Summary
광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.
Abstract
살아있는 배아, 애벌레 또는 어린 제브라 피쉬의 몸 전체에 걸쳐 개별 세포를 시각화하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 형광으로 표시된 원형질막이 있는 활어를 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 스캔하여 근육 조직의 부피와 존재하는 근육 섬유의 수를 결정할 수 있음을 보여줍니다. 시간 경과에 따른 살아있는 동물의 세포 수와 크기를 측정하기 위한 효율적인 접근 방식이 설명되고 보다 힘든 분할 방법에 대해 검증됩니다. 근육의 전기 및 수축 활동을 제어 할 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 골격근 수축 활동의 손실은 근육 성장을 크게 감소시켰다. 유충에서는 패턴화 된 전기 유발 수축 활동의 재 도입을 허용하는 프로토콜이 설명됩니다. 설명 된 방법은 개인 간 변동성의 영향을 최소화하고 살아있는 유기체의 맥락에서 다양한 세포 및 생리적 성장 매개 변수에 대한 전기적, 유전 적, 약물 적 또는 환경 적 자극의 효과를 분석 할 수 있습니다. 개인에 대한 정의된 조기 개입의 측정된 효과에 대한 장기 추적 관찰을 이후에 수행할 수 있습니다.
Introduction
세포 수 (증식) 및 / 또는 세포 크기 (비대)의 증가를 포함하는 조절 된 조직 성장은 발달, 재생, 생태 학적 및 진화 적 적응에 중요한 요소입니다. 최근 수십 년 동안 세포 및 발달 생물학에 대한 분자 유전 학적 이해가 크게 발전했음에도 불구하고 조직 및 장기 크기 조절에 대한 기계 론적 이해는 아직 초기 단계에 있습니다. 이러한 지식의 부족에 대한 한 가지 이유는 필요한 공간적, 시간적 정확성으로 살아있는 유기체의 조직 성장을 정량화하기가 어렵 기 때문입니다.
전체 유기체의 성장의 다양한 측면을 시간이 지남에 따라 반복적으로 측정하여 각 개별 1,2,3,4,5에 대한 성장 곡선을 나타낼 수 있습니다. 이중 X선 흡수측정법(DXA), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 자기공명영상(MRI)과 같이 점점 더 정교해지는 스캐닝 방법을 통해 인간 및 모델 유기체 모두에서 단일 개체에서 전체 장기 및 기타 신체 영역(예: 개별적으로 식별된 골격근)의 성장을 추적할 수 있습니다.6,7,8,9,10 . 그러나 이러한 방법은 아직 개별 세포를 밝힐 수 있는 해상도가 없으므로 세포 행동과 조직 수준 성장 사이의 연관성을 식별하기 어려웠습니다. 이러한 연관성을 만들기 위해 전통적인 연구는 종종 유사한 개별 동물의 코호트에 의존했으며, 그 중 일부는 연속적인 시점에서 희생 된 다음 세포 학적 세부 사항으로 분석됩니다. 이러한 접근법은 (바람직하게는 유사하지만 그럼에도 불구하고 가변적 인) 개인의 그룹에 걸쳐 관찰 된 변화를 평균화해야하므로 시간적 및 공간적 해상도가 부족하여 원인과 결과를 암시하는 세포 수준에서 상관 된 사건을 찾기가 어렵습니다.
무척추 동물 모델 유기체에 대한 연구는 처음에 C. elegans와 D. melanogaster에서 세포 분해능을 달성하고 단일 개체의 시간 경과에 따른 성장을 정확하게 측정하기 위해 광학 현미경을 개발하여 이러한 문제를 우회했습니다. 이러한 연구는 이러한 작은 모델 유기체 11,12,13,14,15,16,17의 성장에서 현저하게 불변하는 세포 계통 행동을 밝혀 냈습니다. 그러나 모든 척추 동물을 포함한 많은 동물은 불확실한 세포 계통을 가지고 있으며 유 전적으로 암호화 된 성장 프로그램을 모든 구성 조직과 기관의 크기가 적절하게 일치하는 기능적 3 차원 유기체로 바꾸는 신비한 피드백 과정에 의해 조직 성장을 제어합니다. 이러한 복잡한 성장 과정을 이해하려면 선택한 시간에 유전적, 약리학적 또는 기타 개입에 의해 실험적으로 조작할 수 있고 이후에 효과를 분석할 수 있는 단일 개체에서 시간이 지남에 따라 전체 조직 또는 기관을 이미지화하는 것이 바람직합니다.
각 척추 동물 골격근은 정의 된 크기, 모양 및 기능을 가지고 있으며 뼈, 힘줄 및 신경과 같은 인접한 조직과의 잘 특성화 된 상호 작용을 가지고 있습니다. 일부 근육은 작고 피부 바로 아래에 있으므로 고해상도 이미징 연구에 적합합니다. 대부분의 장기와 마찬가지로 각 근육은 안정적인 성인 크기에 도달하기 전에 배아, 출생 후 및 청소년 생활 전반에 걸쳐 성장합니다. 그러나 근육은 또한 사용과 영양에 따라 성인 생활 동안 크기를 변화시키는 독특한 능력을 가지고 있습니다.18, 이 특성은 유기체 건강, 스포츠 성능 및 독립 생활에 큰 영향을 미칩니다. 노년기의 근육량과 기능 상실, 근육 감소증은 고령화 인구 19,20,21에 직면 한 사회에 대한 관심이 증가하는 문제입니다.
우리와 다른 사람들은 조직 성장, 유지 및 복구를 관찰하고 조작 할 수있는 수백 개의 세포를 포함하는 분명히 닫힌 시스템으로서 제브라 피쉬 유충의 분절 반복 몸체에서 골격근 조직의 정의 된 블록의 성장에 초점을 맞추 었습니다 22,23,24,25,26. 일부 정량적 작업은 이전에 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35로보고되었지만 시간이 지남에 따라 개별 척추 동물의 세포 세부 사항에서 근육 성장을 측정하는 상세하고 검증 된 방법은 없습니다. 여기에는 검증과 함께 이러한 반복 측정을 수행하는 방법에 대한 효율적인 프로토콜이 설명되며, 변경된 전기 활동에 대한 반응으로 비대 및 과형성 성장의 변화를 분석하는 데 사용되는 예가 제공됩니다.
