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Developmental Biology

व्यक्तिगत लाइव ज़ेब्राफिश में कंकाल की मांसपेशियों के विकास का वास्तविक समय और बार-बार माप परिवर्तित विद्युत गतिविधि के अधीन

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64063
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London
* These authors contributed equally

Summary

जेब्राफिश में सेल जैविक और शारीरिक कार्य के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता एक प्रमुख लाभ है। व्यक्तिगत जानवरों में कोशिका वृद्धि के माप के लिए मजबूत तरीकों का वर्णन किया गया है जो कंकाल की मांसपेशियों और पड़ोसी ऊतकों के विकास को पूरे शरीर के विकास के साथ एकीकृत करने की अनुमति देते हैं।

Abstract

जीवित भ्रूण, लार्वा या किशोर ज़ेबराफिश के पूरे शरीर में अलग-अलग कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। हम दिखाते हैं कि फ्लोरोसेंटली-चिह्नित प्लाज्मा झिल्ली के साथ जीवित मछली को मांसपेशियों के ऊतकों की मात्रा और मौजूद मांसपेशी फाइबर की संख्या निर्धारित करने के लिए एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में स्कैन किया जा सकता है। समय के साथ जीवित जानवरों में सेल संख्या और आकार के माप के लिए कुशल दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है और अधिक कठिन विभाजन विधियों के खिलाफ मान्य किया गया है। विधियों का वर्णन किया गया है जो मांसपेशियों के विद्युत, और इस प्रकार सिकुड़ा हुआ, गतिविधि के नियंत्रण की अनुमति देते हैं। कंकाल की मांसपेशियों की सिकुड़ा हुआ गतिविधि के नुकसान ने मांसपेशियों की वृद्धि को बहुत कम कर दिया। लार्वा में, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो पैटर्न वाले विद्युत-उत्पन्न सिकुड़ा हुआ गतिविधि को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है। वर्णित विधियां अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के प्रभाव को कम करती हैं और जीवित जीव के संदर्भ में विभिन्न प्रकार के सेलुलर और शारीरिक विकास मापदंडों पर विद्युत, आनुवंशिक, दवा या पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के प्रभाव के विश्लेषण की अनुमति देंगी। व्यक्तियों पर परिभाषित प्रारंभिक जीवन हस्तक्षेप के मापा प्रभावों का दीर्घकालिक अनुवर्ती बाद में किया जा सकता है।

Introduction

विनियमित ऊतक विकास, जिसमें सेल संख्या (हाइपरप्लासिया) और / या सेल आकार (हाइपरट्रॉफी) में वृद्धि शामिल है, विकास, पुनर्जनन और पारिस्थितिक और विकासवादी अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण कारक है। हाल के दशकों में कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान दोनों की आणविक आनुवंशिक समझ में भारी प्रगति के बावजूद, ऊतक और अंग के आकार के विनियमन की यंत्रवत समझ अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है। ज्ञान में इस कमी का एक कारण आवश्यक स्थानिक और लौकिक सटीकता के साथ जीवित जीवों में ऊतक वृद्धि को निर्धारित करने में कठिनाई है।

पूरे जीवों के विकास के विभिन्न पहलुओं को समय के साथ बार-बार मापा जा सकता है, जिससे प्रत्येक व्यक्ति के लिए विकास वक्र 1,2,3,4,5 का पता चलता है। तेजी से परिष्कृत स्कैनिंग विधियां, जैसे कि दोहरी एक्स-रे एब्सोप्टोमेट्री (डीएक्सए), कम्प्यूटरीकृत टोमोग्राफी (सीटी), और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), एकल व्यक्तियों में पूरे अंगों और अन्य शरीर के क्षेत्रों (उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत रूप से पहचाने गए कंकाल की मांसपेशियों) के विकास की ट्रैकिंग की अनुमति देती हैं, दोनों मानव और मॉडल जीवों में 6,7,8,9,10 . हालांकि, इन विधियों में अभी तक व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्रकट करने का संकल्प नहीं है और इस प्रकार सेलुलर व्यवहार और ऊतक स्तर के विकास के बीच संबंधों को समझना मुश्किल है। इस तरह के लिंक बनाने के लिए, पारंपरिक अध्ययनों ने अक्सर समान व्यक्तिगत जानवरों के समूहों पर भरोसा किया है, जिनमें से कुछ को लगातार समय बिंदुओं पर बलिदान किया जाता है और फिर साइटोलॉजिकल विस्तार में विश्लेषण किया जाता है। इस तरह के दृष्टिकोणों को (अधिमानतः समान, लेकिन फिर भी परिवर्तनशील) व्यक्तियों के समूहों में देखे गए परिवर्तनों को औसत करने की आवश्यकता होती है और इस प्रकार अस्थायी और स्थानिक संकल्प की कमी से पीड़ित होते हैं, जिससे सेलुलर स्तर पर सहसंबद्ध घटनाओं को ढूंढना मुश्किल हो जाता है जो कारण और प्रभाव का संकेत देते हैं।

अकशेरुकी मॉडल जीवों पर अध्ययन, शुरू में सी एलिगेंस और डी मेलानोगास्टर में, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने और एकल व्यक्तियों में समय के साथ विकास को सटीक रूप से मापने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी विकसित करके इन समस्याओं को दरकिनार कर दिया है। इस तरह के अध्ययनों से इन छोटे मॉडल जीवों 11,12,13,14,15,16,17 के विकास में आश्चर्यजनक रूप से अपरिवर्तनीय सेल वंश व्यवहार का पता चला है। हालांकि, सभी कशेरुकियों सहित कई जानवरों में अनिश्चित कोशिका वंश होते हैं, और रहस्यमय प्रतिक्रिया प्रक्रियाओं द्वारा ऊतक विकास को नियंत्रित करते हैं जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड विकास कार्यक्रम को एक कार्यात्मक तीन आयामी जीव में बदलने का काम करते हैं, जिसमें इसके सभी घटक ऊतक और अंग आकार में उपयुक्त रूप से मेल खाते हैं। इन जटिल विकास प्रक्रियाओं को समझने के लिए, एकल व्यक्तियों में समय के साथ पूरे ऊतकों या अंगों की छवि बनाना वांछनीय है जिन्हें पसंद के समय आनुवंशिक, औषधीय या अन्य हस्तक्षेपों द्वारा प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किया जा सकता है और प्रभाव बाद में विश्लेषण किया जा सकता है।

प्रत्येक कशेरुक कंकाल की मांसपेशी में एक परिभाषित आकार, आकार और कार्य होता है, और आसन्न ऊतकों, जैसे हड्डी, कण्डरा और नसों के साथ अच्छी तरह से विशेषता वाली बातचीत होती है। कुछ मांसपेशियां छोटी होती हैं, त्वचा के नीचे लेटती हैं और इसलिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग अध्ययनों के लिए अच्छे उम्मीदवार हैं। अधिकांश अंगों के समान, प्रत्येक मांसपेशी एक स्थिर वयस्क आकार तक पहुंचने से पहले भ्रूण, प्रसवोत्तर और किशोर जीवन में बढ़ती है। मांसपेशियों में, हालांकि, वयस्क जीवन के दौरान आकार बदलने की एक अनूठी क्षमता भी है, जो उपयोग और पोषण18 पर निर्भर करती है, और इस संपत्ति का जीव फिटनेस, खेल प्रदर्शन और स्वतंत्र जीवन पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है। बुढ़ापे में मांसपेशियों और कार्य का नुकसान, सरकोपेनिया, 19,20,21 की उम्र बढ़ने वाली आबादी के साथ सामना करने वाले समाजों के लिए बढ़ती चिंता का मुद्दा है।

हमने और अन्य लोगों ने ज़ेब्राफिश लार्वा के खंड-दोहराए जाने वाले शरीर में कंकाल की मांसपेशी ऊतक के परिभाषित ब्लॉकों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है, एक स्पष्ट रूप से बंद प्रणाली के रूप में जिसमें कई सौ कोशिकाएं होती हैं जिसमें ऊतक वृद्धि, रखरखाव और मरम्मत देखी जा सकती है और 22,23,24,25,26 में हेरफेर किया जा सकता है। जबकि कुछ मात्रात्मक कार्य पहले 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 बताए गए हैं, समय के साथ व्यक्तिगत कशेरुक जीवों में सेलुलर विस्तार में मांसपेशियों की वृद्धि को मापने का कोई विस्तृत और मान्य तरीका उपलब्ध नहीं है। यहां इस तरह के दोहराए गए मापों को करने के तरीके के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, सत्यापन के साथ, और परिवर्तित विद्युत गतिविधि के जवाब में हाइपरट्रॉफिक और हाइपरप्लास्टिक विकास दोनों में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए इसके उपयोग का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।

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Protocol

वर्णित सभी शोध संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में और पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 और बाद के संशोधनों के अनुसार यूके होम ऑफिस से उपयुक्त लाइसेंस के तहत किए गए थे। लार्वा को गैस्ट्रुलेशन पूरा होने तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर पाला जाना चाहिए, लेकिन फिर विकास की दर को नियंत्रित करने के लिए 22-31 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। मछली को कमरे के तापमान पर स्कैन या उत्तेजित किया जा सकता है।

1. एनेस्थेटाइज जेब्राफिश लार्वा

  1. क्रॉस उपयुक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर वयस्क मछली जैसे Tg (Ola.Actb: Hsa.HRAS-EGFP) vu119Tg संदर्भ36 या Tg (α-actin: mCherry-CAAX) pc22Tg संदर्भ37 औरवर्णित 38 के रूप में भ्रूण एकत्र करें।
  2. पसंद के समय, जैसे कि निषेचन के 2 दिन बाद (डीपीएफ), ट्राइकेन युक्त मछली माध्यम (या तो मछली के पानी या ई 3 माध्यम) का उपयोग करके भ्रूण को संक्षेप में एनेस्थेटाइज करें, और एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत ईजीएफपी या एमचेरी के लिए स्क्रीन करें, जैसे कि लीका एमजेड 16 एफ। यदि किसी के पास कई भ्रूण हैं, तो सबसे चमकीले संकेत वाले लोगों का चयन करें। स्क्रीनिंग के तुरंत बाद भ्रूण को सामान्य मछली माध्यम में वापस करें।

