope vertical. Pour cette raison, l’utilisation d’un système vertical est recommandée, si disponible. Néanmoins, une clé pour des données de haute qualité est la sélection et l’utilisation appropriées des paramètres objectifs et de balayage, un sujet trop vaste pour être discuté ici.

3. Balayage confocal

  1. Lorsque le LMA a pris, inonder le plat d’environ 10 ml de milieu de poisson contenant de la tricaïne. Si vous prévoyez capturer des piles confocales, laissez reposer le poisson monté pendant au moins 10 minutes avant de procéder au balayage, car un gonflement de l’agarose se produit.
  2. Chargez la capsule d’échantillon au stade du système confocale, localisez la larve et concentrez-vous sur le somite souhaité. Somite 17 peut être choisi en raison de sa facilité de localisation près de l’évent anal et de sa facilité d’imagerie. Vérifiez en comptant les somites antérieurs.
    REMARQUE: Le premier somite est fusionné derrière l’oreille et n’a pas de bordure antérieure, mais on peut facilement observer qu’il a des fibres musculaires striées.
  3. Configurez comme pour capturer une pile Z en définissant le haut (c’est-à-dire juste au-dessus de la peau) et le bas (c’est-à-dire juste en dessous de la notochorde, de manière à inclure le somite entier, même si le poisson est monté légèrement incliné). Les côtés gauche et droit peuvent être capturés comme vous le souhaitez. Cela garantira que toutes les analyses rapides YZ capturent la ou les régions souhaitées.
  4. Capturez une image XY comme suit. Orientez la zone de balayage par rapport au poisson, comme le permet le logiciel confocale. Placez le poisson avec l’axe antéropostérieur parallèle à l’axe X imagé et l’axe dorso-ventral parallèle à l’axe Y avec somite 17 au centre du champ, comme indiqué dans le dossier supplémentaire 1. Concentrez-vous sur un plan de niveau moyen dans le myotome supérieur dans lequel l’ensemble des moitiés de somite épaxiale et hypaxiale ainsi que les myosepta verticaux et horizontaux sont visibles et capturez une image XY haute résolution. N’oubliez pas de nommer et d’enregistrer l’image.
  5. Capturez une ou plusieurs images YZ comme suit. Dans les résultats représentatifs (ci-dessous), la précision des méthodes à 2 tranches et à 4 tranches est comparée. Dans l’approche à 2 tranches, des scans XY et YZ uniques sont utilisés. Dans l’approche à 4 coupes, trois balayages YZ sont moyennés pour donner une estimation plus précise du volume de myotome. Si le logiciel confocal l’exige, réorientez le champ de numérisation.
    1. Tracez une ligne dorsale à ventrale précise à travers le somite choisi perpendiculairement à l’axe antéropostérieur du poisson à une position antéropostérieure choisie. Effectuez un balayage de ligne Z-stack.
    2. Répétez le balayage de la ligne YZ trois fois à des positions antéropostérieures définies le long du myotome sélectionné pour capturer YZa, YZm et YZp. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A. Nommez et enregistrez ces images avec l’image XY associée.
      REMARQUE: Lors de la sélection des plans YZ: Le myotome est en forme de V et sa forme change au cours de la croissance. Pour obtenir l’évaluation la plus précise du volume du myotome 17 avec la méthode des 4 coupes, positionnez YZa sur l’extrémité antérieure du myotome, YZp sur les extrémités postérieures du myotome aux extrémités dorsale et ventrale, et YZm à mi-chemin entre YZa et YZp. En supposant que le somite se rétrécit uniformément, la moyenne des mesures de chaque section YZ représentera le myotome dans son ensemble. Pour la méthode à 2 coupes, le balayage YZ unique doit être positionné à l’extrémité postérieure du myoseptum horizontal, ce qui correspond à peu près au centre antéropostérieur du myotome d’intérêt (tel que YZm). Alternativement, un ensemble de trois sections YZ peut être pris à l’avant, au milieu et à l’arrière du myoseptum horizontal, mais, comme indiqué ci-dessous, une telle mesure surestime légèrement le volume du myotome (pour les somites rostrales et caudales, respectivement, en raison de la diminution du myotome). Fondamentalement, la cohérence dans le positionnement des plans de tranche YZ entre les poissons et les expériences est essentielle à la reproductibilité.