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Protocol
설명 된 모든 연구는 1986 년 동물 (과학적 절차) 법 및 후속 수정에 따라 영국 내무부의 적절한 라이센스에 따라 기관 지침 및 적절한 라이센스에 따라 수행되었습니다. 배아/유충은 위장이 완료될 때까지 28.5°C에서 사육해야 하지만 발달 속도를 조절하기 위해 22-31°C에서 보관할 수 있습니다. 물고기는 실온에서 스캔하거나 자극할 수 있습니다.
1. 제브라 피쉬 유충 마취
- 적합한 형광 리포터 성인 어류, 예컨대 Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg 참조36 또는 Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg 참조 37을 교차하고,38에 기재된 바와 같이 배아를 수집하였다.
- 수정 후 2일(dpf)과 같은 선택 시 트리카인 함유 어류 배지(어류 물 또는 E3 배지)를 사용하여 배아를 간단히 마취하고 Leica MZ16F와 같은 형광 현미경으로 EGFP 또는 mCherry를 선별합니다. 배아가 많으면 신호가 가장 밝은 배아를 선택하십시오. 스크리닝 직후 배아를 정상 어류 배지로 되돌립니다.
2. 컨포칼 스캐닝을 위한 장착 물고기
- 컨포칼 레이저 스캐닝 시스템과 레이저를 켜서 시스템이 30-60분 동안 안정화되도록 합니다.
참고: 여기서는 20x/1.0W 수침 대물렌즈가 장착된 직립 재료 스탠드(작동 거리 향상)가 있는 Zeiss LSM 5 여자기 현미경을 사용했습니다. - 1% 저융점 아가로오스(LMA)를 준비하고 1.5mL 튜브에서 반복 사용을 위해 37°C 열 블록에 보관합니다. 열 충격을 방지하려면 열 블록에서 LMA 분취량을 제거하고 유충에 바르기 전에 설정 바로 위까지 식히고 분유의 온도를 평가할 때와 같이 피부에 대해 테스트하여 적절한 온도를 판단하십시오.
- 장착 할 물고기를 선택하고 Tricaine (물고기 배지에서 0.6mM)으로 각 물고기를 일시적으로 마취하십시오.
- 1% 아가로오스 층으로 코팅된 직경 60mm의 페트리 접시를 가져다가 해부 현미경 무대에 놓습니다.
- 1mL 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 유충을 60mm 코팅 페트리 접시에 옮기고 가능한 한 많은 전사 배지를 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 LMA를 물고기에 5-10방울 떨어뜨리고 LMA가 굳기 전에 집게(또는 불에 광택이 나는 미세 유리 바늘)로 측면 보기에서 수평으로 빠르게 배치합니다. 최적의 이미징을 위해서는 유충을 LMA의 상부 표면에 가깝게 배치하는 것이 바람직합니다.
- 또는 1mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 물고기 배지로 유충을 수집하고 유충을 냉각 된 LMA의 부분 표본으로 옮깁니다. 유충이 LMA로 완전히 둘러싸일 수 있도록 5초 동안 가라앉히십시오. 그런 다음 유충을 회수하여 LMA 한 방울에 담아 아가로스 코팅 페트리 접시에 옮깁니다. 위에서 설명한대로 유충의 방향을 빠르게 잡고 배치하십시오.
- 유충의 전후 축과 배복부 축을 수평의 10° 이내로 향하게 합니다(아래 포인트 4.6의 '오류 및 수정' 참고 참조).
- 유충이 아가 로스 방울의 표면 근처에 수평으로 올바르게 장착되지 않은 경우 제거하고 다시 삽입하십시오. 유충은 초미세 1mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 흡입하여 쉽게 회수할 수 있으며 LMA는 Kimwipes를 사용하여 부드럽게 제거할 수 있습니다. 연습은 장착 절차에서 정말 완벽합니다. 실제 실험에서 이것을 시도하기 전에 중요하지 않은 유충을 삽입하는 오후를 보내십시오.
참고: 현미경 설계: 많은 실험실에서 커버슬립을 통한 이미징을 위해 도립 컨포칼 현미경을 사용합니다. 우리는 도립 현미경에서 관찰하기 위해 커버 슬립 아래 아가 로스에 보관 된 물고기를 반복적으로 매립하고 제거하면 직립 현미경으로 설명 된 절차보다 반복 스캐닝 중에 샘플이 더 많이 손실된다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 가능한 경우 직립 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 고품질 데이터의 핵심은 대물렌즈 및 스캔 매개변수의 적절한 선택과 사용이며, 여기서 논의하기에는 너무 큰 주제입니다.
- 유충이 아가 로스 방울의 표면 근처에 수평으로 올바르게 장착되지 않은 경우 제거하고 다시 삽입하십시오. 유충은 초미세 1mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 흡입하여 쉽게 회수할 수 있으며 LMA는 Kimwipes를 사용하여 부드럽게 제거할 수 있습니다. 연습은 장착 절차에서 정말 완벽합니다. 실제 실험에서 이것을 시도하기 전에 중요하지 않은 유충을 삽입하는 오후를 보내십시오.
3. 컨포칼 스캐닝
- LMA가 설정되면 접시에 약 10mL의 트리카인 함유 생선 배지를 가득 채웁니다. 공초점 스택을 캡처하려는 경우 일부 아가로스 팽창이 발생하므로 스캔을 진행하기 전에 장착된 물고기를 최소 10분 동안 그대로 두십시오.
- 샘플 접시를 공초점 시스템의 단계에로드하고 유충을 찾고 원하는 소마이트에 초점을 맞 춥니 다. Somite 17은 항문 통풍구 근처의 국소화가 용이하고 이미징이 쉽기 때문에 선택 될 수 있습니다. 앞쪽에서 체세포를 세어 확인하십시오.
알림: 첫 번째 체절은 귀 뒤에 융합되어 있으며 앞쪽 경계가 없지만 줄무늬 근육 섬유가 있는 것을 쉽게 관찰할 수 있습니다. - 상단(즉, 피부 바로 위)과 하단(즉, 노토코드 바로 아래, 물고기가 약간 비뚤어진 상태로 장착되더라도 전체 소마이트를 포함하도록)을 정의하여 Z 스택을 캡처하는 것처럼 설정합니다. 왼쪽과 오른쪽 모두 원하는대로 캡처 할 수 있습니다. 이렇게 하면 모든 빠른 YZ 스캔이 원하는 영역을 캡처할 수 있습니다.