2. कॉन्फोकल स्कैनिंग के लिए मछली बढ़ाना

  1. सिस्टम को 30-60 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग सिस्टम और लेजर चालू करें।
    नोट: यहां, हमने 20x/1.0 W जल-विसर्जन उद्देश्य से लैस सीधे सामग्री स्टैंड (जो काम की दूरी को बढ़ाता है) के साथ Zeiss LSM 5 Exciter माइक्रोस्कोप का उपयोग किया।
  2. 1% कम पिघलने वाले अगारोस (एलएमए) तैयार करें और 1.5 एमएल ट्यूब में बार-बार उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में रखें। हीट-शॉक से बचने के लिए, हीट ब्लॉक से एलएमए एलिकोट को हटा दें और लार्वा पर लागू करने से पहले इसे सेटिंग के ठीक ऊपर ठंडा होने दें, उचित तापमान का न्याय करने के लिए किसी की त्वचा के खिलाफ परीक्षण करें, जैसे कि बेबी फॉर्मूला दूध के तापमान का आकलन करते समय।
  3. चढ़ाई जाने वाली मछलियों का चयन करें और ट्राइकेन (मछली माध्यम में 0.6 एमएम) के साथ बारी-बारी से प्रत्येक मछली को क्षणिक रूप से एनेस्थेटाइज करें।
  4. एक 60 मिमी व्यास पेट्री डिश लें जिसे 1% अगारोस की परत के साथ लेपित किया गया है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें।
  5. लार्वा को 1 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 60 मिमी लेपित पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें और जितना संभव हो उतना स्थानांतरित माध्यम को हटा दें। फिर, अभी भी पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, मछली पर एलएमए की 5 से 10 बूंदें रखें और एलएमए सेट से पहले बल (या आग से पॉलिश की गई बारीक कांच की सुई) के साथ पार्श्व दृश्य में तेजी से क्षैतिज रूप से स्थिति रखें। इष्टतम इमेजिंग के लिए, लार्वा को एलएमए की ऊपरी सतह के करीब रखना वांछनीय है।
    1. वैकल्पिक रूप से, 1 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, लार्वा को जितना संभव हो उतना कम मछली माध्यम के साथ इकट्ठा करें, और लार्वा को ठंडा एलएमए के एलिकोट में स्थानांतरित करें। लार्वा को 5 सेकंड के लिए डूबने दें ताकि एलएमए से पूरी तरह से घिरा हो सके। फिर, लार्वा को पुनः प्राप्त करें और इसे एगारोस-लेपित पेट्री डिश पर एलएमए की एक बूंद में स्थानांतरित करें। लार्वा को जल्दी से उन्मुख करें और ऊपर वर्णित स्थिति में रखें।
  6. लार्वा को क्षैतिज के 10° के भीतर इसके एंटेरोपोस्टीरियर और डोरसोवेंट्रल अक्षों दोनों के साथ उन्मुख करें (नीचे बिंदु 4.6 पर नोट 'त्रुटि और उसके सुधार पर' देखें)।
    1. यदि लार्वा को अगारोस ड्रॉप की सतह के पास क्षैतिज रूप से सही ढंग से नहीं रखा गया है, तो हटा दें और फिर से एम्बेड करें। लार्वा को माइक्रोफाइन 1 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कोमल सक्शन द्वारा आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, और एलएमए को किमविप्स का उपयोग करके धीरे से हटाया जा सकता है। अभ्यास वास्तव में बढ़ती प्रक्रिया में परिपूर्ण बनाता है; एक वास्तविक प्रयोग पर कोशिश करने से पहले कुछ महत्वहीन लार्वा एम्बेड करने में एक दोपहर बिताएं।
      नोट: माइक्रोस्कोप डिजाइन पर: कई प्रयोगशालाएं कवरस्लिप के माध्यम से इमेजिंग के लिए उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करती हैं। हमने पाया है कि उल्टे माइक्रोस्कोप में अवलोकन के लिए कवरस्लिप के नीचे अगारोस में रखी गई मछलियों को बार-बार एम्बेडेड और हटाने से एक सीधे माइक्रोस्कोप के साथ वर्णित प्रक्रिया की तुलना में बार-बार स्कैनिंग के दौरान नमूनों का अधिक नुकसान होता है। इस कारण से, यदि उपलब्ध हो, तो एक ईमानदार प्रणाली के उपयोग की सिफारिश की जाती है। फिर भी, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की कुंजी उद्देश्य और स्कैन मापदंडों का उचित चयन और उपयोग है, एक विषय जो यहां चर्चा के लिए बहुत बड़ा है।

3. कॉन्फोकल स्कैनिंग

  1. जब एलएमए सेट हो जाता है, तो डिश को लगभग 10 एमएल ट्राइकेन युक्त मछली माध्यम से भर दें। यदि कॉन्फोकल स्टैक को पकड़ने की योजना बना रहे हैं, तो घुड़सवार मछली को स्कैनिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 10 मिनट तक आराम करने दें, क्योंकि कुछ अगारोस सूजन होती है।
  2. नमूना डिश को कॉन्फोकल सिस्टम के चरण में लोड करें, लार्वा का पता लगाएं और वांछित सोमाइट पर ध्यान केंद्रित करें। सोमाइट 17 को गुदा वेंट के पास स्थानीयकरण में आसानी और इमेजिंग में आसानी के कारण चुना जा सकता है। पूर्वकाल से सोमाइट्स की गिनती करके जांच करें।
    नोट: पहला सोमाइट कान के पीछे जुड़ा हुआ है और इसमें कोई पूर्ववर्ती सीमा नहीं है, लेकिन धारीदार मांसपेशी फाइबर होने के लिए आसानी से देखा जा सकता है।
  3. शीर्ष (यानी, त्वचा के ठीक ऊपर) और नीचे (यानी, नोटोकॉर्ड के ठीक नीचे) को परिभाषित करके जेड-स्टैक को पकड़ने के लिए सेट अप करें, ताकि पूरे सोमाइट को शामिल किया जा सके, भले ही मछली थोड़ी तिरछी हो)। बाएं और दाएं दोनों पक्षों को इच्छानुसार कब्जा किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करेगा कि सभी तेजी से वाईजेड स्कैन वांछित क्षेत्र (ओं) को कैप्चर करते हैं।
  4. XY छवि निम्नानुसार कैप्चर करें। मछली के संबंध में स्कैन क्षेत्र को उन्मुख करें, जैसा कि कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर अनुमति देता है। पूरक फ़ाइल 1 में दिखाए गए अनुसार मछली को चित्रित एक्स अक्ष के समानांतर एंटेरोपोस्टेरियर अक्ष और वाई अक्ष के समानांतर डोरसोवेंट्रल अक्ष के साथ क्षेत्र के केंद्र में सोमाइट 17 के साथ रखें। सबसे ऊपरी मायोटोम में एक मध्य-स्तरीय विमान पर ध्यान केंद्रित करें जिसमें ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज मायोसेप्टा के साथ पूरे एपेक्सियल और हाइपएक्सियल सोमाइट आधे दिखाई देते हैं और एक उच्च रिज़ॉल्यूशन एक्सवाई छवि कैप्चर करते हैं। छवि को नाम देना और सहेजना याद रखें।
  5. निम्नानुसार एक या अधिक YZ छवियों को कैप्चर करें। प्रतिनिधि परिणामों (नीचे) में 2-स्लाइस और 4-स्लाइस विधियों की सटीकता की तुलना की जाती है। 2-स्लाइस दृष्टिकोण में, एकल एक्सवाई और वाईजेड स्कैन नियोजित हैं। 4-स्लाइस दृष्टिकोण में, मायोटोम वॉल्यूम का अधिक सटीक अनुमान देने के लिए तीन वाईजेड स्कैन का औसत निकाला जाता है। यदि कॉन्फोकल सॉफ़्टवेयर द्वारा आवश्यक हो, तो स्कैन फ़ील्ड को फिर से उन्मुख करें।
    1. एक चयनित एंटेरोपोस्टीरियर स्थिति में मछली के एंटेरोपोस्टीरियर अक्ष के लंबवत चुने हुए सोमाइट के पार एक सटीक पृष्ठीय से उदर रेखा खींचें। एक जेड-स्टैक लाइन स्कैन करें।
    2. वाईजेडए, वाईजेडएम और वाईजेडपी को पकड़ने के लिए चयनित मायोटोम के साथ परिभाषित एंटेरोपोस्टीरियर स्थितियों पर वाईजेड लाइन स्कैन को तीन बार दोहराएं। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 ए में दिखाए गए हैं। इन छवियों को संबंधित XY छवि के साथ नाम दें और सहेजें।
      नोट: वाईजेड विमानों के चयन पर: मायोटोम वी-आकार का है और विकास के दौरान इसका रूप बदल जाता है। 4-स्लाइस विधि के साथ मायोटोम 17 वॉल्यूम का सबसे सटीक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए, वाईजेडए को मायोटोम के पूर्ववर्ती सिरे पर, वाईजेडपी को पृष्ठीय और उदर चरम सीमाओं पर मायोटोम के पीछे की युक्तियों पर और वाईजेडएम को वाईजेडए और वाईजेडपी के बीच आधे रास्ते में रखें। यह मानते हुए कि सोमाइट समान रूप से पतला होता है, प्रत्येक वाईजेड खंड से माप का औसत समग्र रूप से मायोटोम का प्रतिनिधित्व करेगा। 2-स्लाइस विधि के लिए, एकल वाईजेड स्कैन को क्षैतिज मायोसेप्टम के पीछे के छोर पर तैनात किया जाना चाहिए, जो मोटे तौर पर मायोटोम ऑफ इंटरेस्ट (जैसे वाईजेडएम) के एंटेरोपोस्टीरियर केंद्र से मेल खाता है। वैकल्पिक रूप से, क्षैतिज मायोसेप्टम के पूर्ववर्ती, मध्य और पीछे तीन वाईजेड वर्गों का एक सेट लिया जा सकता है, लेकिन, जैसा कि नीचे दिखाया गया है, इस तरह के माप मायोटोम वॉल्यूम (क्रमशः रोस्ट्रल और पुच्छल सोमाइट्स के लिए, मायोटोम टेपरिंग के कारण) का थोड़ा अधिक या कम अनुमान लगाएंगे। मूल रूप से, मछली और प्रयोगों के बीच वाईजेड स्लाइस प्लेन (एस) की स्थिति में स्थिरता प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है।