4. Analyse

  1. Comme le myotome change de taille le long du poisson de manière graduée, travaillez toujours avec le même somite dans les études comparatives.
  2. Pour mesurer et calculer le volume de myotome, utilisez le logiciel confocal (tel que les fichiers .lsm créés à l’aide du logiciel de microscope Zeiss ZEN) ou un logiciel d’analyse d’images universel open source, tel que Fiji/ImageJ.
    REMARQUE: Si vous modifiez les formats de fichiers, assurez-vous que la taille Z-step est correctement transférée, car tous les logiciels ne peuvent pas lire correctement les formats de fichiers confocaux propriétaires. Par exemple, pour importer une image de balayage de ligne ZEN aux Fidji, utilisez d’abord la commande Fichier/Exporter pour exporter en tant que .tif dans la fenêtre Image pleine résolution - format plan unique, puis importez aux Fidji. Bien que YZ scan.lsm puisse être ouvert directement aux Fidji, les images YZ résultantes sont généralement compressées dans la dimension Z en raison d’une évaluation incorrecte de la taille de l’étape Z.
  3. Analyse à l’aide de ZEN
    1. Tout d’abord, ouvrez les fichiers XY scan.lsm dans ZEN. Accédez à l’onglet Graphiques et sélectionnez l’outil Ligne. Tracez une ligne entre les deux myoseptes verticaux du somite 17 couvrant toute la longueur du myotome (parallèle à l’axe antéropostérieur du poisson). Cochez la case M pour afficher les valeurs de la mesure (Longueur = 89,71 μm, voir Fichier supplémentaire 2).
    2. Ouvrez les fichiers YZ scan.lsm. Sous l’onglet Graphiques , sélectionnez l’outil Bézier fermé . Dessinez autour du périmètre du myotome. Une fois terminé, cochez la case M, cela révélerait la valeur de la mesure (Surface = 11980,01 μm2, voir Fichier supplémentaire 3).
    3. Enregistrez manuellement les valeurs de chaque mesure dans une feuille de calcul. Faire la moyenne des mesures de l’ASC au besoin. Le volume du myotome peut être calculé comme suit : Volume = longueur du myotome x CSA, c’est-à-dire 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
  4. Analyse à l’aide de Fidji/ImageJ
    1. Ouvrez les fichiers XY scan.lsm dans Fiji/ImageJ. Vérifiez si les images XY directement ouvertes aux Fidji sont correctement calibrées à l’échelle, comme elles devraient l’être.
    2. Sélectionnez l’outil Ligne droite parmi les icônes. Tracez une ligne le long du somite 17 comme décrit à l’étape 4.3.1. Définissez les paramètres de mesure en accédant à Analyser, puis sélectionnez Définir les mesures..., et cochez les cases Zone et Afficher l’étiquette. Pour mesurer, appuyez simplement sur la touche de raccourci M ou allez dans le menu Analyser et sélectionnez Mesurer. Une fenêtre contextuelle qui s’affiche répertorie toutes les valeurs de mesure (c.-à-d. Longueur = 90,023 μm; voir Fichier supplémentaire 4). Les résultats peuvent être enregistrés sous forme de .csv et ouverts dans Microsoft Excel ou similaire pour une analyse ultérieure.
    3. Pour mesurer l’ASC sur les images YZ , ouvrez les images YZ dans .tif format décrit à l’étape 4.2.
    4. Calibrez les images YZ .tif car elles ne sont pas calibrées lors de l’exportation. Les paramètres pour l’étalonnage peuvent être obtenus dans ZEN en allant dans les Infos des images sélectionnées : enregistrez les valeurs de mise à l’échelle X (0,489 μm) et de mise à l’échelle Z (0,890 μm ; voir Fichier supplémentaire 5). Ensuite, lorsque les images sont ouvertes aux Fidji, allez dans Image et sélectionnez Propriétés.... Entrée 0,489 μm pour la largeur et la hauteur des pixels, et 0,890 μm pour la profondeur du voxel. Cochez la case Global pour appliquer l’étalonnage universellement si la mesure répétée des images YZ est prévue (voir le dossier supplémentaire 6).
      REMARQUE: Assurez-vous que toutes les images YZ sont capturées en utilisant les mêmes paramètres de numérisation; redémarrez Fiji/ImageJ ou modifiez les valeurs d’étalonnage si un nouveau jeu d’étalonnage est nécessaire.
    5. Pour mesurer le CSA des images YZ calibrées, sélectionnez l’outil Sélections de polygones parmi les icônes. Dessinez autour du périmètre du somite et appuyez sur M pour afficher les valeurs de la mesure (Surface = 11980,395 μm2; voir le dossier supplémentaire 7). Le volume du myotome peut être calculé comme suit : Volume = longueur du myotome x CSA, c’est-à-dire 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
    6. Répétez les mesures sur les autres images XY et YZ. Il est recommandé d’utiliser le même logiciel pour toutes les mesures au sein d’une série expérimentale pour plus de cohérence. L’estimation du volume de chaque logiciel est similaire mais pas identique en raison des outils de dessin distincts, c’est-à-dire ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 et Fidji/ImageJ = 1,079 × 106 μm3. La croissance du myotome entre deux points temporels (c.-à-d. 3 à 4 dpf) peut être calculée comme suit : (Volume 4 dpf - Volume 3 dpf)/ Volume 3 dpf × 100 %.
      REMARQUE: Sur l’erreur et sa correction. Pendant le montage, le poisson doit être orienté avec son plan sagittal (c.-à-d. les axes antéropostérieur et dorso-ventral) aussi près que possible de l’horizontale, afin d’éviter le lacet et le roulis, respectivement. En effet, la longueur du myotome L mesurée à partir du balayage XY et l’ASC mesurée à partir d’un balayage YZ seront surestimées si le poisson présente un lacet (rotation autour de l’axe dorso-ventral) en raison d’un montage antéropostérieur oblique. Ni le tangage ni le roulis pendant le montage ne doivent affecter les mesures après le balayage comme décrit à la section 3. Néanmoins, la rotation dorso-ventrale (rouleau) dégrade la qualité de l’image. La trigonométrie simple montre que jusqu’à 10° de lacet donnera une erreur de 3% dans la mesure du volume, comme mesuré L et CSA chaque augmentation proportionnelle à (cosq)-1, où q est l’angle par rapport à l’horizontale antéropostérieure (lacet). 15° et 20° de réduction donneront respectivement une surestimation de 7% et 13% du volume.
      Comme la notochorde est cylindrique, l’inclusion de la notochorde entière dans le balayage YZ peut être utilisée pour calculer l’angle et l’étendue de l’obliquité à partir de l’orientation et de l’amplitude des axes majeur et mineur et ainsi corriger le L et le CSA mesurés pour maximiser la précision. CSA corrigé = Mesuré CSA x axe mineur notochorde/axe majeur notochorde. Corrigé L = Mesuré L x axe mineur de la notochorde/axe de la notocrde dans la direction Z du microscope.
      Une autre considération permet une correction supplémentaire de L. Au fur et à mesure que le myotome grandit, il se penche dans le plan coronal (normal à l’axe dorso-ventral) de sorte que le myotome médian est légèrement antérieur au myotome latéral. Vu de la dorsale, les myoseptes verticaux des côtés gauche et droit forment un large chevron pointant vers l’avant. Si le lacet est bas, cette morphologie n’affecte pas la mesure de L. Mais si le lacet est significatif, la correction trigonométrique devient difficile et une meilleure approche consiste à mesurer directement le vrai L en estimant les coordonnées XYZ des deux points où les myosepta verticaux antérieur et postérieur rencontrent la notochorde au myoseptum horizontal. La trigonométrie simple permet de calculer True L à partir de ces coordonnées comme L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Les faiblesses de cette dernière approche sont que a) la sélection des points peut varier selon l’opérateur et b) aucun enregistrement visuel des points choisis n’est conservé. Cette considération n’a pas d’incidence sur la correction de l’ASC.