- 다음과 같이 XY 이미지를 캡처합니다. 컨포칼 소프트웨어가 허용하는 대로 물고기에 대한 스캔 영역의 방향을 지정합니다. 보충 파일 1에 표시된 대로 필드 중앙에 체석이 있는 전후축이 이미지화된 X축과 평행하고 등쪽 축이 Y축에 평행하도록 물고기를 배치합니다. 수직 및 수평 근격과 함께 전체 에축 및 최면 소마이트 반쪽이 보이는 최상단 근종의 중간 레벨 평면에 초점을 맞추고 고해상도 XY 이미지를 캡처합니다. 이미지의 이름을 지정하고 저장하는 것을 잊지 마십시오.
- 다음과 같이 하나 이상의 YZ 이미지를 캡처합니다. 대표 결과(아래)에서는 2슬라이스 방법과 4슬라이스 방법의 정확도를 비교합니다. 2슬라이스 접근 방식에서는 단일 XY 및 YZ 스캔이 사용됩니다. 4슬라이스 접근법에서는 3개의 YZ 스캔을 평균화하여 근종 부피를 보다 정확하게 추정합니다. 공초점 소프트웨어에서 필요한 경우 스캔 필드의 방향을 다시 지정합니다.
- 선택한 전후 위치에서 물고기의 전후 축에 수직 인 선택한 체절을 가로 질러 정확하게 등쪽에서 복부 선을 그립니다. Z 스택 라인 스캔을 수행합니다.
- YZa, YZm 및 YZp를 캡처하기 위해 선택한 근종을 따라 정의된 전후 위치에서 YZ 라인 스캔을 세 번 반복합니다. 대표적인 결과를 도 2A에 나타내었다. 이러한 이미지의 이름을 지정하고 관련 XY 이미지와 함께 저장합니다.
참고 : YZ 평면 선택시 : 근종은 V 자형이며 성장 중에 형태가 바뀝니다. 4 슬라이스 방법으로 근종 17 부피의 가장 정확한 평가를 얻으려면 YZa를 근종의 앞쪽 끝에, YZp를 등쪽 및 복부 극단의 근종 뒤쪽 끝에, YZm을 YZa와 YZp 사이의 중간에 위치시킵니다. 체절이 균일하게 테이퍼된다고 가정하면 각 YZ 섹션의 측정 평균은 근종 전체를 나타냅니다. 2 슬라이스 방법의 경우, 단일 YZ 스캔은 관심 근종 (예 : YZm)의 전후 중심에 대략 해당하는 수평 근중격의 후단에 위치해야합니다. 또는 수평 근중격의 전방, 중간 및 후방에서 3개의 YZ 섹션 세트를 취할 수 있지만 아래 그림과 같이 이러한 측정은 근종 부피를 약간 과대 또는 과소 평가합니다(근종 테이퍼링으로 인해 각각 및 꼬리 체세포의 경우). 기본적으로 물고기와 실험 사이의 YZ 슬라이스 평면 위치의 일관성은 재현성의 핵심입니다.
4. 분석
- myotome이 단계적으로 물고기를 따라 크기가 변하기 때문에 비교 연구에서 항상 동일한 somite로 작업하십시오.
- 근원체 부피를 측정하고 계산하려면 컨포칼 소프트웨어(예: Zeiss ZEN 현미경 소프트웨어를 사용하여 만든 .lsm 파일) 또는 피지/ImageJ와 같은 오픈 소스 범용 이미지 분석 소프트웨어를 사용하십시오.
참고: 파일 형식을 변경하는 경우 모든 소프트웨어가 독점 공초점 파일 형식을 올바르게 읽을 수 있는 것은 아니므로 Z-step 크기가 올바르게 전송되었는지 확인하십시오. 예를 들어 ZEN 라인 스캔 이미지를 피지로 가져오려면 먼저 파일/내보내기 명령을 사용하여 전체 해상도 이미지 창 - 단일 평면 형식에서 .tif로 내보낸 다음 피지로 가져옵니다. YZ scan.lsm은 피지에서 직접 열 수 있지만 Z 단계 크기의 잘못된 평가로 인해 결과 YZ 이미지는 일반적으로 Z 차원으로 압축됩니다. - 젠을 이용한 분석
- 먼저 ZEN에서 XY scan.lsm 파일을 엽니다. 그래픽 탭으로 이동하여 선 도구를 선택합니다. 근종 길이 전체에 걸쳐 있는 somite 17의 두 수직 근중격 사이에 선을 그립니다(물고기의 전후 축과 평행). M 상자를 선택하여 측정 값을 표시합니다(길이 = 89.71μm, 보충 파일 2 참조).
- YZ scan.lsm 파일을 엽니다. 그래픽 탭에서 닫힌 베지어 도구를 선택합니다. 근종의 둘레를 그립니다. 완료되면 M 상자를 선택하면 측정 값이 표시됩니다(면적 = 11980.01μm2, 보충 파일 3 참조).
- 각 측정값의 값을 스프레드시트에 수동으로 기록합니다. 필요에 따라 CSA 측정값의 평균을 구합니다. 미오토메의 부피는 부피 = 근종 길이 x CSA, 즉 89.71 μm x 11980.01μm2 = 1.075 x 106 μm3로서 계산될 수 있다.
- 피지/이미지J를 사용한 분석
- 피지/이미지J에서 XY scan.lsm 파일을 엽니다. 피지에서 직접 열린 XY 이미지가 제대로 보정되었는지 확인하십시오.
- 아이콘에서 직선 도구를 선택합니다. 4.3.1단계에서 설명한 대로 소마이트(17)의 길이를 따라 선을 그립니다. 분석으로 이동하여 측정 파라미터를 설정한 다음 측정 설정...을 선택하고 영역 및 레이블 표시 상자를 선택합니다. 측정하려면 바로 가기 키 M을 누르거나 분석 메뉴로 이동하여 측정을 선택하기만 하면 됩니다. 결과 팝업 창에 모든 측정값이 나열됩니다(즉, 길이 = 90.023 μm, 보충 파일 4 참조). 결과는 .csv 형태로 저장하고 후속 분석을 위해 Microsoft Excel 또는 이와 유사한 형식으로 열 수 있습니다.
- YZ 영상에서 CSA를 측정하려면 4.2단계에 설명된 대로 .tif 형식으로 YZ 영상을 엽니다.