4. विश्लेषण

  1. चूंकि मायोटोम एक वर्गीकृत तरीके से मछली के साथ आकार बदलता है, तुलनात्मक अध्ययन में हमेशा एक ही सोमाइट के साथ काम करता है।
  2. मायोटोम वॉल्यूम को मापने और गणना करने के लिए, कॉन्फोकल सॉफ़्टवेयर (जैसे ज़ीस ज़ेन माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बनाई गई .lsm फ़ाइलें) या ओपन-सोर्स यूनिवर्सल इमेज एनालिसिस सॉफ़्टवेयर, जैसे फिजी / ImageJ का उपयोग करें।
    नोट: यदि फ़ाइल स्वरूप बदलते हैं, तो सुनिश्चित करें कि Z-चरण आकार सही ढंग से स्थानांतरित किया गया है, क्योंकि सभी सॉफ़्टवेयर मालिकाना कॉन्फोकल फ़ाइल स्वरूपों को सही ढंग से नहीं पढ़ सकते हैं। उदाहरण के लिए, ज़ेन लाइन स्कैन छवि को फिजी में आयात करने के लिए, पहले पूर्ण रिज़ॉल्यूशन छवि विंडो - एकल विमान प्रारूप में .tif के रूप में निर्यात करने के लिए फ़ाइल / निर्यात कमांड का उपयोग करें, और फिर फिजी में आयात करें। यद्यपि YZ scan.lsm को सीधे फिजी में खोला जा सकता है, परिणामस्वरूप YZ छवियां आमतौर पर Z चरण आकार के गलत मूल्यांकन के कारण Z आयाम में संकुचित होती हैं।
  3. ZEN का उपयोग कर विश्लेषण
    1. सबसे पहले, ZEN में XY scan.lsm फ़ाइलें खोलें। ग्राफ़िक्स टैब पर जाएँ और पंक्ति उपकरण का चयन करें. सोमाइट 17 के दो ऊर्ध्वाधर मायोसेप्टा के बीच एक रेखा खींचें जो पूरे मायोटोम लंबाई (मछली के एंटेरोपोस्टेरियर अक्ष के समानांतर) तक फैली हुई है। माप के मानों को प्रकट करने के लिए M बॉक्स की जाँच करें (लंबाई = 89.71 μm, पूरक फ़ाइल 2 देखें)।
    2. YZ scan.lsm फ़ाइलें खोलें। ग्राफ़िक्स टैब के अंतर्गत, बंद बेज़ियर उपकरण का चयन करें। मायोटोम की परिधि के चारों ओर खींचें। एक बार पूरा होने के बाद, एम बॉक्स को चेक करें, इससे माप का मान प्रकट होगा (क्षेत्र = 11980.01 μm2, पूरक फ़ाइल 3 देखें)।
    3. स्प्रेडशीट में मैन्युअल रूप से प्रत्येक माप के मूल्यों को रिकॉर्ड करें। आवश्यकतानुसार सीएसए माप का औसत निकालें। मायोटोम के आयतन की गणना वॉल्यूम = मायोटोम लंबाई x CSA के रूप में की जा सकती है, अर्थात, 89.71 μm x 11980.01 μm2 = 1.075 x 106 μm3।
  4. फिजी/इमेजजे का उपयोग कर विश्लेषण
    1. Fiji/ImageJ में XY scan.lsm फ़ाइलें खोलें। जांचें कि फिजी में सीधे खोले गए एक्सवाई चित्रों को पैमाने में सही ढंग से कैलिब्रेट किया गया है, जैसा कि उन्हें होना चाहिए।
    2. चिह्नों से सीधी रेखा उपकरण का चयन करें. चरण 4.3.1 में वर्णित सोमाइट 17 की लंबाई के साथ एक रेखा खींचें। विश्लेषण पर जाकर माप पैरामीटर सेट करें, फिर माप सेट करें का चयन करें ..., और निम्न बॉक्स क्षेत्र और प्रदर्शन लेबल की जाँच करें। मापने के लिए, बस हॉट कुंजी एम दबाएं, या विश्लेषण मेनू पर जाएं और माप का चयन करें। परिणामी पॉप-अप विंडो सभी माप मानों को सूचीबद्ध करती है (यानी, लंबाई = 90.023 μm; पूरक फ़ाइल 4 देखें)। परिणामों को .csv के रूप में सहेजा जा सकता है और बाद के विश्लेषण के लिए Microsoft Excel या इसी तरह खोला जा सकता है।
    3. YZ छवियों पर CSA को मापने के लिए, चरण 4.2 में वर्णित .tif प्रारूप में YZ छवियों को खोलें।
    4. वाईजेड .tif छवियों को कैलिब्रेट करें क्योंकि निर्यात किए जाने पर वे अनकैलिब्रेट होते हैं। अंशांकन के लिए पैरामीटर चयनित छवियों की जानकारी पर जाकर ZEN में प्राप्त किए जा सकते हैं: स्केलिंग X (0.489 μm) और स्केलिंग Z मान (0.890 μm; पूरक फ़ाइल 5 देखें) रिकॉर्ड करें। इसके बाद, जबकि छवियां फिजी में खुली हैं, छवि पर जाएं और गुणों का चयन करें ...। पिक्सेल चौड़ाई और पिक्सेल ऊंचाई के लिए इनपुट 0.489 μm, और Voxel Depth के लिए 0.890 μm। यदि वाईजेड छवियों का बार-बार माप अपेक्षित है तो अंशांकन को सार्वभौमिक रूप से लागू करने के लिए ग्लोबल बॉक्स की जाँच करें (पूरक फ़ाइल 6 देखें)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी वाईजेड छवियों को एक ही स्कैनिंग पैरामीटर का उपयोग करके कैप्चर किया गया है; फिजी/इमेजजे को पुनरारंभ करें या अंशांकन मानों को संशोधित करें यदि अंशांकन का एक नया सेट आवश्यक है।
    5. कैलिब्रेटेड वाईजेड छवियों के सीएसए को मापने के लिए, आइकन से बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें। सोमाइट की परिधि के चारों ओर खींचें, और माप के मूल्यों को प्रकट करने के लिए M दबाएं (क्षेत्र = 11980.395 μm2; पूरक फ़ाइल 7 देखें)। मायोटोम के आयतन की गणना वॉल्यूम = मायोटोम लंबाई x CSA के रूप में की जा सकती है, अर्थात, 90.023 μm x 11980.395 μm2 = 1.079 x 106 μm3।
    6. अन्य XY और YZ छवियों पर माप दोहराएं। स्थिरता के लिए एक प्रयोगात्मक श्रृंखला के भीतर सभी मापों के लिए एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। प्रत्येक सॉफ्टवेयर से आयतन अनुमान समान है, लेकिन अलग-अलग ड्राइंग टूल के कारण समान नहीं है, अर्थात, ZEN = 1.074 × 106 μm3 और Fiji/ ImageJ = 1.079 × 106 μm3। दो समय बिंदुओं (यानी, 3 से 4 डीपीएफ) के बीच मायोटोम की वृद्धि की गणना इस प्रकार की जा सकती है: (वॉल्यूम 4 डीपीएफ - वॉल्यूम 3 डीपीएफ)/ वॉल्यूम 3 डीपीएफ × 100%।
      नोट: त्रुटि और उसके सुधार पर। माउंटिंग के दौरान, मछली को क्रमशः याव और रोल से बचने के लिए क्षैतिज के जितना संभव हो सके अपने विमान (यानी, एंटेरोपोस्टेरियर और डोरसोवेंट्रल अक्षों) के साथ केंद्रित किया जाना चाहिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि एक्सवाई स्कैन से मापा गया मायोटोम लंबाई एल और वाईजेड स्कैन से मापा गया सीएसए दोनों का अधिक अनुमान लगाया जाएगा यदि मछली तिरछे एंटेरोपोस्टेरियर माउंटिंग के कारण याव (डोर्सोवेंट्रल अक्ष के चारों ओर रोटेशन) दिखाती है। धारा 3 में वर्णित स्कैनिंग के बाद न तो पिच और न ही रोल को माप को प्रभावित करना चाहिए। फिर भी, डोर्सोवेंट्रल रोटेशन (रोल) छवि की गुणवत्ता को कम करता है। सरल त्रिकोणमिति से पता चलता है कि 10° तक याव आयतन माप में 3% त्रुटि देगा, जैसा कि मापा गया L और CSA प्रत्येक (cosq)-1 के अनुपात में वृद्धि करता है, जहां q पूर्ववर्ती क्षैतिज (याव) से दूर कोण है। 15° और 20° की छूट क्रमशः 7% और 13% आयतन के अनुमानों से अधिक देगी।
      चूंकि नोटोकॉर्ड बेलनाकार है, इसलिए वाईजेड स्कैन में पूरे नोटोकॉर्ड को शामिल करने का उपयोग प्रमुख और मामूली अक्षों के अभिविन्यास और परिमाण से झुकाव के कोण और सीमा की गणना करने के लिए किया जा सकता है और इस तरह सटीकता को अधिकतम करने के लिए मापा एल और सीएसए को सही किया जा सकता है। सही सीएसए = मापा गया सीएसए एक्स नोटोकोर्ड मामूली अक्ष / नोटोकॉर्ड प्रमुख अक्ष। माइक्रोस्कोप जेड दिशा में सही एल = मापा गया एल एक्स नोटोकॉर्ड माइनर अक्ष/ नोटोकॉर्ड अक्ष।
      एक और विचार एल के अतिरिक्त सुधार की अनुमति देता है। जैसे-जैसे मायोटोम बढ़ता है, यह कोरोनल प्लेन (डोरसोवेंट्रल अक्ष के लिए सामान्य) में तिरछा हो जाता है जैसे कि औसत दर्जे का मायोटोम पार्श्व मायोटोम के थोड़ा पूर्ववर्ती होता है। पृष्ठीय से देखने पर, बाईं और दाईं ओर ऊर्ध्वाधर मायोसेप्टा एक व्यापक शेवरॉन पॉइंटिंग एंटीरियर बनाता है। यदि याव कम है, तो यह आकृति विज्ञान एल के माप को प्रभावित नहीं करता है। लेकिन अगर याव महत्वपूर्ण है, तो त्रिकोणमितीय सुधार चुनौतीपूर्ण हो जाता है और एक बेहतर तरीका यह है कि दो बिंदुओं के एक्सवाईजेड निर्देशांक का अनुमान लगाकर सीधे ट्रू एल को मापा जाए जहां पूर्ववर्ती और पीछे के ऊर्ध्वाधर मायोसेप्टा क्षैतिज मायोसेप्टम पर नोटोकॉर्ड से मिलते हैं। सरल त्रिकोणमिति इन निर्देशांकों से सत्य L की गणना की अनुमति देती है क्योंकि L = SQRT [(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]। इस अंतिम दृष्टिकोण की कमजोरियां यह हैं कि ए) बिंदुओं का चयन ऑपरेटर के साथ भिन्न हो सकता है और बी) चुने गए बिंदुओं का कोई दृश्य रिकॉर्ड बरकरार नहीं रखा जाता है। यह विचार सीएसए सुधार को प्रभावित नहीं करता है।