5. Méthode optionnelle: Supprimer et réintroduire l’activité électrique musculaire

  1. Créez une chambre de stimulation.
    1. Prenez une plaque de puits de 6 x 35 mm, créez deux petites ouvertures (<5 mm de diamètre, espacées de 1 cm) de chaque côté de chaque puits (voir figure 1) à l’aide d’un fer à souder étroit.
      REMARQUE: Manipulez le fer à souder chaud avec soin et travaillez dans une hotte si vous le souhaitez pour éviter d’inhaler de la vapeur.
    2. Enfiler une paire de fils d’argent ou de platine (~20 cm de long) à travers les ouvertures de chaque puits (voir la figure 1). Un matériau adhésif réutilisable (p. ex., BluTack) peut être appliqué près des ouvertures pour maintenir les fils en place et assurer une séparation de 1 cm entre les fils (voir la figure 1).
  2. À 3 dpf, diviser le poisson en trois conditions : contrôle du milieu de poisson, inactif et inactif + Stim.
    1. Pour les groupes inactifs et inactifs + Stim, anesthésier les larves 72 heures après la fécondation (HPF) avec Tricaine (0,6 mM).
      NOTA : Conformément à la référence38, les aliquotes congelées du stock de tricaïne sont décongelées et diluées (milieu de poisson de 40 μL/mL, jusqu’à une concentration finale de 0,6 mM) avant d’être ajoutées au poisson. N’ajoutez pas de tricaïne directement dans l’eau contenant des poissons, car certains poissons pourraient recevoir des doses élevées. Le stock de tricaïne doit être utilisé dans un délai d’un mois et ne jamais être recongelé.
    2. Pour le milieu de poisson Contrôlez les poissons, laissez-les non anesthésiés.
  3. À un moment ou plusieurs fois après le début de l’exposition à la tricaïne (c.-à-d. à 80 hpf), préparer le groupe Inactif+Stim à la stimulation.
    1. Préparer 60 mL d’agarose à 2 % (1,2 g de poudre d’agarose dans 60 mL de milieu poisson) et faire fondre complètement au micro-ondes, refroidir, ajouter de la tricaïne et verser 4 mL dans chaque puits de la chambre de stimulation (Figure 1).
    2. Ajoutez immédiatement des peignes à 4 puits sur mesure entre les électrodes (créés en découpant des plastiques (par exemple, du polypropylène) de dimensions souhaitées et en collant ensemble à l’aide de Superglue; voir Figure 1). Laisser reposer 10 min pour que le gel prenne. Retirez soigneusement les peignes pour créer quatre puits rectangulaires.
    3. Remplissez chaque puits avec de l’eau tricaine et placez une seule larve Inactive + Stim anesthésiée dans chaque puits à l’aide d’une micropipette, leur axe antéropostérieur étant perpendiculaire aux électrodes (voir la figure 1).
    4. Vérifiez sous le microscope fluorescent à dissection si chaque poisson est entièrement anesthésié dans chaque puits de la chambre.
  4. Connectez un stimulateur électrophysiologique réglable générant des motifs à la chambre via un contrôleur de polarité, à l’aide de pinces crocodiles connectées à chacune des électrodes d’un côté de la chambre (voir Figure 1).
    REMARQUE: Le contrôleur de polarité est utilisé pour inverser la polarité toutes les 5 s, afin d’éviter l’électrolyse et la corrosion des électrodes.
  5. Stimuler les poissons. Par exemple, 1s avec un train d’impulsions de 200, 20 V, avec une durée d’impulsion de 0,5 ms et une séparation d’impulsions de 4,5 ms, une fois toutes les 5 s donne un régime efficace de résistance à la contraction tétanique répétée.
  6. Vérifiez régulièrement au microscope pour confirmer que les poissons sont stimulés; L’exemple de stimulus électrique doit induire une contraction bilatérale visible et un léger mouvement, une fois toutes les 5 s.
  7. Pour un régime résistance/force élevée, stimuler le poisson à haute fréquence pendant un épisode de 5 min, trois fois, chaque combat étant séparé par 5 min de repos.
    REMARQUE: Pendant que les poissons d’un côté de la chambre se reposent, les pinces crocodiles peuvent être connectées à la paire d’électrodes de l’autre côté de la chambre, et ces poissons supplémentaires stimulés.
  8. Après la stimulation, retirez soigneusement les poissons de chaque puits en les rinçant doucement avec une pipette en plastique et retournez dans l’incubateur dans un milieu pour poissons frais contenant de la tricaïne.
  9. Versez l’eau de tricaïne de l’intérieur de la chambre et utilisez des pinces pour couper et enlever l’agarose de chaque puits. Rincer les puits à l’eau du robinet et laisser sécher.
    REMARQUE: Si vous utilisez des électrodes en fil d’argent, de l’oxyde d’argent peut parfois s’accumuler à la surface du fil après une expérience de stimulation. Comme l’oxyde d’argent est moins conducteur que l’argent, pour maintenir la reproductibilité, frottez soigneusement l’oxyde d’argent du fil à l’aide de Kimwipes avant de réutiliser l’installation.

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Representative Results

Une mesure rapide et précise du volume du somite
Une méthode de préparation des échantillons, d’acquisition de données et d’analyse volumétrique qui permet de mesurer rapidement la croissance musculaire chez les larves de poisson zèbre est décrite. La taille des muscles peut être mesurée chez les animaux vivants à l’aide de poissons marqués sur leurs membranes plasmiques avec une GFP ciblée par membrane (β-actine: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). Les larves ont été anesthésiées transitoirement à l’aide de tricaïne, montées dans de l’agarose à bas point de fusion et imagées par microscopie confocale à fluorescence. Le somite 17 a été choisi pour l’analyse de la taille musculaire compte tenu de son accessibilité à l’interface tronc-queue31. En pratique, comme en théorie, le volume de myotome peut être calculé comme le produit de la longueur du myotome (L) et de la moyenne de trois mesures transversales de surface (CSA) (Figure 2A, appelée méthode à 4 coupes).