- YZ .tif 이미지는 내보낼 때 보정되지 않으므로 보정합니다. 보정을 위한 매개변수는 선택한 이미지의 정보로 이동하여 ZEN에서 얻을 수 있습니다: 스케일링 X(0.489μm) 및 스케일링 Z 값(0.890μm, 보충 파일 5 참조)을 기록합니다. 그런 다음 이미지가 피지에서 열려 있는 동안 이미지로 이동하여 속성...을 선택합니다. 픽셀 너비 및 픽셀 높이에 0.489μm, 복셀 깊이에 0.890μm를 입력합니다. YZ 이미지의 반복 측정이 예상되는 경우 보정을 보편적으로 적용하려면 Global 상자를 선택합니다(보충 파일 6 참조).
알림: 모든 YZ 이미지가 동일한 스캔 매개 변수를 사용하여 캡처되었는지 확인하십시오. Fiji/ImageJ를 다시 시작하거나 새 보정 세트가 필요한 경우 보정 값을 수정합니다. - 보정된 YZ 이미지의 CSA를 측정하려면 아이콘에서 폴리곤 선택 도구를 선택합니다. 소마이트의 둘레를 그리고 M 을 눌러 측정값을 표시합니다(면적 = 11980.395μm2, 보충 파일 7 참조). 근종의 부피는 부피 = 근종 길이 x CSA, 즉 90.023 μm x 11980.395μm2 = 1.079 x 106 μm3로서 계산될 수 있다.
- 다른 XY 및 YZ 영상에 대해서도 측정을 반복합니다. 일관성을 위해 실험 시리즈 내의 모든 측정에 동일한 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다. 각 소프트웨어의 부피 추정치는 ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 및 Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3과 같은 별개의 그리기 도구로 인해 유사하지만 동일하지는 않습니다. 두 시점 (즉, 3 내지 4 dpf) 사이의 근종의 성장은 다음과 같이 계산할 수 있다: (볼륨 4 dpf - 볼륨 3 dpf)/ 볼륨 3 dpf × 100%.
참고: 오류 및 수정 시. 장착하는 동안, 물고기는 요와 롤을 피하기 위해 가능한 한 수평에 가깝게 시상면 (즉, 전후 및 배복부 축)으로 향해야합니다. 이는 XY 스캔에서 측정된 근종 길이 L과 YZ 스캔에서 측정된 CSA 모두 비스듬한 전후방 장착으로 인해 물고기가 요(배복부 축을 중심으로 회전)를 보이는 경우 과대평가되기 때문입니다. 장착 중 피치나 롤은 섹션 3에 설명된 대로 스캔 후 측정에 영향을 미치지 않습니다. 그럼에도 불구하고 배측 회전 (롤)은 이미지 품질을 저하시킵니다. 간단한 삼각법은 최대 10°의 요가 부피 측정에서 3% 오차를 발생시킨다는 것을 보여주며, 측정된 L과 CSA는 각각 (cosq)-1에 비례하여 증가하며, 여기서 q는 전후방 수평(요)에서 멀어지는 각도입니다. 15° 및 20° 끄면 각각 볼륨이 7% 및 13% 과대 평가됩니다.
노토코드가 원통형이므로 YZ 스캔에 전체 노토코드를 포함하면 주 축과 보조 축의 방향과 크기에서 경사 각도와 정도를 계산하여 측정된 L 및 CSA를 수정하여 정확도를 최대화할 수 있습니다. 수정된 CSA = 측정된 CSA x 노토코드 단조축/노토코드 장축. 보정된 L = 현미경 Z 방향으로 측정된 L x 노토코드 단조축/노토코드 축.
추가 고려 사항은 L의 추가 수정을 허용합니다. 근종이 자라면서 관상 동맥 평면 (배복부 축에 수직)에서 기울어 져 내측 근종이 외측 근종의 약간 앞쪽에 있습니다. 등쪽에서 볼 때, 왼쪽과 오른쪽의 수직 myosepta는 앞쪽을 가리키는 넓은 갈매기 모양입니다. 요가 낮으면 이 형태는 L의 측정에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 요가 중요한 경우 삼각 보정이 어려워지고 더 나은 접근 방식은 전방 및 후방 수직 근중격이 수평 근중격에서 노토코드와 만나는 두 지점의 XYZ 좌표를 추정하여 True L을 직접 측정하는 것입니다. 간단한 삼각법을 사용하면 이러한 좌표에서 L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z1)2]로 True L을 계산할 수 있습니다. 이 마지막 접근 방식의 약점은 a) 포인트 선택이 운영자에 따라 다를 수 있고 b) 선택한 포인트에 대한 시각적 기록이 유지되지 않는다는 것입니다. 이 고려 사항은 CSA 수정에 영향을 주지 않습니다.
5. 선택적인 방법: 근육 전기 활동을 제거하고 다시 소개하십시오
- 자극 챔버를 만듭니다.
- 6 x 35mm 웰 플레이트를 가져 와서 좁은 납땜 인두를 사용하여 각 웰의 양쪽에 두 개의 작은 구멍 <(직경 5mm, 간격 1cm)을 만듭니다 (그림 1 참조).
알림: 뜨거운 납땜 인두를 조심스럽게 다루고 증기 흡입을 피하기 위해 원하는 경우 흄 후드에서 작업하십시오. - 각 우물의 구멍을 통해 한 쌍의 은색 또는 백금 와이어(~20cm 길이)를 끼웁니다(그림 1 참조). 재사용 가능한 접착 재료(예: BluTack)를 개구부 근처에 적용하여 와이어를 제자리에 유지하고 와이어 사이에 1cm 간격을 둘 수 있습니다(그림 1 참조).
- 6 x 35mm 웰 플레이트를 가져 와서 좁은 납땜 인두를 사용하여 각 웰의 양쪽에 두 개의 작은 구멍 <(직경 5mm, 간격 1cm)을 만듭니다 (그림 1 참조).
- 3dpf에서 물고기를 물고기 매체 제어, 비활성 및 비활성 + Stim의 세 가지 조건으로 나눕니다.
- 비활성 및 비활성 + Stim 그룹의 경우 수정 후 72 시간 (hpf)에 유충을 트리 카인 (0.6mM)으로 마취합니다.