5. वैकल्पिक विधि: मांसपेशियों की विद्युत गतिविधि को हटा दें और फिर से पेश करें

  1. एक उत्तेजना कक्ष बनाएं।
    1. एक 6 x 35 मिमी वेल प्लेट लें, एक संकीर्ण सोल्डरिंग आयरन का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के प्रत्येक तरफ दो छोटे उद्घाटन (<5 मिमी व्यास, 1 सेमी अलग) बनाएं (चित्र 1 देखें)।
      नोट: गर्म सोल्डरिंग आयरन को देखभाल के साथ संभालें और वाष्प को साँस लेने से बचने के लिए वांछित होने पर फ्यूम हुड में काम करें।
    2. प्रत्येक कुएं के उद्घाटन के माध्यम से चांदी या प्लैटिनम तारों (~ 20 सेमी लंबे) की एक जोड़ी को पिरोएं (चित्र 1 देखें)। पुन: प्रयोज्य चिपकने वाली सामग्री (जैसे, ब्लूटैक) को तारों को रखने के लिए उद्घाटन के पास लागू किया जा सकता है, और तारों के बीच 1 सेमी पृथक्करण सुनिश्चित किया जा सकता है (चित्र 1 देखें)।
  2. 3 डीपीएफ पर, मछली को तीन स्थितियों में विभाजित करें: मछली मध्यम नियंत्रण, निष्क्रिय, और निष्क्रिय + स्टिम।
    1. निष्क्रिय और निष्क्रिय + स्टिम समूहों के लिए, ट्राइकेन (0.6 एमएम) के साथ निषेचन (एचपीएफ) के 72 घंटे बाद लार्वा को एनेस्थेटाइज करें।
      नोट: संदर्भ38 के बाद, मछली में जोड़ने से पहले ट्राइकेन स्टॉक के जमे हुए एलिकोट को पिघलाया और पतला किया जाता है (40 μL / mL मछली माध्यम, 0.6 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए)। मछली युक्त पानी में सीधे ट्राइकेन न जोड़ें, क्योंकि कुछ मछलियों को उच्च खुराक मिल सकती है। ट्राइकेन स्टॉक का उपयोग एक महीने के भीतर किया जाना चाहिए और कभी भी फिर से जमे हुए नहीं होना चाहिए।
    2. मछली मध्यम नियंत्रण मछली के लिए, उन्हें अन-एनेस्थेटाइज्ड छोड़ दें।
  3. ट्राइकेन एक्सपोजर (यानी, 80 एचपीएफ पर) की शुरुआत के बाद चयनित समय पर, उत्तेजना के लिए निष्क्रिय + स्टिम समूह तैयार करें।
    1. 2% अगारोस के 60 एमएल तैयार करें (मछली माध्यम के 60 एमएल में 1.2 ग्राम अगारोस पाउडर), और माइक्रोवेव का उपयोग करके पूरी तरह से पिघलें, ठंडा करें, ट्राइकेन जोड़ें और उत्तेजना कक्ष के प्रत्येक कुएं में 4 एमएल डालें (चित्रा 1)।
    2. वांछित आयामों के प्लास्टिक (जैसे, पॉलीप्रोपाइलीन) को काटकर और सुपरग्लू का उपयोग करके एक साथ चिपकाकर इलेक्ट्रोड के बीच में तुरंत कस्टम-निर्मित 4-वेल कंघी जोड़ें; चित्रा 1 देखें)। जेल सेट होने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें। चार आयताकार कुएं बनाने के लिए कंघी को सावधानी से हटा दें।
    3. प्रत्येक कुएं को ट्राइकेन पानी से भरें और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में एक एकल एनेस्थेटाइज्ड इनएक्टिव + स्टिम लार्वा रखें, जिसमें इलेक्ट्रोड के लंबवत उनकी एंटेरोपोस्टीरियर अक्ष हो ( चित्र 1 देखें)।
    4. विच्छेदन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि क्या प्रत्येक मछली कक्ष के प्रत्येक कुएं के भीतर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है।
  4. कक्ष के एक तरफ प्रत्येक इलेक्ट्रोड से जुड़े मगरमच्छ क्लिप का उपयोग करके, एक ध्रुवीयता नियंत्रक के माध्यम से कक्ष में एक समायोज्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैटर्न-जनरेटिंग उत्तेजक को कनेक्ट करें ( चित्रा 1 देखें)।
    नोट: ध्रुवीयता नियंत्रक का उपयोग हर 5 सेकंड में ध्रुवीयता को उलटने के लिए किया जाता है, ताकि इलेक्ट्रोड के इलेक्ट्रोलिसिस और संक्षारण को रोका जा सके।
  5. मछली को उत्तेजित करें। उदाहरण के लिए, 200, 20 वी दालों की ट्रेन के साथ 1 एस, 0.5 एमएस पल्स अवधि और 4.5 एमएस पल्स सेपरेशन के साथ, हर 5 सेकंड में एक बार प्रभावी बार-टेटेनिक संकुचन प्रतिरोध शासन देता है।
  6. मछली को उत्तेजित करने की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत नियमित रूप से जांच करें; उदाहरण विद्युत उत्तेजना को हर 5 सेकंड में एक बार एक दृश्यमान द्विपक्षीय संकुचन और मामूली आंदोलन को प्रेरित करना चाहिए।
  7. एक प्रतिरोध / उच्च बल शासन के लिए, मछली को 5 मिनट, तीन बार के मुकाबले के लिए उच्च आवृत्ति पर उत्तेजित करें, प्रत्येक मुकाबले को 5 मिनट के आराम से अलग किया जाए।
    नोट: जबकि कक्ष के एक तरफ मछली आराम कर रही है, मगरमच्छ क्लिप को कक्ष के दूसरी तरफ इलेक्ट्रोड जोड़ी से जोड़ा जा सकता है, और उन अतिरिक्त मछलियों को उत्तेजित किया जा सकता है।
  8. उत्तेजना के बाद, सावधानीपूर्वक प्रत्येक कुएं से मछली को प्लास्टिक पिपेट के साथ धीरे से बाहर निकालें और ताजा ट्राइकेन युक्त मछली माध्यम में इनक्यूबेटर में लौटें।
  9. कक्ष के भीतर से ट्राइकेन के पानी को दूर डालें और चारों ओर काटने और प्रत्येक कुएं से अगारोस को हटाने के लिए बल का उपयोग करें। नल के पानी से कुओं को धोएं और सूखने दें।
    नोट: यदि चांदी के तार इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, तो कभी-कभी उत्तेजना प्रयोग के बाद तार की सतह पर सिल्वर ऑक्साइड जमा हो सकता है। चूंकि सिल्वर ऑक्साइड चांदी की तुलना में कम प्रवाहकीय है, प्रजनन क्षमता बनाए रखने के लिए, सेटअप का फिर से उपयोग करने से पहले किमविप्स का उपयोग करके तार से चांदी ऑक्साइड को सावधानीपूर्वक रगड़ें।

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Representative Results

सोमाइट आयतन का एक तीव्र और सटीक माप
नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण की एक विधि जो ज़ेब्राफिश लार्वा में मांसपेशियों की वृद्धि के तेजी से माप की अनुमति देती है, का वर्णन किया गया है। मांसपेशियों के आकार को जीवित जानवरों में एक झिल्ली-लक्षित जीएफपी (β-एक्टिन: एचआरएएस-ईजीएफपी) या एमचेरी (α-एक्टिन: एमचेरी-सीएएएक्स) के साथ उनके प्लाज्मा झिल्ली पर लेबल की गई मछली का उपयोग करके मापा जा सकता है। लार्वा को ट्राइकेन का उपयोग करके क्षणिक रूप से एनेस्थेटाइज किया गया था, जिसे कम पिघलने वाले बिंदु अगारोस में रखा गया था और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था। सोमाइट 17 को ट्रंक-टेल इंटरफ़ेस31 पर इसकी पहुंच को देखते हुए मांसपेशियों के आकार के विश्लेषण के लिए चुना गया था। व्यवहार में, सिद्धांत रूप में, मायोटोम वॉल्यूम की गणना मायोटोम लंबाई (एल) और तीन क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र उपायों (सीएसए) के औसत के रूप में की जा सकती है (चित्रा 2 ए, जिसे 4-स्लाइस विधि के रूप में जाना जाता है)।

इस विधि को मान्य करने के लिए, जीवित ज़ेब्राफिश लार्वा (चित्रा 2 बी) के पूरे मायोटोम कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स प्राप्त किए गए थे, और सोमाइट वॉल्यूम की गणना प्रत्येक स्लाइस (80-100 स्लाइस) में सोमाइट 17 प्रोफाइल क्षेत्रों के योग को अंतर-स्लाइस दूरी (1-1.2 μm) से गुणा करके की गई थी। गणना के 4-स्लाइस और पूर्ण स्टैक विधियों (चित्रा 2 सी) के बीच एक मजबूत सहसंबंध देखा गया था। हालांकि, 4-स्लाइस विधि ने आम तौर पर थोड़ा बड़ा मात्रा अनुमान (~ 2% औसत पर बड़ा) दिया (चित्रा 2 डी)। यह अंतर या तो ए) गलती से बड़ी मात्रा माप देने वाले नमूनों की अस्पष्टता या बी) इस अवलोकन के कारण हो सकता है कि जेब्राफिश मायोटोम एंटेरोपोस्टेरियर अक्ष के साथ कम होते हैं, जानवर की पूंछ की ओर छोटे होते हैं। जैसा कि वाईजेडए, वाईजेडएम और वाईजेडपी सीएसए माप सोमाइट 17 मायोटोम शेवरॉन (चित्रा 2 ए) के पूर्ववर्ती भाग की ओर हैं, बाद की व्याख्या का परीक्षण सोमाइट 16 और 18 के मायोटोम के वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण द्वारा किया गया था। प्रत्येक सोमाइट पीछे वाले की तुलना में लगभग 7% बड़ा था (चित्रा 2 ई)। आगे के विश्लेषण से पता चला है कि एक 2-स्लाइस विधि जिसमें केवल एक वाईजेड माप की आवश्यकता होती है, सोमाइट के बीच में स्थित है, जहां एपेक्सियल और हाइपैक्सियल हाफ क्षैतिज मायोसेप्टम (वाईजेडएम) पर मिलते हैं, और एक्सवाई स्लाइस, मायोटोम वॉल्यूम (चित्रा 2 एफ, जी) का यथोचित सटीक अनुमान देता है। 2-स्लाइस दृष्टिकोण अधिक तेजी से डेटा अधिग्रहण को सक्षम बनाता है जब समय की कमी स्कैन की जा सकने वाली मछलियों की संख्या को सीमित करती है। सारांश में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि जीवित ज़ेबराफिश लार्वा में मायोटोम की मात्रा को तेजी से और सटीक रूप से मापा जा सकता है। एकल लार्वा को सफलतापूर्वक, बार-बार, इस विधि के साथ 6-दिवसीय अवधि में मापा गया था।