Pour valider cette méthode, on a obtenu des piles Z confocales entières de myotomes de larves de poisson-zèbre vivantes (Figure 2B) et le volume de somite a été calculé en multipliant la somme des 17 zones de profil du somite dans chaque tranche (80-100 tranches) par la distance inter-tranches (1-1,2 μm). Une forte corrélation a été observée entre les méthodes de calcul à 4 tranches et à pile complète (figure 2C). Cependant, la méthode à 4 tranches a généralement donné une estimation de volume légèrement plus grande (~2% plus grande en moyenne) (Figure 2D). Cette différence pourrait être due soit a) à l’obliquité des échantillons donnant une mesure de volume erronée ou b) à l’observation que les myotomes du poisson zèbre se rétrécissent le long de l’axe antéropostérieur, étant plus petits vers la queue de l’animal. Comme les mesures de YZa, YZm et YZp CSA sont vers la partie antérieure du chevron myotome somite 17 (Figure 2A), cette dernière interprétation a été testée par analyse volumétrique des myotomes des somites 16 et 18. Chaque somite était environ 7% plus grand que celui derrière (Figure 2E). Une analyse plus approfondie a révélé qu’une méthode à 2 coupes ne nécessitant qu’une seule mesure YZ, située au milieu du somite où les moitiés épaxiale et hypaxiale se rencontrent au myoseptum horizontal (YZm) et à la tranche XY, donne une estimation raisonnablement précise du volume du myotome (Figure 2F,G). L’approche à 2 tranches permet une acquisition de données plus rapide lorsque les contraintes de temps limitent le nombre de poissons pouvant être scannés. En résumé, ces données montrent que le volume de myotome peut être mesuré rapidement et avec précision chez les larves de poisson-zèbre vivant. Les larves uniques ont été mesurées avec succès, à plusieurs reprises, sur une période de 6 jours avec cette méthode.

Pour l’étude comparative de la croissance d’une unité tissulaire identifiée, la méthode décrite fournit des estimations de volume fiables et précises. Pour obtenir des volumes absolus précis, cependant, un certain nombre de modifications peuvent être appliquées. Tout d’abord, la correction peut être faite pour les erreurs causées par le montage oblique soit en inclinant la parabole ou l’étage du microscope pour obtenir de meilleures tranches transversales YZ et XY parasagittales pendant l’imagerie, soit en utilisant le profil de notochorde dans les tranches YZ ; le petit axe en coupe transversale révèle le diamètre réel de la notochorde cylindrique, tandis que son axe principal révèle l’angle et l’amplitude de l’obliquité (voir note au point 4.6 ci-dessus). Deuxièmement, l’emplacement de la section XY et YZ pendant le balayage doit être sélectionné pour refléter, avec précision, le ou les myotomes souhaités. (Voir note au point 4.6 ci-dessus). Notez cependant que la forme des chevrons myotomiques change en fonction du stade de développement et cela doit être pris en compte lors de la sélection des scans YZ . Enfin, pour déterminer si les changements dans le myotome 17 reflètent la croissance musculaire dans l’ensemble de l’axe, les myotomes plus loin dans les régions du tronc ou de la queue peuvent être mesurés par la méthode décrite.

Des mesures répétées révèlent une croissance de somite
Un avantage de la méthode décrite est la facilité d’analyse répétée sur un seul poisson. Les embryons et les larves individuels peuvent être intégrés, mesurés et libérés à plusieurs reprises sans subir d’effets évidents à long terme (Figure 2H). Le myotome croît de manière détectable à la fois dans L et CSA entre 2 et 5 dpf, conduisant à une augmentation constante du volume (Figure 2H). La croissance a été imagée de cette manière entre 1 et 8 dpf et les larves ont également été libérées après l’imagerie et ont grandi jusqu’à l’âge adulte. Des analyses plus tardives dans la période larvaire devraient être possibles, bien que les effets de l’imagerie répétée sur le comportement alimentaire devraient être surveillés attentivement par rapport aux frères et sœurs qui ne sont pas imagés. Il est important de noter que le développement de la pigmentation peut obscurcir l’imagerie. Alors que la pigmentation n’est pas un problème chez les poissons correctement orientés, car les bandes mélanophores n’empêchent pas les mesures requises, le pigment peut être plus problématique dans les échantillons montés obliquement. L’utilisation de lignées mutantes de pigmentation, telles que roy;mitfa39, est prévue, ce qui prolongerait la fenêtre temporelle des mesures de croissance jusqu’à ce que les limites de la profondeur confocale praticable du balayage soient atteintes.

Un autre avantage de la procédure décrite est la facilité d’analyse détaillée de la croissance de fibres individuelles par rapport à leur myotome entier sur de courtes périodes. Par marquage en mosaïque des fibres par injection d’ADN, une méthode a été développée pour détecter l’acquisition et la croissance nucléaires dans les fibres identifiées individuelles sur 4 heures, puis permettre une nouvelle analyse ultérieure (Figure 2I). De plus, la croissance du myotome entier peut être mesurée sur 12 h ou moins26 (et données non présentées). En mesurant à plusieurs reprises le même poisson, la variabilité interindividuelle est éliminée et un petit nombre d’animaux peut donner des résultats statistiquement robustes26.

Les manipulations qui modifient le volume du somite peuvent être facilement détectées
Le protocole actuel permet d’interroger les changements dans la croissance musculaire dans diverses conditions biologiques et physiologiques, telles que l’inactivité physique altérée. La tricaïne anesthésique, qui bloque les potentiels d’action nerveuse en inhibant les canaux Na+ voltage-dépendants40, a été utilisée pour induire l’inactivité musculaire chez les larves de β-actine:HRAS-EGFP . Comme indiqué précédemment26, l’inactivité pendant 24 h entre le troisième et le quatrième dpf a considérablement réduit le volume du myotome, ce qui indique que la croissance musculaire larvaire dépend de l’activité (figure 3A). L’effet de l’inactivité peut également être étudié à l’aide d’autres méthodes de détection qui révèlent la structure du somite, telles que mCherry-CAAX (soit dans une lignée transgénique, soit par injection d’ARNm) ou par immersion nocturne des larves dans le colorant BODIPY (Figure 3A). Cette dernière approche, tout en supprimant la nécessité de croiser des poissons sur des fonds transgéniques ou d’injecter des embryons, ne peut pas être utilisée pour des mesures répétées en raison de la toxicité de BODIPY. Ainsi, la méthode actuelle permet de mesurer de manière reproductible les changements dans le volume du tissu musculaire.