참고: 참고자료38에 따라 트리카인 스톡의 냉동 분취량을 해동하고 희석합니다(40μL/mL 어류 배지, 최종 농도 0.6mM까지). 일부 물고기는 고용량을 섭취할 수 있으므로 물고기가 들어 있는 물에 트리카인을 직접 첨가하지 마십시오. 트리카인 스톡은 한 달 이내에 사용해야 하며 절대 다시 냉동해서는 안 됩니다. - 물고기 매체 제어 물고기의 경우 마취되지 않은 상태로 두십시오.
- 비활성 및 비활성 + Stim 그룹의 경우 수정 후 72 시간 (hpf)에 유충을 트리 카인 (0.6mM)으로 마취합니다.
- 트리카인 노출 후 선택한 시간(즉, 80hpf에서)에 자극을 위해 비활성+자극 그룹을 준비합니다.
- 2% 아가로오스 60mL(어류 배지 60mL에 아가로스 분말 1.2g)를 준비하고 전자레인지를 사용하여 완전히 녹이고 식힌 다음 트리카인을 넣고 자극 챔버의 각 웰에 4mL를 붓습니다(그림 1).
- 즉시 전극 사이에 맞춤형 4웰 빗을 추가합니다(원하는 치수의 플라스틱(예: 폴리프로필렌)을 잘라내고 Superglue를 사용하여 서로 접착하여 생성됨, 그림 1 참조). 젤이 굳을 때까지 10분 동안 기다립니다. 빗을 조심스럽게 제거하여 4 개의 직사각형 우물을 만듭니다.
- 각 웰을 트리카인 물로 채우고 전후 축이 전극에 수직이되도록 마이크로 피펫을 사용하여 각 웰에 마취 된 단일 Inactive + Stim 유충을 배치합니다 ( 그림 1 참조).
- 해부 형광 현미경으로 각 물고기가 챔버의 각 웰 내에서 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
- 챔버의 한쪽에 있는 각 전극에 연결된 악어 클립을 사용하여 극성 컨트롤러를 통해 조정 가능한 전기생리학적 패턴 생성 자극기를 챔버에 연결합니다( 그림 1 참조).
알림: 극성 컨트롤러는 전극의 전기 분해 및 부식을 방지하기 위해 5초마다 극성을 반전시키는 데 사용됩니다. - 물고기를 자극하십시오. 예를 들어, 200, 20V 펄스, 0.5ms 펄스 지속 시간 및 4.5ms 펄스 분리가있는 1s는 5 초마다 한 번씩 효과적인 반복 파상풍 수축 저항 영역을 제공합니다.
- 현미경으로 정기적으로 확인하여 물고기가 자극되고 있는지 확인하십시오. 전기 자극의 예는 5초마다 한 번씩 가시적인 양측 수축과 약간의 움직임을 유도해야 합니다.
- 저항/높은 힘 정권의 경우, 물고기를 5분 동안 고주파로 자극하여 3회 시합하고 각 시합은 5분의 휴식으로 분리합니다.
알림: 챔버의 한쪽에 있는 물고기가 쉬고 있는 동안 악어 클립을 챔버의 다른 쪽에 있는 전극 쌍에 연결하고 추가 물고기를 자극할 수 있습니다. - 자극 후 플라스틱 피펫으로 부드럽게 씻어내어 각 우물에서 물고기를 조심스럽게 제거하고 신선한 트리카인이 함유 된 생선 배지에서 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 챔버 내에서 트리카인 물을 붓고 집게를 사용하여 각 우물에서 아가 로스를 자르고 제거합니다. 우물을 수돗물로 헹구고 말리십시오.
알림: 은선 전극을 사용하는 경우 자극 실험 후 때때로 산화은이 와이어 표면에 축적될 수 있습니다. 산화은은 은보다 전도성이 낮기 때문에 재현성을 유지하려면 설정을 다시 사용하기 전에 Kimwipes를 사용하여 와이어에서 산화은을 조심스럽게 문지릅니다.
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Representative Results
빠르고 정확한 소마이트 부피 측정
제브라 피쉬 유충의 근육 성장을 신속하게 측정 할 수있는 샘플 준비, 데이터 수집 및 체적 분석 방법이 설명됩니다. 근육 크기는 세포막 표적 GFP(β-액틴:HRAS-EGFP ) 또는 엠체리(α-액틴:mCherry-CAAX )가 있는 원형질막에 라벨이 부착된 물고기를 사용하여 살아있는 동물에서 측정할 수 있습니다. 유충은 트리카인을 사용하여 일시적으로 마취되고, 저융점 아가로스에 장착되고, 공초점 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. Somite(17)는 몸통-꼬리 계면(31)에서의 그의 접근성을 고려하여 근육 크기의 분석을 위해 선택되었다. 실제로 이론적으로 근종 부피는 근종 길이 (L)와 3 개의 단면적 측정 (CSA)의 평균의 곱으로 계산할 수 있습니다 (그림 2A, 4 슬라이스 방법이라고 함).
이 방법을 검증하기 위해 살아있는 제브라피쉬 유충의 전체 근종 공초점 Z-스택(그림 2B)을 얻고 각 슬라이스(80-100 슬라이스)의 소마이트 17개 프로파일 영역의 합에 슬라이스 간 거리(1-1.2μm)를 곱하여 소마이트 부피를 계산했습니다. 4슬라이스와 풀 스택 계산 방법 간에 강한 상관관계가 관찰되었습니다(그림 2C). 그러나 4슬라이스 방법은 일반적으로 약간 더 큰 부피 추정치(평균 ~2% 더 큼)를 제공했습니다(그림 2D). 이 차이는 a) 잘못 큰 부피 측정을 제공하는 샘플의 경사 또는 b) 제브라 피쉬 근종이 전후 축을 따라 가늘어져 동물의 꼬리쪽으로 더 작아지는 관찰 때문일 수 있습니다. YZa, YZm 및 YZp CSA 측정이 체석 17 근종 갈매기 모양 (그림 2A)의 앞쪽 부분을 향하고 있기 때문에 후자의 해석은 체세포 16 및 18의 근체의 체적 분석에 의해 테스트되었습니다. 각 체석은 뒤에 있는 것보다 약 7% 더 컸습니다(그림 2E). 추가 분석에 따르면 에축 및 최면 반쪽이 수평 근중격(YZm)에서 만나는 체석의 중간에 위치한 단일 YZ 측정만 필요한 2슬라이스 방법과 XY 슬라이스가 근종 부피를 합리적으로 정확하게 추정하는 것으로 나타났습니다(그림 2F,G). 2슬라이스 접근 방식을 사용하면 시간 제약으로 인해 스캔할 수 있는 물고기 수가 제한될 때 보다 빠른 데이터 수집이 가능합니다. 요약하면, 이러한 데이터는 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 근종 부피를 빠르고 정확하게 측정 할 수 있음을 보여줍니다. 단일 유충은이 방법으로 6 일 동안 성공적으로 반복적으로 측정되었습니다.