एक पहचाने गए ऊतक इकाई के विकास के तुलनात्मक अध्ययन के लिए, वर्णित विधि विश्वसनीय और सटीक मात्रा अनुमान प्रदान करती है। सटीक पूर्ण वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए, हालांकि, कई संशोधन लागू किए जा सकते हैं। सबसे पहले, इमेजिंग के दौरान बेहतर अनुप्रस्थ वाईजेड और पैरा-इटल एक्सवाई स्लाइस प्राप्त करने के लिए डिश या माइक्रोस्कोप चरण को झुकाकर या वाईजेड स्लाइस में नोटोकॉर्ड प्रोफाइल का उपयोग करके तिरछे माउंटिंग के कारण होने वाली त्रुटियों के लिए सुधार किया जा सकता है; क्रॉस-अनुभागीय मामूली अक्ष बेलनाकार नोटोकॉर्ड के सही व्यास को प्रकट करता है, जबकि इसकी प्रमुख धुरी झुकाव के कोण और परिमाण को प्रकट करती है (ऊपर बिंदु 4.6 में नोट देखें)। दूसरा, स्कैनिंग के दौरान एक्सवाई और वाईजेड सेक्शनिंग के स्थान को वांछित मायोटोम (ओं) को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए चुना जाना चाहिए। (ऊपर बिंदु 4.6 में नोट देखें)। ध्यान दें, हालांकि, मायोटोम शेवरॉन का रूप विकास चरण के आधार पर बदलता है और वाईजेड स्कैन का चयन करते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। अंत में, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या मायोटोम 17 में परिवर्तन पूरे अक्ष में मांसपेशियों की वृद्धि को दर्शाते हैं, ट्रंक या पूंछ क्षेत्रों में आगे मायोटोम को वर्णित विधि द्वारा मापा जा सकता है।

बार-बार माप से सोमाइट वृद्धि का पता चलता है
वर्णित विधि का एक लाभ एकल मछली पर बार-बार विश्लेषण की आसानी है। व्यक्तिगत भ्रूण और लार्वा को स्पष्ट दीर्घकालिक प्रभावों (चित्रा 2 एच) को पीड़ित किए बिना बार-बार एम्बेडेड, मापा और जारी किया जा सकता है। मायोटोम 2 और 5 डीपीएफ के बीच एल और सीएसए दोनों में पता लगाने योग्य रूप से बढ़ता है, जिससे मात्रा में लगातार वृद्धि होती है (चित्रा 2 एच)। 1 और 8 डीपीएफ के बीच इस तरह से विकास की छवि बनाई गई थी और इमेजिंग के बाद लार्वा भी जारी किए गए थे और वयस्कता तक बढ़े थे। देर से लार्वा अवधि में आगे विश्लेषण संभव होने की उम्मीद है, हालांकि भोजन व्यवहार पर बार-बार इमेजिंग के प्रभावों को उन भाई-बहनों के साथ तुलना पर सावधानीपूर्वक निगरानी करने की आवश्यकता होगी जो चित्रित नहीं हैं। महत्वपूर्ण रूप से, रंजकता का विकास इमेजिंग को अस्पष्ट कर सकता है। जबकि पिग्मेंटेशन ठीक से केंद्रित मछली में एक समस्या नहीं है, क्योंकि मेलानोफोर धारियां आवश्यक माप को नहीं रोकती हैं, वर्णक तिरछे माउंटेड नमूनों में अधिक समस्याग्रस्त हो सकता है। पिग्मेंटेशन उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग, जैसे कि रॉय;मिटफा39, का अनुमान है, जो विकास माप की समय खिड़की का विस्तार करेगा जब तक कि व्यावहारिक कॉन्फोकल स्कैन गहराई की सीमा तक नहीं पहुंच जाता।

वर्णित प्रक्रिया का एक और लाभ छोटी अवधि में उनके पूरे मायोटोम की तुलना में एकल फाइबर के विकास के विस्तृत विश्लेषण में आसानी है। डीएनए इंजेक्शन के माध्यम से फाइबर के मोज़ेक लेबलिंग द्वारा, 4 घंटे से अधिक व्यक्तिगत पहचाने गए फाइबर में परमाणु अधिग्रहण और विकास का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित की गई थी, और फिर बाद के समय में पुन: विश्लेषण की अनुमति दी गई थी (चित्रा 2 आई)। इसके अलावा, पूरे मायोटोम की वृद्धि को 12 घंटे या उससे कम26 से मापा जा सकता है (और डेटा नहीं दिखाया गया है)। एक ही मछली को बार-बार मापने से, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता समाप्त हो जाती है और जानवरों की एक छोटी संख्या सांख्यिकीय रूप से मजबूत परिणाम दे सकतीहै।

जोड़तोड़ जो सोमाइट मात्रा को बदलते हैं, आसानी से पता लगाया जा सकता है
वर्तमान प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक और शारीरिक स्थितियों के तहत मांसपेशियों की वृद्धि में परिवर्तन से पूछताछ करने की अनुमति देता है, जैसे कि परिवर्तित शारीरिक निष्क्रियता। एनेस्थेटिक ट्राइकेन, जो वोल्टेज-गेटेड एनए + चैनल40 को रोककर तंत्रिका क्रिया क्षमता को अवरुद्ध करता है, का उपयोग β-एक्टिन: एचआरएएस-ईजीएफपी लार्वा में मांसपेशियों की निष्क्रियता को प्रेरित करने के लिए किया गया था। जैसा कि पहले दिखाया गयाहै 26, तीसरे और चौथे डीपीएफ के बीच 24 घंटे के लिए निष्क्रियता ने मायोटोम की मात्रा को बहुत कम कर दिया, यह दर्शाता है कि लार्वा की मांसपेशियों की वृद्धि गतिविधि-निर्भर है (चित्रा 3 ए)। निष्क्रियता के प्रभाव की जांच अन्य पहचान विधियों का उपयोग करके भी की जा सकती है जो सोमाइट की संरचना को प्रकट करते हैं, जैसे कि एमचेरी-सीएएएक्स (या तो ट्रांसजेनिक लाइन में या एमआरएनए इंजेक्शन द्वारा) या बीओडीआईपीवाई डाई में लार्वा के रात भर विसर्जन द्वारा (चित्रा 3 ए)। बाद के दृष्टिकोण, ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि पर मछली को पार करने या भ्रूण इंजेक्ट करने की आवश्यकता को हटाते हुए बीओडीआईपीवाई की विषाक्तता के कारण बार-बार माप के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, वर्तमान विधि मांसपेशियों के ऊतकों की मात्रा में परिवर्तन को मापने की अनुमति देती है।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, आनुवंशिक अंकन विधियों का उपयोग मायोटोम वॉल्यूम के बार-बार माप करने के लिए किया जा सकता है, जिससे व्यक्तिगत मछली में लगातार दिनों में मांसपेशियों के आकार में परिवर्तन की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। चूंकि एक ही विकास चरण में अलग-अलग मछली और संपूर्ण लेस पूर्ण मायोटोम वॉल्यूम (चित्रा 3 ए; शायद अंडे के आकार या स्वास्थ्य के कारण) में भिन्न होते हैं, प्रत्येक व्यक्ति के विकास को मापने की क्षमता युग्मित नमूना सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देकर व्यक्तिगत भिन्नता के प्रभाव को कम करती है। बार-बार एक ही मछली को मापने से प्रभावों का पता लगाने के लिए आवश्यक मछली की संख्या कम हो जाती है। इस प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, सक्रिय और निष्क्रिय लार्वा की आबादी में 3 से 4 डीपीएफ तक प्रत्येक व्यक्ति के विकास का विश्लेषण करने के परिणामों की तुलना 4 डीपीएफ पर किए गए मायोटोम आकार के केवल एक माप का उपयोग करके समान दो आबादी के विश्लेषण के साथ की गई थी। प्रत्येक व्यक्ति के लिए 4/3 डीपीएफ मात्रा को मापने की तुलना में केवल 4 डीपीएफ पर मायोटोम वॉल्यूम को मापते समय मायोटोम आकार की स्पष्ट कमी में बड़ी भिन्नता देखी गई (चित्रा 3 बी)। 4/3 डीपीएफ विधि (78% -89%) और दो उपायों के बीच कमजोर सहसंबंध की तुलना में केवल 4 डीपीएफ माप में कमी (68% -91%) की अधिक सीमा पर ध्यान दें। यद्यपि, जैसा कि अपेक्षित था, सभी 13 जैविक प्रतिकृतियों में औसत कमी प्रत्येक मूल्यांकन (चित्रा 3 सी) में 4/3 डीपीएफ विधि के लिए 82.62 ± 1.01% (एसईएम, एन = 13 के ±) और 4 डीपीएफ विधि के लिए 82.31 ± 1.92% थी, 4 डीपीएफ केवल विधि के साथ अनुमानित त्रुटि 4/3 डीपीएफ विधि के साथ लगभग दोगुनी थी। इस प्रकार, बार-बार माप के माध्यम से व्यक्तिगत विकास की मात्रा निर्धारित करना अधिक सटीक तरीका है, एक ही क्षेत्र के भीतर मछली के बीच आकार परिवर्तनशीलता को समाप्त करके, जैसा कि पहले दिखाया गयाथा। बहरहाल, चूंकि केवल 4 डीपीएफ (चित्रा 3 सी) पर मायोटोम वॉल्यूम को मापते समय निष्क्रियता के कारण मायोटोम वॉल्यूम में कमी में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था, डेटा से पता चलता है कि ~ 6-8 मछली एक ले के भीतर अंतर-व्यक्तिगत आकार के अंतर को औसत करने के लिए पर्याप्त हैं। स्पष्ट रूप से, जब आकार परिवर्तन छोटे होते हैं तो 4/3 डीपीएफ विधि को प्राथमिकता दी जाती है।