Comme décrit ci-dessus, les méthodes de marquage génétique peuvent être utilisées pour effectuer des mesures répétées du volume de myotome, ce qui permet de suivre l’évolution de la taille des muscles au cours de jours successifs chez des poissons individuels. Comme les poissons individuels et les pondeuses entières au même stade de développement diffèrent en volume absolu de myotome (figure 3A; peut-être en raison de la taille ou de la santé des œufs), la capacité de mesurer la croissance de chaque individu réduit les effets de la variation individuelle en permettant des analyses statistiques d’échantillons appariés. La mesure répétée du même poisson réduit le nombre de poissons nécessaires pour détecter les effets de manière robuste. Pour illustrer cet effet, les résultats de l’analyse de la croissance de chaque individu de 3 à 4 dpf dans les populations de larves actives et inactives ont été comparés à l’analyse des deux mêmes populations en utilisant uniquement la seule mesure de la taille du myotome faite à 4 dpf. D’une couche à l’autre, une plus grande variation de la réduction apparente de la taille du myotome a été observée lors de la mesure du volume de myotome à 4 dpf seulement par rapport à la mesure du volume de 4/3 dpf pour chaque individu (Figure 3B). Notez la plus grande plage de réduction (68%-91%) dans les mesures 4 dpf seulement, par rapport à la méthode 4/3 dpf (78%-89%) et la faible corrélation entre les deux mesures. Bien que, comme prévu, la réduction moyenne dans les 13 répétitions biologiques ait été similaire dans chaque évaluation (figure 3C), soit 82,62 ± 1,01 % (moyenne ± SEM, n = 13) pour la méthode 4/3 dpf et 82,31 ± 1,92 % pour la méthode 4/3 dpf seulement, l’erreur estimée avec la méthode 4 dpf seulement était presque le double de celle avec la méthode 4/3 dpf. Ainsi, la quantification de la croissance individuelle par des mesures répétées est la méthode la plus précise, en éliminant la variabilité de taille entre les poissons au sein d’une même ponte, comme démontré précédemment26. Néanmoins, comme aucune différence significative dans la réduction du volume de myotome causée par l’inactivité n’a été observée lors de la mesure du volume de myotome à 4 dpf seulement (Figure 3C), les données suggèrent que ~6-8 poissons sont suffisants pour faire la moyenne de la différence de taille interindividuelle au sein d’une ponte. De toute évidence, lorsque les changements de taille sont faibles, la méthode 4/3 dpf est préférée.

Analyse de la base cellulaire de la croissance
Le myotome CSA est déterminé par le nombre de fibres musculaires et la taille des fibres. Le nombre de fibres peut être estimé en comptant le nombre de fibres rapides et lentes sur trois sections YZ (YZ A, YZ M, YZP). Bien que des régions de deux myotomes adjacents soient contenues dans de telles sections YZ, comme le montre la présence de myosepta verticaux (VM) dans la plupart des sections (Figure 2A), ces comptages reflètent avec précision le nombre de fibres. Le surcomptage se produit au niveau des machines virtuelles en raison de la diminution des paires de fibres de chaque segment adjacent de la machine virtuelle (Figure 4A). Un tel surcomptage peut être expliqué à l’aide de l’équation suivante : Nombre de fibres = Nombre total de fibres - (fibres en contact avec VM) / 2 référence33. De plus, le volume moyen de fibres peut être déterminé en divisant le volume de myotome par le nombre de fibres. Nous avons utilisé ces analyses pour révéler que l’activité contrôle les deux aspects cellulaires de la croissance (Figure 4B,C).

Il ressort clairement de la figure 2A que la taille des fibres varie à travers le myotome, une réalité qui n’est pas reflétée dans les mesures calculées du volume moyen de fibres. En dessinant autour de chaque fibre de somite 17 de deux poissons, on a montré que la section transversale mesurée de la fibre variait de 28 μm 2 à 217 μm2 (Figure 4D). En réalité, cependant, de nombreuses fibres sont inclinées obliquement à l’intérieur du myotome, de sorte que de telles mesures de CSA ne reflètent pas le véritable CSA d’une fibre perpendiculaire à son axe long. Inversement, en raison des angles variables des fibres dans le myotome, toutes les fibres fonctionnant à des orientations qui ne sont pas alignées antéropostérieurement ont des longueurs qui diffèrent de la longueur du myotome. Malgré ces mises en garde, qui ne peuvent être contournées que par une segmentation complète du myotome en volumes de fibres uniques ou par calcul après avoir mesuré l’angle d’obliquité de chaque fibre, les ASC mesurés fournissent une estimation de la diversité de la taille des fibres chez chaque poisson. Par exemple, les fibres individuelles diminuaient dans l’ASC avec l’inactivité, ce qui a entraîné un déplacement vers la gauche dans la courbe de fréquence cumulative par rapport aux larves témoins actives (non anesthésiées) (figure 4E). Comme les poissons inactifs ont ~10 fibres de moins que les poissons actifs (Figure 4B), les 10 plus petites fibres des poissons actifs non anesthésiés (en supposant qu’il s’agit des nouvelles) ou les 10 plus grandes (comme alternative extrême) ont été omises de la comparaison, ce qui a montré que la majeure partie de la perte de volume de myotome est due à un manque de croissance des fibres, plutôt que l’échec de la formation de nouvelles fibres (figure 4F). Prises ensemble, ces données montrent que la méthode décrite permet une étude détaillée du rôle de l’activité physique sur la formation et la croissance du tissu musculaire.

Réimposition de l’activité par stimulation électrique
L’activité physique est nécessaire à la croissance musculaire (Figure 3A). Une méthode pour réimposer des contractions musculaires par stimulation électrique chez des larves autrement inactives, évoquant une forte réponse contractile est décrite (Figure 5A, dossier supplémentaire 8). Bien que des paramètres de stimulation précis soient décrits ici (Figure 5B) pour activer au maximum la musculature, le protocole peut être modifié (en modifiant l’amplitude du courant, la fréquence, la durée du pouls, etc.) pour contrôler l’activation musculaire et le dosage de l’exercice. Ainsi, la méthode actuelle fournit un stimulus d’activité contrôlée avec un comportement standardisé entre les épisodes d’activité, surmontant une limitation importante des modèles animaux actuels d’exercice18.