확인된 조직 단위의 성장에 대한 비교 연구를 위해, 기술된 방법은 신뢰성 있고 정확한 부피 추정치를 제공한다. 그러나 정확한 절대 부피를 얻으려면 여러 가지 수정 사항을 적용할 수 있습니다. 첫째, 이미징 중에 더 나은 가로 YZ 및 parasacittal XY 슬라이스를 얻기 위해 접시 또는 현미경 스테이지를 기울여 비스듬한 장착으로 인한 오류를 수정하거나 YZ 슬라이스에서 노토 코드 프로파일을 사용하여 수정할 수 있습니다. 단면 단축은 원통형 노토 코드의 실제 직경을 나타내는 반면, 장축은 경사의 각도와 크기를 나타냅니다 (위의 포인트 4.6의 참고 참조). 둘째, 스캔 중 XY 및 YZ 절편의 위치는 원하는 근종을 정확하게 반영하도록 선택해야 합니다. (위의 4.6 번 항목 참고 참조). 그러나 근종 갈매기 모양의 형태는 발달 단계에 따라 달라지며 YZ 스캔을 선택할 때이를 고려해야합니다. 마지막으로, 근종(17)에서의 변화가 축을 통하여 근육 성장을 반영하는지 여부를 결정하기 위해, 몸통 또는 꼬리 영역 내로 더 나아가는 근종들이 설명된 방법에 의해 측정될 수 있다.
반복 측정은 체석 성장을 나타냅니다.
설명 된 방법의 장점은 단일 물고기에 대한 반복 분석이 쉽다는 것입니다. 개별 배아와 유충은 명백한 장기적인 영향을 받지 않고 반복적으로 매립, 측정 및 방출될 수 있습니다(그림 2H). 근종은 L과 CSA 모두에서 2에서 5dpf 사이에서 눈에 띄게 성장하여 부피가 꾸준히 증가합니다(그림 2H). 성장은 1에서 8 dpf 사이에서 이러한 방식으로 이미지화되었으며 유충도 이미징 후 방출되어 성체로 성장했습니다. 후기 애벌레 기간에 대한 추가 분석이 가능할 것으로 예상되지만, 섭식 행동에 대한 반복적 인 이미징의 영향은 이미징되지 않은 형제 자매와 비교하여 신중하게 모니터링해야합니다. 중요한 것은 색소 침착의 발달이 영상을 흐리게 할 수 있다는 것입니다. 색소 침착은 적절하게 배향 된 물고기에서 문제가되지 않지만 멜라노 포어 줄무늬가 필요한 측정을 방해하지 않기 때문에 안료는 비스듬히 장착 된 샘플에서 더 문제가 될 수 있습니다. roy;mitfa39와 같은 색소 침착 돌연변이 라인의 사용이 예상되며, 이는 실행 가능한 컨포칼 스캔 깊이의 한계에 도달할 때까지 성장 측정의 시간 창을 연장할 것입니다.
기술 된 절차의 또 다른 장점은 단기간에 걸쳐 전체 근종과 비교하여 단일 섬유의 성장에 대한 상세한 분석의 용이성입니다. DNA 주입을 통한 섬유의 모자이크 표지에 의해, 4 시간 동안 개별 확인 된 섬유에서 핵 획득 및 성장을 검출 한 다음 나중에 재분석 할 수있는 방법이 개발되었습니다 (그림 2I). 더욱이, 전체 근종의 성장은 12시간 이하(26 )에 걸쳐 측정될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 동일한 어류를 반복적으로 측정함으로써, 개체간 변동성이 제거되고 소수의 동물이 통계적으로 견고한 결과를 산출할 수 있다(26).
체석 부피를 변경하는 조작을 쉽게 감지 할 수 있습니다.
현재 프로토콜을 사용하면 신체 활동 부족과 같은 다양한 생물학적 및 생리적 조건에서 근육 성장의 변화를 조사 할 수 있습니다. 전압 게이트 Na+ 채널40을 억제하여 신경 활동 전위를 차단하는 마취 트리카인은 β-액틴:HRAS-EGFP 유충에서 근육 비활동을 유도하는 데 사용되었습니다. 앞서도 26에서 볼 수 있듯이, 세 번째와 네 번째 dpf 사이의 24시간 동안 활동이 없으면 근종 부피가 크게 감소하여 유충 근육 성장이 활동 의존적임을 나타냅니다(그림 3A). 비활성의 영향은 mCherry-CAAX(형질전환 라인 또는 mRNA 주입)와 같은 체석의 구조를 나타내는 다른 검출 방법을 사용하거나 BODIPY 염료에 유충을 밤새 담그는 방법으로도 조사할 수 있습니다(그림 3A). 후자의 접근법은 형질 전환 배경에 물고기를 교배하거나 배아를 주입 할 필요성을 제거하지만 BODIPY의 독성으로 인해 반복 측정에 사용할 수 없습니다. 따라서, 현재의 방법은 근육 조직의 부피 변화를 재현 가능하게 측정 할 수있게한다.