विकास के सेलुलर आधार का विश्लेषण
मायोटोम सीएसए मांसपेशी फाइबर संख्या और फाइबर आकार द्वारा निर्धारित किया जाता है। फाइबर संख्या का अनुमान तीन वाईजेड वर्गों ( वाईजेड ए, वाईजेड एम, वाईजेडपी) पर तेज और धीमे फाइबर कीसंख्या कीगणना करके लगाया जा सकता है। यद्यपि दो आसन्न मायोटोम के क्षेत्र ऐसे वाईजेड वर्गों में निहित हैं, जैसा कि अधिकांश वर्गों (चित्रा 2 ए) में ऊर्ध्वाधर मायोसेप्टा (वीएम) की उपस्थिति से दिखाया गया है, ये गिनती फाइबर संख्या को सटीक रूप से दर्शाती है। वीएम (चित्रा 4 ए) में प्रत्येक आसन्न खंड से फाइबर के जोड़े के टेपरिंग के कारण वीएम पर ओवर-काउंटिंग होती है। इस तरह के ओवरकाउंटिंग को निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके हिसाब लगाया जा सकता है: फाइबर संख्या = कुल फाइबर गिनती - (वीएम के संपर्क में फाइबर) / 2 संदर्भ33। इसके अलावा, औसत फाइबर की मात्रा को फाइबर की संख्या से मायोटोम वॉल्यूम को विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है। हमने इन विश्लेषणों का उपयोग यह प्रकट करने के लिए किया है कि गतिविधि विकास के दोनों सेलुलर पहलुओं को नियंत्रित करती है (चित्रा 4 बी, सी)।

यह चित्रा 2 ए से स्पष्ट है कि फाइबर मायोटोम में आकार में भिन्न होते हैं, एक वास्तविकता जो गणना की गई औसत फाइबर मात्रा माप में परिलक्षित नहीं होती है। दो मछलियों से सोमाइट 17 के प्रत्येक फाइबर के चारों ओर खींचकर, मापा फाइबर क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र 28 μm2 से 217 μm2 (चित्रा 4D) तक दिखाया गया था। वास्तव में, हालांकि, कई फाइबर मायोटोम के भीतर तिरछे रूप से कोण किए जाते हैं, इसलिए इस तरह के सीएसए उपाय इसकी लंबी धुरी के लंबवत फाइबर के सच्चे सीएसए को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसके विपरीत, मायोटोम के भीतर तंतुओं के अलग-अलग कोणों के कारण, झुकाव पर चलने वाले सभी फाइबर जो पूर्ववर्ती रूप से संरेखित नहीं होते हैं, उनकी लंबाई मायोटोम लंबाई से भिन्न होती है। इन चेतावनियों के बावजूद, जिन्हें केवल एकल फाइबर वॉल्यूम में मायोटोम के पूर्ण विभाजन द्वारा या प्रत्येक फाइबर के झुकाव के कोण को मापने के बाद गणना करके दरकिनार किया जा सकता है, मापा सीएसए प्रत्येक मछली में फाइबर आकार विविधता का अनुमान प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, निष्क्रियता के साथ सीएसए में व्यक्तिगत फाइबर कम हो गए, जिसके परिणामस्वरूप सक्रिय (अन-एनेस्थेटाइज्ड) नियंत्रण लार्वा (चित्रा 4 ई) के संबंध में संचयी आवृत्ति वक्र में बाईं ओर बदलाव हुआ। चूंकि निष्क्रिय मछली में सक्रिय मछली की तुलना में ~ 10 कम फाइबर होते हैं (चित्रा 4 बी), या तो सक्रिय गैर-एनेस्थेटाइज्ड मछली से 10 सबसे छोटे फाइबर (इस धारणा पर कि वे नए हैं) या 10 सबसे बड़े (वैकल्पिक चरम के रूप में) को तुलना से हटा दिया गया था, जिससे पता चला कि मायोटोम की मात्रा का अधिकांश नुकसान फाइबर विकास की कमी के कारण होता है, नए फाइबर गठन की विफलता के बजाय (चित्रा 4 एफ)। एक साथ लिया गया, इन आंकड़ों से पता चलता है कि वर्णित विधि मांसपेशियों के ऊतकों के गठन और विकास पर शारीरिक गतिविधि की भूमिका की विस्तृत जांच की अनुमति देती है।

विद्युत उत्तेजना द्वारा गतिविधि का पुन: प्रभाव
मांसपेशियों की वृद्धि के लिए शारीरिक गतिविधि की आवश्यकता होती है (चित्रा 3 ए)। अन्यथा निष्क्रिय लार्वा में विद्युत उत्तेजना द्वारा मांसपेशियों के संकुचन को फिर से लागू करने की एक विधि, एक मजबूत सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया पैदा करने का वर्णन किया गया है (चित्रा 5 ए, पूरक फ़ाइल 8)। यद्यपि मांसपेशियों को अधिकतम रूप से सक्रिय करने के लिए सटीक उत्तेजना मापदंडों को यहां वर्णित किया गया है (चित्रा 5 बी), मांसपेशियों की सक्रियता और व्यायाम खुराक को नियंत्रित करने के लिए प्रोटोकॉल को बदला जा सकता है (वर्तमान आयाम, आवृत्ति, पल्स अवधि आदि को बदलकर)। इस प्रकार, वर्तमान विधि गतिविधि मुकाबलों के बीच मानकीकृत व्यवहार के साथ एक नियंत्रित गतिविधि उत्तेजना प्रदान करती है, जो व्यायाम18 के वर्तमान पशु मॉडल की एक महत्वपूर्ण सीमा पर काबू पाती है।