Les méthodes décrites démontrent le potentiel de l’utilisation de larves de poisson zèbre pour étudier divers aspects de la croissance musculaire (p. ex. hyperplasie et hypertrophie). En particulier, la myogenèse chez les larves de poisson zèbre s’est avérée susceptible d’être analysée par inactivité induite pharmacologiquement et contractilité induite électriquement. L’approche permet d’étudier les mécanismes moléculaires par lesquels l’activité physique conduit à la croissance musculaire in vivo.

Figure 1
Figure 1 : Conception d’une chambre de stimulation pour la réintroduction de l’activité électrique musculaire chez les larves de poisson zèbre. Une plaque de culture cellulaire à 6 puits munie d’électrodes permet de maintenir les larves dans des puits composés de gel d’agarose à 2%. Des peignes personnalisés à 4 puits sont fabriqués pour créer des puits rectangulaires (dimensions indiquées) en agarose afin de maintenir la position et l’orientation des larves de poissons individuelles et de les empêcher d’entrer en contact avec les fils d’argent lors de contractions vigoureuses lors de la stimulation électrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mesure du volume musculaire chez les larves transgéniques α-actine:mCherry-CAAX (A,B,E) ou β-actine:HRAS-EGFP (H,I) vivantes. Larves imagées de vue latérale et montrées dorsale vers le haut, d’avant à gauche dans les panneaux supérieurs (A, B, E). (A) Dans la méthode à 4 coupes, le volume du myotome a été calculé en multipliant la longueur du somite 17 (L) mesurée entre les myosepta verticaux (VM) sur un plan XY (flèche bleue) par la moyenne de trois sections transversales (CSA) mesurées sur les plans YZ (YZm, YZa et YZp; lignes jaunes pointillées). (B) Dans la méthode Full Stack, la surface du myotome somite 17 a été mesurée (exemples en jaune) dans chaque tranche d’une pile Z entière d’une larve de poisson-zèbre vivante et la somme des zones myotomiques a été multipliée par la distance entre les tranches. (C) Forte concordance entre les méthodes 4-slice et Full Stack. Les couleurs désignent des poissons individuels β-actin:HRAS-EGFP (carrés) ou α-actin:mCherry-CAAX (cercles). (D) Le volume du myotome est légèrement, mais significativement, plus grand lorsqu’il est calculé à l’aide de la méthode des 4 tranches. (E) Chez les larves effilées de poisson-zèbre, les somites plus antérieures sont plus grandes que les somites postérieures, telles que mesurées par la méthode des 4 tranches. (F,G) Forte corrélation entre les mesures de volume effectuées en utilisant la moyenne de trois sections CSA (méthode à 4 tranches) ou une seule ASC YZm (méthode à 2 tranches). Les valeurs de p montrent les résultats de deux tests t à queue avec variance égale (D, G) ou d’ANOVA unidirectionnelle avec tests post hoc de Bonferroni (E). ns, non significatif. (H) Mesure du volume du myotome 16, de la longueur (L) et de la section transversale (CSA) de 2 à 5 dpf chez trois poissons individuels (couleurs) exprimant la β-actine:HRAS-EGFP et le myog:H2B-mRFP. Les images YZm de l’individu vert à chaque point de temps sont montrées ci-dessus. (I) Croissance d’une seule fibre mesurée par segmentation automatisée à seuil constant. Un poisson β-actine:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP marqué en mosaïque par injection d’un plasmide CMV:céruléen au stade cellulaire 1-2. Une seule fibre marquée céruléenne dans le somite 10 a été scannée avec des piles XYZ complètes haute résolution à plusieurs reprises sur un Zeiss LSM880. Les images montrées sont des tranches simples représentatives (à gauche) et la projection du volume segmenté tridimensionnel (à droite). Chaque point de données du graphique représente un balayage unique de la même fibre, à 3 dpf (0 h), après 4 h, et à 5 dpf (54 h). Des balayages triples ont été effectués et segmentés par point temporel pour montrer la reproductibilité. Les pointes de flèches blanches pointent vers des noyaux de fibres; Notez que deux noyaux sont ajoutés entre 3 et 5 dpf. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Croissance musculaire dépendante de l’activité dans le somite 17. (A) L’inhibition de l’activité pendant 24 h par application de tricaïne (rose) entre 3 et 4 dpf réduit le volume de myotome à la fois dans les lignées transgéniques et chez les poissons non transgéniques colorés à la BODIPY par rapport aux témoins du véhicule sur les frères et sœurs (bleu). Volume quantifié par la méthode des 4 tranches. La forme du symbole indique des expériences répétées à partir de poses distinctes (répliques biologiques). Les grands symboles indiquent les valeurs moyennes ± SEM. De petits symboles faibles montrent le volume des larves individuelles répliquées. (B) Comparaison de la réduction du volume de myotome chez les poissons inactifs par rapport aux frères et sœurs témoins déterminée par une seule mesure du volume de myotome à 4 dpf (4 dpf seulement, schéma supérieur) ou une variation du volume de myotome entre 3 et 4 dpf (4/3 dpf, schéma inférieur). Chaque symbole représente le volume moyen de myotome 17 chez ~5 poissons inactifs d’une seule ponte divisé par le volume moyen de myotome 17 de ~5 frères et sœurs témoins actifs. (C) Aucune différence n’a été observée dans la réduction moyenne de la croissance musculaire chez les poissons inactifs, lors de la mesure par les méthodes 4 dpf seulement ou 4/3 dpf. Les nombres à l’intérieur des barres représentent le nombre total de poissons analysés. Les valeurs p montrent les résultats de l’ANOVA bidirectionnelle avec des tests post hoc de Bonferroni (A) ou du test t bilatéral avec variance inégale (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Changements au niveau cellulaire dans la croissance musculaire causés par l’inactivité. (A) Schéma montrant comment le surcomptage se produit au niveau des machines virtuelles en raison du double comptage des fibres effilées où les myotomes bleu et rouge se rencontrent. Notez que le nombre moyen de fibres est de 6 mais que la valeur moyenne réelle est de 5,5. Le décompte corrigé donne une meilleure approximation. (B,C) Le nombre de fibres (B) et le volume moyen de fibres (C) sont réduits chez les larves inactives (roses) par rapport aux larves actives (bue). La forme du symbole indique des expériences répétées à partir de poses distinctes (répliques biologiques). Les grands symboles indiquent les valeurs moyennes ± SEM. Des symboles faibles plus petits montrent la valeur des larves individuelles répliquées. Les nombres à l’intérieur des barres représentent le nombre total de poissons analysés. (D) Chez les larves individuelles, chaque profil fibreux du myotome 17 a été décrit et l’ASC a été déterminée. Les cases montrent la moyenne ± les valeurs de p MEB. montrent les résultats de l’ANOVA bidirectionnelle avec des tests post hoc de Bonferroni (B, C) ou du test t bilatéral avec une variance égale (D). (E,F) Courbes de fréquence cumulées montrant la distribution de la taille des fibres chez les larves témoins actives (bleues) et inactives (roses). La comparaison de toutes les fibres (E), ou après omission de fibres présumées-naissantes petites ou, à l’autre extrême, grandes fibres (F) montre que l’augmentation de la taille des fibres, et non l’augmentation du nombre de fibres, explique principalement la croissance du myotome induite par l’activité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Une brève stimulation électrique évoque des contractions musculaires tétaniques chez les larves de poisson-zèbre anesthésiées. (A) Images séquentielles (tirées de la vidéo dans le dossier supplémentaire 8) montrant comment la stimulation électrique déclenche les contractions maximales d’une larve anesthésiée à 3 dpf. Échelle de temps en secondes. Les cases rouges indiquent les mouvements au départ de trois trains de stimulation successifs de 1 s. Chaque image est une exposition de 40 ms. (B) Schéma montrant le régime de stimulation électrique, dans lequel un train de 1 s de 200 impulsions électriques haute fréquence de 20 V est donné toutes les 5 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Schémas des images capturées de larves parfaitement (en haut à gauche) et imparfaitement montées par rapport au cadre de référence XYZ du microscope (axes noirs). Myotome (vert), notochorde (jaune), tube neural (bronzage), paramètres myotomiques mesurés (rouge), paramètres de notochorde mesurés (flèches noires) et rotations possibles ou réelles des poissons (bleu). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Capture d’écran montrant la mesure de la longueur du somite à partir d’images XY en ZEN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Capture d’écran montrant la mesure CSA à partir d’images YZ en ZEN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Capture d’écran montrant la mesure de la longueur du somite à partir d’images XY aux Fidji/ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire : Capture d’écran montrant l’extraction des paramètres d’étalonnage pour les images YZ de ZEN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Capture d’écran montrant l’étalonnage des images YZ aux Fidji/ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : Capture d’écran montrant la mesure de l’ASC à partir d’images YZ aux Fidji/ImageJ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Vidéo représentative montrant une contraction musculaire évoquée par stimulation électrique directe (longueur 1 s) d’une larve de 3 dpf anesthésiée à la tricaïne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Nous rapportons ici une méthode pour une estimation précise et efficace du volume musculaire des larves de poisson-zèbre vivants à des stades ou dans des variantes génétiques dans lesquels la pigmentation n’est pas un obstacle majeur à l’imagerie et lorsque l’anesthésie transitoire et / ou l’immobilisation est bien tolérée. Alors que nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser, les approches décrites sont applicables à la microscopie confocale à disque rotatif ou à feuille de lumière et à toute autre méthode qui crée des piles d’images à des plans focaux distincts. Une série d’approches de plus en plus sophistiquées de l’estimation de la taille des tissus et du contenu cellulaire est décrite. Chaque méthode a des avantages et des limites, dont nous montrons qu’ils peuvent être quantifiés. Une limitation majeure dans l’étude de la croissance tissulaire est la difficulté d’analyser les changements de croissance en temps réel lorsque les taux de croissance changent en réponse à une série d’événements moléculaires ou sous-cellulaires catalysés par des stimuli administrés de manière aiguë. De plus, la variation individuelle peut créer des problèmes lorsque des individus distincts sont comparés. L’approche actuelle permet de mesurer la croissance tissulaire sur des périodes de moins d’une journée chez des individus vivants uniques. L’application de l’approche peut être envisagée à la minute près.