위에서 설명한 바와 같이, 유전자 마킹 방법을 사용하여 근종 부피를 반복적으로 측정하여 개별 물고기에서 연속적인 날에 걸쳐 근육 크기의 변화를 추적 할 수 있습니다. 동일한 발달 단계에서 개별 물고기와 전체 산란이 절대 근종 부피가 다르기 때문에 (그림 3A, 아마도 알의 크기 또는 건강 때문에), 각 개체의 성장을 측정하는 능력은 쌍을 이루는 샘플 통계 분석을 허용함으로써 개체 변이의 영향을 줄입니다. 동일한 물고기를 반복적으로 측정하면 효과를 강력하게 감지하는 데 필요한 물고기의 수가 줄어듭니다. 이 효과를 설명하기 위해, 활성 및 비활성 유충 개체군에서 3에서 4 dpf까지의 각 개체의 성장을 분석 한 결과를 4 dpf에서 만들어진 근종 크기의 단일 측정 만 사용하여 동일한 두 개체군의 분석과 비교했습니다. 누워서 누워있을 때, 각 개체에 대해 4/3 dpf 부피를 측정하는 것과 비교하여 4 dpf에서만 근종 부피를 측정 할 때 근종 크기의 명백한 감소의 더 큰 변화가 관찰되었습니다 (그림 3B). 4/3 dpf 방법 (68 % -91 %)에 비해 4 dpf 전용 측정에서 더 큰 감소 범위 (78 % -89 %)와 두 측정 간의 약한 상관 관계에 유의하십시오. 예상대로 13 개의 생물학적 복제 산물 모두의 평균 감소는 각 평가 (그림 3C)에서 유사했지만 4/3 dpf 방법의 경우 82.62 ± 1.01 % (평균 ± SEM, n = 13) 및 4 dpf 단독 방법의 경우 82.31 ± 1.92 %이지만 4 dpf 전용 방법의 추정 오차는 4/3 dpf 방법의 경우 거의 두 배였습니다. 따라서 반복 측정을 통해 개별 성장을 정량화하는 것이 이전에 입증 된 것처럼 동일한 평지 내에서 물고기 간의 크기 변동성을 제거함으로써보다 정확한 방법입니다26. 그럼에도 불구하고, 4dpf에서만 근종 부피를 측정할 때 비활성으로 인한 근종 부피의 감소에 유의미한 차이가 관찰되지 않았기 때문에(그림 3C), 데이터는 ~6-8마리의 물고기가 평신도 내에서 개체 간 크기 차이를 평균화하기에 충분하다는 것을 시사합니다. 분명히 크기 변화가 작을 때는 4/3 dpf 방법이 선호됩니다.
성장의 세포 기초 분석
근종 CSA는 근섬유 수와 섬유 크기에 의해 결정됩니다. 섬유 수는 3개의 YZ 섹션(YZ a, YZm, YZ p)에서 빠른 섬유와 느린 섬유의 수를 세어 추정할 수 있습니다. 대부분의 섹션에서 수직 근중격(VM)의 존재에서 알 수 있듯이 인접한 두 근종의 영역이 이러한 YZ 섹션에 포함되어 있지만(그림 2A), 이러한 수는 섬유 수를 정확하게 반영합니다. 초과 계산은 VM의 각 인접 세그먼트에서 파이버 쌍이 가늘어지기 때문에 VM에서 발생합니다(그림 4A). 이러한 과대 계산은 다음 방정식을 사용하여 설명 할 수 있습니다 : 섬유 수 = 총 섬유 수 - (VM과 접촉하는 섬유) / 2 참조33. 또한, 평균 섬유 부피는 근종 부피를 섬유 수로 나누어 결정할 수 있습니다. 우리는 이러한 분석을 사용하여 활동이 성장의 두 세포 측면을 모두 제어한다는 것을 밝혔습니다 (그림 4B, C).
그림 2A에서 섬유는 근종 전체에 걸쳐 크기가 다양하다는 것이 분명하며, 이는 계산된 평균 섬유 부피 측정에 반영되지 않는 현실입니다. 2마리의 물고기로부터 소마이트(17)의 각 섬유 주위를 뽑음으로써, 측정된 섬유 단면적은 28μm2 내지 217μm2 범위로 나타났다(도 4D). 그러나 실제로는 많은 섬유가 근종 내에서 비스듬히 기울어 져 있으므로 이러한 CSA 측정은 장축에 수직 인 섬유의 실제 CSA를 반영하지 않습니다. 반대로, 근종 내의 다양한 섬유 각도로 인해, 전후방으로 정렬되지 않은 방향으로 달리는 모든 섬유는 근종 길이와 다른 길이를 갖는다. 근종을 단일 섬유 부피로 완전히 분할하거나 각 섬유의 경사각을 측정 한 후 계산해야만 우회 할 수있는 이러한 경고에도 불구하고 측정 된 CSA는 각 물고기의 섬유 크기 다양성 추정치를 제공합니다. 예를 들어, 개별 섬유는 CSA에서 비활성으로 감소하여 활성 (마취되지 않은) 대조군 유충에 대해 누적 빈도 곡선에서 왼쪽으로 이동했습니다 (그림 4E). 비활성 물고기는 활성 물고기보다 ~ 10 개 적은 섬유질을 가지고 있기 때문에 (그림 4B), 활성 마취되지 않은 물고기의 가장 작은 섬유 10 개 (새로운 섬유라고 가정하에) 또는 10 개의 가장 큰 섬유 (대체 극단으로)는 비교에서 생략되었으며, 이는 근종 부피의 대부분의 손실이 섬유 성장 부족으로 인한 것임을 보여주었습니다. 새로운 섬유 형성의 실패보다는(그림 4F). 종합하면, 이러한 데이터는 설명 된 방법이 근육 조직의 형성 및 성장에 대한 신체 활동의 역할에 대한 상세한 조사를 허용한다는 것을 보여줍니다.
전기 자극에 의한 활동의 재 부과
신체 활동은 근육 성장에 필요합니다 (그림 3A). 그렇지 않으면 비활성 유충에서 전기 자극에 의해 근육 수축을 다시 부과하여 강한 수축 반응을 유발하는 방법이 설명되어 있습니다(그림 5A, 보충 파일 8). 근육계를 최대한 활성화하기 위해 정확한 자극 파라미터가 여기에 설명되어 있지만(그림 5B), 근육 활성화 및 운동 선량을 제어하기 위해 프로토콜(전류 진폭, 주파수, 펄스 지속 시간 등을 변경하여)을 변경할 수 있습니다. 따라서, 현재의 방법은 활동 시합 사이의 표준화된 행동을 갖는 조절된 활동 자극을 제공하여, 운동18의 현재 동물 모델의 중요한 한계를 극복한다.
설명 된 방법은 근육 성장의 다양한 측면 (예 : 증식 및 비대)을 연구하기 위해 제브라 피쉬 유충을 사용할 수있는 잠재력을 보여줍니다. 특히, 제브라피쉬 유충의 근형성은 약리학적으로 유도된 비활성 및 전기적으로 유도된 수축성을 통한 분석이 가능한 것으로 나타났다. 이 접근법은 신체 활동이 생체 내에서 근육 성장으로 이어지는 분자 메커니즘을 연구 할 수있게합니다.