वर्णित विधियां मांसपेशियों की वृद्धि (जैसे, हाइपरप्लासिया और हाइपरट्रॉफी) के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा का उपयोग करने की क्षमता का प्रदर्शन करती हैं। विशेष रूप से, ज़ेब्राफिश लार्वा में मायोजेनेसिस को औषधीय रूप से प्रेरित निष्क्रियता और विद्युत-प्रेरित संकुचन के माध्यम से विश्लेषण करने योग्य दिखाया गया है। दृष्टिकोण आणविक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है जिसके द्वारा शारीरिक गतिविधि विवो में मांसपेशियों की वृद्धि की ओर ले जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: जेब्राफिश लार्वा के लिए मांसपेशी विद्युत गतिविधि के पुन: परिचय के लिए एक उत्तेजना कक्ष का डिजाइन। इलेक्ट्रोड से सुसज्जित एक 6-वेल सेल कल्चर प्लेट 2% अगारोस जेल के भीतर बने कुओं में लार्वा के रखरखाव की अनुमति देती है। कस्टम 4-वेल कंघी अलग-अलग मछली लार्वा की स्थिति और अभिविन्यास को बनाए रखने के लिए अगारोस में आयताकार कुएं (आयाम जैसा कि संकेत दिया गया है) बनाने के लिए बनाया जाता है, और उन्हें विद्युत उत्तेजना पर जोरदार चिकोटी के दौरान चांदी के तारों से संपर्क करने से रोकने के लिए बनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जीवित ज़ेब्राफिश α-एक्टिन में मांसपेशियों की मात्रा को मापना: एमचेरी-सीएएएक्स (ए, बी, ई) या β-एक्टिन: एचआरएएस-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक लार्वा (एच, आई)। लार्वा को पार्श्व दृश्य से चित्रित किया गया और ऊपरी पैनलों (ए, बी, ई) में पृष्ठीय से शीर्ष, पूर्ववर्ती से बाएं दिखाया गया। (ए) 4-स्लाइस विधि में, मायोटोम वॉल्यूम की गणना वाईजेड विमानों (वाईजेडएम, वाईजेडए, और वाईजेडपी; डैश्ड पीली रेखाओं) पर मापे गए तीन क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्रों (सीएसए) के औसत से एक्सवाई प्लेन (ब्लू एरो) पर ऊर्ध्वाधर मायोसेप्टा (वीएम) के बीच मापा गया सोमाइट 17 (एल) की लंबाई को गुणा करके की गई थी। (बी) फुल स्टैक विधि में, एक जीवित ज़ेब्राफिश लार्वा के पूरे जेड-स्टैक के प्रत्येक टुकड़े में सोमाइट 17 मायोटोम के क्षेत्र को मापा गया (उदाहरण पीले रंग में उल्लिखित) और मायोटोमल क्षेत्रों के योग को अंतर-स्लाइस दूरी से गुणा किया गया था। (सी) 4-स्लाइस और फुल स्टैक विधियों के बीच उच्च सामंजस्य। रंग व्यक्तिगत β-एक्टिन को दर्शाते हैं: एचआरएएस-ईजीएफपी (वर्ग) या α-एक्टिन: एमचेरी-सीएएएक्स (सर्कल) मछली। (डी) 4-स्लाइस विधि का उपयोग करके गणना किए जाने पर मायोटोम वॉल्यूम थोड़ा, लेकिन काफी बड़ा है। (ई) टेपरिंग जेब्राफिश लार्वा में, अधिक पूर्ववर्ती सोमाइट पीछे के सोमाइट्स की तुलना में बड़े होते हैं, जैसा कि 4-स्लाइस विधि द्वारा मापा जाता है। (F, G) तीन सीएसए अनुभागों (4-स्लाइस विधि) या एकल वाईजेडएम सीएसए (2-स्लाइस विधि) के औसत का उपयोग करके किए गए मात्रा माप के बीच मजबूत सहसंबंध। पी-मान समान विचरण (डी, जी) या बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षणों (ई) के साथ एक तरह से एनोवा के साथ दो पूंछ वाले टी-परीक्षणों के परिणाम दिखाते हैं। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। (एच) β-एक्टिन को व्यक्त करने वाली तीन अलग-अलग मछलियों (रंगों) में 2 से 5 डीपीएफ तक मायोटोम 16 वॉल्यूम, लंबाई (एल) और क्रॉस-सेक्शनल एरिया (सीएसए) का माप: एचआरएएस-ईजीएफपी और मायोग: एच 2 बी-एमआरएफपी। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर हरे व्यक्ति की वाईजेडएम छवियां ऊपर दिखाई गई हैं। (i) एकल फाइबर वृद्धि स्वचालित निरंतर-सीमा विभाजन द्वारा मापा जाता है। एक β-एक्टिन: HRAS-EGFP;myog: H2B-mRFP मछली मोज़ेकली 1-2 सेल चरण में CMV: Cerulean प्लास्मिड के इंजेक्शन द्वारा लेबल किया गया है। सोमाइट 10 में एक एकल सेरुलियन चिह्नित फाइबर को ज़ीस एलएसएम 880 पर बार-बार उच्च रिज़ॉल्यूशन पूर्ण एक्सवाईजेड ढेर के साथ स्कैन किया गया था। दिखाए गए चित्र प्रतिनिधि एकल स्लाइस (बाएं) और तीन आयामी खंडित मात्रा (दाएं) का प्रक्षेपण हैं। ग्राफ पर प्रत्येक डेटापॉइंट एक ही फाइबर के एकल स्कैन का प्रतिनिधित्व करता है, 3 डीपीएफ (0 घंटे), 4 घंटे के बाद, और 5 डीपीएफ (54 घंटे) पर। प्रजनन क्षमता दिखाने के लिए प्रति समय-बिंदु तीन प्रतियों के स्कैन किए गए और विभाजित किए गए। सफेद तीर के निशान फाइबर नाभिक को इंगित करते हैं; ध्यान दें कि दो नाभिक 3 और 5 डीपीएफ के बीच जोड़े जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सोमाइट में गतिविधि-निर्भर मांसपेशियों की वृद्धि 17. (ए) 3 और 4 डीपीएफ के बीच ट्राइकेन (गुलाबी) के आवेदन से 24 घंटे के लिए गतिविधि को बाधित करना ट्रांसजेनिक लाइनों और भाई-बहनों (नीले) पर वाहन नियंत्रण की तुलना में बीओडीआईपीवाई से सना गैर-ट्रांसजेनिक मछली दोनों में मायोटोम की मात्रा को कम करता है। मात्रा 4-स्लाइस विधि द्वारा निर्धारित की जाती है। प्रतीक आकार अलग-अलग ले (जैविक प्रतिकृति) से दोहराए गए प्रयोगों को इंगित करता है। बड़े प्रतीक एसईएम मूल्यों ± माध्य को दर्शाते हैं। छोटे बेहोश प्रतीक व्यक्तिगत प्रतिकृति लार्वा की मात्रा दिखाते हैं। (बी) 4 डीपीएफ (केवल 4 डीपीएफ, ऊपरी योजनाबद्ध) पर मायोटोम वॉल्यूम के एकल माप द्वारा निर्धारित नियंत्रित भाई-बहनों की तुलना में निष्क्रिय मछली में मायोटोम वॉल्यूम में कमी की तुलना या 3 और 4 डीपीएफ (4/3 डीपीएफ, कम योजनाबद्ध) के बीच मायोटोम वॉल्यूम में परिवर्तन। प्रत्येक प्रतीक एक एकल स्थान से ~ 5 निष्क्रिय मछली में मायोटोम 17 की औसत मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है जिसे ~ 5 सक्रिय नियंत्रण भाई-बहनों के औसत मायोटोम 17 वॉल्यूम से विभाजित किया गया है। (सी) निष्क्रिय मछली में मांसपेशियों की वृद्धि में औसत कमी में कोई अंतर नहीं देखा गया था, जब केवल 4 डीपीएफ या 4/3 डीपीएफ विधियों द्वारा मापा जाता है। सलाखों के भीतर संख्याएं विश्लेषण की गई मछलियों की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करती हैं। पी-मान बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षणों (ए) या असमान विचरण (सी) के साथ दो पूंछ वाले टी-टेस्ट के साथ दो तरफा एनोवा के परिणाम दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: निष्क्रियता के कारण मांसपेशियों की वृद्धि में सेलुलर स्तर में परिवर्तन। (ए) योजनाबद्ध रूप से दिखाया गया है कि टेपरिंग फाइबर की दोहरी गिनती के कारण वीएम में ओवरकाउंटिंग कैसे होती है जहां नीले और लाल मायोटोम मिलते हैं। ध्यान दें कि औसत फाइबर गिनती 6 है लेकिन सही औसत मान 5.5 है। सही गणना एक बेहतर अनुमान देती है। (बी, सी) सक्रिय (ब्यू) लार्वा की तुलना में निष्क्रिय (गुलाबी) में फाइबर संख्या (बी) और औसत फाइबर मात्रा (सी) कम हो जाती है। प्रतीक आकार अलग-अलग ले (जैविक प्रतिकृति) से दोहराए गए प्रयोगों को इंगित करता है। बड़े प्रतीक एसईएम मूल्यों ± माध्य को दर्शाते हैं। छोटे बेहोश प्रतीक व्यक्तिगत प्रतिकृति लार्वा के मूल्य को दर्शाते हैं। सलाखों के भीतर संख्याएं विश्लेषण की गई मछलियों की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करती हैं। (डी) एकल लार्वा में, मायोटोम 17 में प्रत्येक फाइबर प्रोफाइल को रेखांकित किया गया था और सीएसए निर्धारित किया गया था। पी-मान बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षणों (बी, सी) या समान विचरण (डी) के साथ दो पूंछ वाले टी-टेस्ट के साथ दो-तरफा एनोवा के परिणाम दिखाते हैं। ± (E, F) संचयी आवृत्ति वक्र सक्रिय नियंत्रण (नीले) और निष्क्रिय (गुलाबी) लार्वा में फाइबर आकार वितरण दिखाते हैं। सभी तंतुओं (ई) की तुलना, या अनुमानित-नवजात छोटे या, वैकल्पिक चरम पर, बड़े फाइबर (एफ) की चूक के बाद पता चलता है कि फाइबर आकार में वृद्धि होती है, फाइबर संख्या में वृद्धि नहीं होती है, मुख्य रूप से मायोटोम की गतिविधि-संचालित वृद्धि के लिए जिम्मेदार होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: संक्षिप्त विद्युत उत्तेजना एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश लार्वा में टेटेनिक मांसपेशियों के संकुचन को जन्म देती है। (ए) अनुक्रमिक छवियां ( पूरक फ़ाइल 8 में वीडियो से कैप्चर की गई) दिखाती हैं कि कैसे विद्युत उत्तेजना 3 डीपीएफ पर एनेस्थेटाइज्ड लार्वा के अधिकतम संकुचन को ट्रिगर करती है। सेकंड में समय स्केल। लाल बक्से तीन लगातार 1 एस उत्तेजना ट्रेनों की शुरुआत में आंदोलनों को इंगित करते हैं। प्रत्येक छवि एक 40 एमएस एक्सपोजर है। (B) विद्युत उत्तेजना शासन को दर्शाने वाला योजनाबद्ध, जिसमें 200 उच्च आवृत्ति, 20 V विद्युत आवेगों की 1 s ट्रेन हर 5 सेकंड में दी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: माइक्रोस्कोप एक्सवाईजेड संदर्भ फ्रेम (काली कुल्हाड़ियों) के संबंध में पूरी तरह से (शीर्ष बाएं) और अपूर्ण रूप से माउंटेड लार्वा की कैप्चर की गई छवियों की योजनाबद्धता। मायोटोम (हरा), नोटोकॉर्ड (पीला), तंत्रिका ट्यूब (टैन), मापा मायोटोमल पैरामीटर (लाल), मापा नोटोकोर्ड पैरामीटर (काले तीर), और संभव या वास्तविक मछली रोटेशन (नीला)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: ZEN में XY छवियों से सोमाइट लंबाई माप दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: ZEN में YZ छवियों से सीएसए माप दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: इमेजजे में एक्सवाई छवियों से सोमाइट लंबाई माप दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल: ZEN से YZ छवियों के लिए अंशांकन मापदंडों के निष्कर्षण को दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: फिजी / इमेजजे में वाईजेड छवियों के अंशांकन को दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 7: इमेजजे में वाईजेड छवियों से सीएसए माप दिखाने वाला स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 8: ट्राइकेन-एनेस्थेटाइज्ड 3 डीपीएफ लार्वा की प्रत्यक्ष विद्युत उत्तेजना (लंबाई 1 एस) द्वारा उत्पन्न मांसपेशियों के संकुचन को दिखाने वाले प्रतिनिधि वीडियो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां हम चरणों में या आनुवंशिक वेरिएंट में जीवित ज़ेब्राफिश लार्वा की मांसपेशियों की मात्रा के सटीक और कुशल अनुमान के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं जिसमें रंजकता इमेजिंग के लिए एक बड़ी बाधा नहीं है और जब क्षणिक संज्ञाहरण और / या स्थिरीकरण अच्छी तरह से सहन किया जाता है। जबकि हमने लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है, वर्णित दृष्टिकोण स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल या लाइट शीट माइक्रोस्कोपी और किसी भी अन्य विधि पर लागू होते हैं जो अलग-अलग फोकल विमानों पर छवियों के ढेर बनाते हैं। ऊतक आकार और सेल सामग्री आकलन के लिए तेजी से परिष्कृत दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है। प्रत्येक विधि के फायदे और सीमाएं हैं, जिन्हें हम दिखाते हैं कि मात्रा निर्धारित की जा सकती है। ऊतक विकास का अध्ययन करने में एक बड़ी सीमा वास्तविक समय में विकास परिवर्तनों का विश्लेषण करने की कठिनाई है क्योंकि तीव्र रूप से प्रशासित उत्तेजनाओं द्वारा उत्प्रेरित आणविक या उप-सेलुलर घटनाओं की एक श्रृंखला के जवाब में विकास दर बदल जाती है। इसके अलावा, अलग-अलग व्यक्तियों की तुलना होने पर व्यक्तिगत भिन्नता समस्याएं पैदा कर सकती है। वर्तमान दृष्टिकोण एकल जीवित व्यक्तियों में एक दिन से कम की अवधि में ऊतक वृद्धि के माप की अनुमति देता है। दृष्टिकोण के अनुप्रयोग की परिकल्पना मिनट टाइमस्केल पर की जा सकती है।