Les méthodes décrites permettent des analyses qui étaient jusqu’ici impraticables. En utilisant la méthode à 4 tranches, la partie imagerie du test de croissance musculaire peut être complétée sur un échantillon d’environ 20 poissons en une heure par un opérateur qualifié. Cela contraste fortement avec la méthode conventionnelle Full Stack, qui prend au moins 3 heures pour le même nombre de poissons (c.-à-d. trois fois plus longtemps). Si des images à haute résolution sont nécessaires pour les analyses subcellulaires ultérieures, la méthode Full Stack peut facilement nécessiter 30 minutes par poisson, ce qui rend impossible les tests de croissance de cohortes d’animaux à un stade de développement similaire. En revanche, les méthodes à 2 ou 4 tranches permettent une capture d’image rapide de haute qualité. En ce qui concerne l’analyse d’image, les avantages de la méthode à 2 ou 4 tranches en termes de gain de temps de l’opérateur (en l’absence de segmentation automatisée des images) par rapport à la méthode Full Stack sont énormes. Chaque poisson nécessite environ 20 minutes pour l’analyse Full Stack, mais seulement 3-4 min pour l’analyse à 4 tranches. Le temps de l’opérateur peut être conservé davantage en utilisant la méthode presque aussi précise des 2 tranches. Ainsi, la méthode décrite est efficace et augmente ainsi la flexibilité dans la conception expérimentale.