वर्णित विधियां उन विश्लेषणों की अनुमति देती हैं जो अब तक अव्यवहारिक थे। 4-स्लाइस विधि का उपयोग करके, मांसपेशियों की वृद्धि परख के इमेजिंग हिस्से को एक प्रशिक्षित ऑपरेटर द्वारा एक घंटे के भीतर लगभग 20 मछली के नमूना आकार पर पूरा किया जा सकता है। यह पारंपरिक फुल स्टैक विधि के विपरीत है, जिसमें समान संख्या में मछली (यानी, तीन गुना अधिक) के लिए कम से कम 3 घंटे लगते हैं। यदि बाद के उप-सेलुलर विश्लेषणों के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों की आवश्यकता होती है, तो फुल स्टैक विधि को आसानी से प्रति मछली 30 मिनट की आवश्यकता हो सकती है, जिससे समान विकास चरण में जानवरों के समूहों की वृद्धि असंभव हो जाती है। इसके विपरीत, 2- या 4-स्लाइस विधियां तेजी से उच्च गुणवत्ता वाली छवि कैप्चर की अनुमति देती हैं। छवि विश्लेषण पर विचार करने के लिए, फुल स्टैक विधि पर ऑपरेटर समय (स्वचालित छवि विभाजन की अनुपस्थिति में) की बचत में 2- या 4-स्लाइस विधि के फायदे बहुत बड़े हैं। प्रत्येक मछली को पूर्ण स्टैक विश्लेषण के लिए लगभग 20 मिनट की आवश्यकता होती है, लेकिन 4-स्लाइस विश्लेषण के लिए केवल 3-4 मिनट। ऑपरेटर समय को लगभग-सटीक 2-स्लाइस विधि का उपयोग करके आगे संरक्षित किया जा सकता है। इस प्रकार, वर्णित विधि कुशल है और इस प्रकार प्रयोगात्मक डिजाइन में लचीलापन बढ़ाती है।

4- या 2-स्लाइस विधियों की प्रमुख सीमा यह है कि दोनों विधियां अनुमान हैं, सोमाइट्स के अतिव्यापी शेवरॉन आकार के कारण (उदाहरण के लिए, दो पड़ोसी सोमाइट्स के क्षेत्रों की मात्रा (जैसे, मायोटोम 16 और 17)। यह दिखाया गया है कि यह वास्तविक मायोटोम 17 वॉल्यूम को लगभग 2% तक बढ़ा सकता है, जो ठीक इस बात पर निर्भर करता है कि वाईजेड स्लाइस का चयन कहां किया गया था। इसके अलावा, माप के दौरान सोमाइट सीमाओं का मैन्युअल अनुरेखण अनुमानों में भिन्नता में योगदान दे सकता है, हालांकि थोड़ा अंतर-प्रयोगकर्ता अंतर पाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया)। माप त्रुटियों को अधिक उद्देश्यपूर्ण और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सतह क्षेत्र प्राप्त करने के लिए थ्रेशोल्डिंग, फ़िल्टरिंग और विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है। हालांकि, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (जैसे एलएमए के एम्बेडिंग और / या मोटाई के कारण) और समय के साथ व्यक्तिगत लार्वा के प्रतिदीप्ति प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में भिन्नता के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। ध्यान दें कि इस तरह के स्वचालित माप और भी चुनौतीपूर्ण होंगे यदि एक गैर-मांसपेशी-विशिष्ट रिपोर्टर का उपयोग किया जाता है, जैसे कि β-एक्टिन: एचआरएएस-ईजीएफपी लाइन। बहरहाल, कई परिस्थितियों में, उदाहरण के लिए, जब विभिन्न उपचारों के अधीन मछली के बीच जोड़तोड़ के प्रभावों की तुलना की जाती है जो सभी मांसपेशियों के ऊतकों को प्रभावित करने की उम्मीद करते हैं, तो अशुद्धि अभौतिक हो सकती है। हालांकि, यदि केवल मायोटोम 17 से गिने गए फाइबर या परमाणु संख्याओं की तुलना के लिए अधिकतम सटीकता की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, 'स्लाइस' विधियों में सुधार किया जा सकता है। यह या तो कठिन पूर्ण स्टैक विधि का उपयोग करके, मापा 4-स्लाइस वॉल्यूम को 0.98 से गुणा करके गणितीय सुधार द्वारा, या वाईजेड सीएसए स्कैन के स्थान को पीछे की ओर ले जाकर प्राप्त किया जा सकता है ताकि मायोटोम 17 के सही सीएसए को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित किया जा सके।

विधि की एक दूसरी सीमा मछली के बढ़ते अभिविन्यास के प्रति इसकी संवेदनशीलता है। व्यवहार में, कुशल ऑपरेटर अधिकांश समय मछली को उचित सीमा के भीतर उन्मुख कर सकते हैं, भले ही कई नमूनों को एम्बेड करने के लिए जल्दी से काम करते समय। माइक्रोस्कोप चरण पर उपकरणों में संशोधन की परिकल्पना की जा सकती है जो स्कैनिंग से पहले याव और रोल के सुधार की अनुमति देगा। इस तरह के उपकरण के बिना, गलत अभिविन्यास को मापने की एक विधि का वर्णन किया गया है जिसका उपयोग तब मापा वॉल्यूम को सही करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, भले ही गलत अभिविन्यास मापा मात्रा में परिवर्तनशीलता को बढ़ाता है, और इस प्रकार छोटे प्रभाव आकारों को देखने की संभावना को कम करता है, कई स्थितियों में ऐसी भिन्नता नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों को समान रूप से प्रभावित करेगी। इसलिए झूठे सकारात्मक परिणामों की संभावना नहीं है, अगर ऑपरेटरों को इस मुद्दे के बारे में पता है।

वर्णित विधियों को शुरू में मांसपेशियों की वृद्धि में विद्युत गतिविधि की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है, प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में विश्लेषण के लंबे इतिहास वाला एक विषय (18 में समीक्षा की गई)। इस अंत तक, अंतर्जात ट्रिगर गतिविधि को अवरुद्ध करने के सरल तरीकों को विस्तार से वर्णित किया गया है और ज़ेब्राफिश लार्वा में नियंत्रित पैटर्न वाली विद्युत उत्तेजना के साथ प्रतिस्थापित किया गया है। इस दृष्टिकोण के फायदे तंत्रिका प्रतिक्रिया नियंत्रण40 को हटाना, परिवर्तित पोषण के प्रभावों का उन्मूलन और विकास प्रॉक्सी के बजाय विकास पर सर्कैडियन प्रभावों का विश्लेषण करने की क्षमता है, जैसे कि प्रोटीन टर्नओवर26। चूंकि विद्युत गतिविधि के विभिन्न पैटर्न अलग-अलग मांसपेशियों की प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं, फाइबर प्रकार, आकार और चयापचय को विनियमित करते हैं 41,42,43,44,45,46,47,48, वर्तमान विधियां जेब्राफिश को ऐसे विश्लेषणों के लिए खोलती हैं।

वर्णित विधियां तकनीकों का एक सूट प्रदान करती हैं जिसके साथ मांसपेशियों के शरीर विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान और विकृति विज्ञान के कई पहलुओं का विश्लेषण अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत ज़ेब्राफिश का लाभ उठाकर अभूतपूर्व अस्थायी और स्थानिक संकल्प में किया जा सकता है। वर्तमान दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से अन्य प्रजातियों, शरीर के क्षेत्रों और विकास के चरणों पर लागू किया जा सकता है। ज़ेब्राफिश लार्वा की तेजी से प्रारंभिक वृद्धि ऊतक विकास और मॉर्फोजेनेसिस पर जोड़तोड़ के तीव्र प्रभावों का पता लगाती है, विशेष रूप से अध्ययन के आकर्षक क्षेत्रों। इसके अलावा, ज़ेबराफिश की मांसपेशी को स्तनधारियों के साथ विभिन्न विकास तंत्र और नियंत्रण साझा करने के लिए दिखाया गया है। जबकि ज़ेबराफिश कशेरुक हैं जो मनुष्यों के साथ मांसपेशियों के आणविक आनुवंशिकी, कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान के कई पहलुओं का संरक्षण करते हैं, मांसपेशियों की वृद्धि के नियंत्रण में भी महत्वपूर्ण अंतर हैं। उदाहरण के लिए, धीमी और तेज फाइबर प्रकार मछली में अधिक स्पष्ट रूप से अलग होते हैं और मांसपेशियों का संक्रमण अंतर दिखाता है। इसके अलावा, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि, अब तक, हम केवल विकास के शुरुआती चरणों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं। बाद के चरणों में इसी तरह के विश्लेषण की परिकल्पना की गई है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

लेखक वर्णित प्रोटोकॉल के विकास के लिए ह्यूजेस प्रयोगशाला के सदस्यों डॉ सीतारमैया अटिली, जाना कोथ, फर्नांडा बाजांका, विक्टोरिया सी विलियम्स, यानिव हिनिट्स, जॉर्जिया बर्गामिन और व्लादिमीर स्नेतकोव के प्रयासों के लिए गहराई से ऋणी हैं, और प्लास्मिड या जेब्राफिश लाइनों को साझा करने के लिए हेनरी रोहल, क्रिस्टीना हैमंड, डेविड लैंगेनौ और पीटर करी के लिए। एसएमएच एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) वैज्ञानिक है जिसमें कार्यक्रम अनुदान जी 1001029, एमआर / एन021231/1, और एमआर / डब्ल्यू 001381/1 समर्थन है। एमए ने किंग्स कॉलेज लंदन से एमआरसी डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम पीएचडी छात्र का आयोजन किया। इस काम को डेविड एम रॉबिन्सन, विद्वान, संरक्षक और दोस्त के त्रिकोणमितीय इनपुट से लाभ हुआ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive, Blu Tack Bostik - -
Aerosol vacuum  - - -
Agarose Sigma-Aldrich A9539 -
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414 Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater Cole-Parmer SBH130 -
BODIPY FL C5-ceramide Thermo Scientific D3521 To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires - - -
Fiji/imageJ National Institutes of Health, NIH - -
Fish medium, Fish water - - Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium - - E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope Leica Leica MZ16F Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle World Precision Instruments, Inc. 1B100-6 To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator Grass Instruments S88 Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 13258179 -
Laser scanning microscope (LSM)  Zeiss Zeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		 LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate Thermo Scientific 140675 -
Objective, 20×/1.0W water immersion Zeiss - -
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL Starlab Group E1414-0100 -
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL Starlab Group E1414-1100 -
Petri dish, 60 mm Sigma-Aldrich P5481 -
Plasmid, CMV-Cerulean Christina L. Hammond (University of Bristol) pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX Henry Roehl (University of Sheffield) - For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller  Hoefer Scientific Instruments PC750 -
Soldering iron - - -
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc - -
Watchmaker forceps, No. 5 - - -
Wire, Platinum Goodfellow PT005142/12 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver Acros Organics 317730010 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) - ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) - ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP - - ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software Zeiss - -

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184
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Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, … More

Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity. J. Vis. Exp. (184), e64063, doi:10.3791/64063 (2022).

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