La principale limitation des méthodes à 4 ou 2 tranches est que les deux méthodes sont des estimations, en raison de la forme en chevron qui se chevauche des somites (par exemple, le volume des régions de deux somites voisins (par exemple, myotome 16 et 17). Il est démontré que cela peut surestimer le volume réel du myotome 17 d’environ 2%, en fonction de l’endroit précis où les tranches YZ ont été sélectionnées. De plus, le traçage manuel des bordures du somite pendant les mesures pourrait contribuer aux variations des estimations, bien que peu de différences entre les expérimentateurs aient été trouvées (données non présentées). Les erreurs de mesure peuvent être corrigées à l’aide d’algorithmes de seuillage, de filtrage et de segmentation pour acquérir une surface de manière plus objective et reproductible. Cependant, des personnalisations seront toujours nécessaires pour tenir compte des variations de la fluorescence de fond (par exemple en raison de l’encastrement et/ou de l’épaisseur du LMA) et du niveau d’expression des protéines de fluorescence des larves individuelles au fil du temps. Notez que de telles mesures automatisées seront encore plus difficiles si un rapporteur non spécifique au muscle est utilisé, tel que la ligne β-actin:HRAS-EGFP . Néanmoins, dans de nombreuses circonstances, par exemple, lorsque l’on compare les effets de manipulations entre des poissons soumis à différents traitements qui devraient affecter tous les tissus musculaires, l’imprécision peut être sans importance. Cependant, si une précision maximale est requise pour la comparaison avec les nombres de fibres ou nucléaires comptés uniquement à partir du myotome 17, par exemple, les méthodes de « tranche » peuvent être améliorées. Cela peut être réalisé soit en utilisant la méthode ardue Full Stack, par correction mathématique en multipliant les volumes mesurés à 4 tranches par 0,98, soit en déplaçant l’emplacement des balayages YZ CSA vers l’arrière pour refléter plus précisément le véritable CSA du myotome 17.

Une deuxième limitation de la méthode est sa sensibilité à l’orientation de montage du poisson. En pratique, les opérateurs qualifiés peuvent orienter les poissons dans des limites raisonnables la plupart du temps, même lorsqu’ils travaillent rapidement pour intégrer de nombreux échantillons. Des modifications à l’équipement sur l’étage du microscope peuvent être envisagées pour permettre la correction du lacet et du rouleau avant le balayage. Sans un tel appareil, une méthode pour quantifier la désorientation qui peut ensuite être utilisée pour corriger les volumes mesurés est décrite. De plus, même si une mauvaise orientation augmente la variabilité du volume mesuré et réduit ainsi les chances d’observer de petites tailles d’effet, dans de nombreuses situations, une telle variation affectera les échantillons témoins et expérimentaux de la même manière. Les résultats faussement positifs sont donc peu probables si les opérateurs sont conscients du problème.

Les méthodes décrites ont d’abord été appliquées pour analyser le rôle de l’activité électrique dans la croissance musculaire, un sujet avec une longue histoire d’analyse dans un large éventail d’espèces (examiné dans18). À cette fin, des méthodes simples pour bloquer l’activité déclenchée de manière endogène sont décrites en détail et remplacées par une stimulation électrique contrôlée chez la larve de poisson zèbre. Les avantages de cette approche sont la suppression des contrôles de rétroaction neuronale40, l’élimination des effets de la nutrition altérée et la capacité d’analyser les effets circadiens sur la croissance elle-même, plutôt que sur les proxies de croissance, tels que le renouvellement des protéines26. Comme différents modèles d’activité électrique déclenchent des réponses musculaires distinctes, régulant le type, la taille et le métabolisme des fibres 41,42,43,44,45,46,47,48, les méthodes actuelles ouvrent le poisson zèbre à de telles analyses.

Les méthodes décrites offrent une série de techniques avec lesquelles de nombreux aspects de la physiologie musculaire, de la biologie cellulaire et de la pathologie peuvent être analysés avec une résolution temporelle et spatiale sans précédent en tirant parti du poisson zèbre relativement inexploré. Les approches actuelles pourraient clairement être appliquées à d’autres espèces, régions du corps et stades de développement. La croissance précoce rapide des larves de poisson zèbre rend la détection des effets aigus des manipulations sur la croissance tissulaire et la morphogenèse particulièrement attrayante. De plus, il a été démontré que le muscle du poisson zèbre partage divers mécanismes de croissance et contrôles avec les mammifères. Alors que le poisson zèbre est un vertébré qui conserve de nombreux aspects de la génétique moléculaire musculaire, des cellules et de la biologie du développement avec les humains, il existe également des différences significatives dans le contrôle de la croissance musculaire. Par exemple, les types de fibres lentes et rapides sont plus clairement séparés spatialement chez les poissons et l’innervation du muscle montre des différences. En outre, il faut garder à l’esprit que, jusqu’à présent, nous n’avons pu analyser que les premiers stades de développement. Des analyses similaires sont envisagées à des stades ultérieurs.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Les auteurs sont profondément redevables aux efforts des membres du laboratoire Hughes, les Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin et Vladimir Snetkov pour le développement des protocoles décrits, et à Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau et Peter Currie pour le partage de plasmides ou de lignées de poissons-zèbres. SMH est un scientifique du Conseil de recherches médicales (CRM) avec la subvention de programme G1001029, MR/N021231/1 et MR/W001381/1. MA a été titulaire d’une bourse de doctorat du programme de formation doctorale MRC du King’s College de Londres. Ce travail a bénéficié de l’apport trigonométrique de David M. Robinson, érudit, mentor et ami.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive, Blu Tack Bostik - -
Aerosol vacuum  - - -
Agarose Sigma-Aldrich A9539 -
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414 Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater Cole-Parmer SBH130 -
BODIPY FL C5-ceramide Thermo Scientific D3521 To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires - - -
Fiji/imageJ National Institutes of Health, NIH - -
Fish medium, Fish water - - Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium - - E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope Leica Leica MZ16F Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle World Precision Instruments, Inc. 1B100-6 To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator Grass Instruments S88 Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 13258179 -
Laser scanning microscope (LSM)  Zeiss Zeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		 LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate Thermo Scientific 140675 -
Objective, 20×/1.0W water immersion Zeiss - -
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL Starlab Group E1414-0100 -
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL Starlab Group E1414-1100 -
Petri dish, 60 mm Sigma-Aldrich P5481 -
Plasmid, CMV-Cerulean Christina L. Hammond (University of Bristol) pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX Henry Roehl (University of Sheffield) - For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller  Hoefer Scientific Instruments PC750 -
Soldering iron - - -
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc - -
Watchmaker forceps, No. 5 - - -
Wire, Platinum Goodfellow PT005142/12 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver Acros Organics 317730010 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) - ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) - ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP - - ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
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Biologie du développement numéro 184
Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée
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Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity. J. Vis. Exp. (184), e64063, doi:10.3791/64063 (2022).

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