그림 1 : 제브라 피쉬 유충에 근육 전기 활동을 재 도입하기위한 자극 챔버 설계. 전극이 장착된 6웰 세포 배양 플레이트는 2% 아가로스 겔 내에서 만들어진 웰에서 유충을 유지할 수 있습니다. 맞춤형 4웰 빗은 개별 물고기 유충의 위치와 방향을 유지하고 전기 자극 시 격렬한 경련 중에 은선에 접촉하는 것을 방지하기 위해 아가로스에 직사각형 우물(표시된 치수)을 만들기 위해 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 살아있는 제브라피쉬 α-액틴:mCherry-CAAX(A,B,E) 또는 β-액틴:HRAS-EGFP 형질전환 유충(H,I)의 근육량 측정. 유충은 측면 보기에서 이미지화되었으며 위쪽 패널(A, B, E)에서 앞쪽에서 왼쪽으로 등쪽에서 위쪽으로 표시됩니다. (A) 4 슬라이스 방법에서, XY 평면 (파란색 화살표)의 수직 근격막 (VM) 사이에서 측정 된 somite 17 (L)의 길이에 YZ 평면 (YZm, YZa 및 YZp, 파선 노란색 선)에서 측정 된 3 개의 단면적 (CSA)의 평균을 곱하여 근종 부피를 계산했습니다. (B) Full Stack 방법에서, 살아있는 제브라 피쉬 유충의 전체 Z 스택의 각 슬라이스에서 체석 17 근종의 면적 (노란색으로 표시된 예)을 측정하고 근종 영역의 합에 슬라이스 간 거리를 곱했습니다. (C) 4 슬라이스와 풀 스택 방법 사이의 높은 일치도. 색상은 개별 β- 액틴 : HRAS-EGFP (사각형) 또는 α- 액틴 : mCherry-CAAX (원) 물고기를 나타냅니다. (D) Myotome 부피는 4-슬라이스법을 사용하여 계산하였을 때 약간, 그러나 상당히 크다. (E) 테이퍼링 제브라 피쉬 유충에서 4 슬라이스 방법으로 측정 한 바와 같이 더 많은 전방 체세포가 후방 체세포보다 큽니다. (F,G) 3개의 CSA 섹션(4슬라이스 방법) 또는 단일 YZm CSA(2슬라이스 방법)의 평균을 사용하여 수행된 부피 측정 간의 강력한 상관 관계. p-값은 분산이 같음(D,G)을 갖는 두 개의 꼬리 t-검정 또는 Bonferroni 사후 검정(E)을 사용한 편도 분산 분석의 결과를 보여줍니다. NS, 중요하지 않습니다. (H) β-액틴:HRAS-EGFP 및 myog:H2B-mRFP를 발현하는 3개의 개별 어류(색상)에서 2 내지 5 dpf의 근종 16 부피, 길이(L) 및 단면적(CSA)의 측정. 각 시점에서 녹색 개인의 YZm 이미지가 위에 나와 있습니다. (I) 자동화된 상수 임계값 분할에 의해 측정된 단일 섬유 성장. β-액틴:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP 물고기는 1-2 세포 단계에서 CMV:Cerulean 플라스미드를 주사하여 모자이크로 표지됩니다. 소마이트 10의 단일 Cerulean 표시 섬유는 Zeiss LSM880에서 고해상도 전체 XYZ 스택으로 반복적으로 스캔되었습니다. 표시된 이미지는 대표적인 단일 슬라이스(왼쪽)와 3차원 분할 볼륨의 투영(오른쪽)입니다. 그래프의 각 데이터 포인트는 3dpf(0시간), 4시간 후 및 5dpf(54시간)에서 동일한 파이버의 단일 스캔을 나타냅니다. 재현성을 보여주기 위해 삼중 스캔이 이루어지고 시점별로 분할되었습니다. 흰색 화살촉은 섬유 핵을 가리 킵니다. 3과 5 DPF 사이에 두 개의 핵이 추가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 체마이트 17의 활동 의존적 근육 성장. (A) 3 내지 4 dpf 사이에 트리카인(분홍색)을 적용하여 24시간 동안 활성을 억제하면 형제(파란색)의 비히클 대조군에 비해 BODIPY로 염색된 형질전환 계통과 비형질전환 어류 모두에서 근종 부피가 감소한다. 부피는 4-슬라이스법으로 정량화하였다. 기호 모양은 별개의 평신도(생물학적 복제물)의 복제 실험을 나타냅니다. 큰 기호는 평균 ± SEM 값을 나타냅니다. 작은 희미한 기호는 개별 복제 유충의 양을 보여줍니다. (B) 4 dpf (4 dpf 만, 상부 개략도) 또는 3 및 4 dpf 사이의 근종 부피 변화 (4/3 dpf, 하부 개략도)에서 근종 부피의 단일 측정에 의해 결정된 대조군 형제와 비교하여 비활성 어류의 근종 부피 감소의 비교. 각 기호는 단일 평신도에서 ~5개의 비활성 물고기에서 근종 17의 평균 부피를 ~5개의 활성 대조군 형제의 평균 근종 17 부피로 나눈 값을 나타냅니다. (C) 4 dpf 단독 또는 4/3 dpf 방법으로 측정했을 때 비활성 물고기의 근육 성장의 평균 감소에는 차이가 관찰되지 않았습니다. 막대 내의 숫자는 분석된 총 물고기 수를 나타냅니다. p-값은 Bonferroni 사후 검정(A)을 사용한 이원 분산 분석(A) 또는 분산이 같지 않은 양측 t-검정(C)의 결과를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 비활동으로 인한 근육 성장의 세포 수준 변화. (A) 파란색과 빨간색 근종이 만나는 테이퍼링 섬유의 이중 계산으로 인해 VM에서 과대 계산이 어떻게 발생하는지 보여주는 회로도. 평균 섬유 수는 6이지만 실제 평균값은 5.5입니다. 수정된 개수는 더 나은 근사치를 제공합니다. (ᄃ,씨) 섬유 수 (B)와 평균 섬유 부피 (C)는 활성 (bue) 유충에 비해 비활성 (분홍색)에서 감소합니다. 기호 모양은 별개의 평신도(생물학적 복제물)의 복제 실험을 나타냅니다. 큰 기호는 평균 ± SEM 값을 나타냅니다. 더 작은 희미한 기호는 개별 복제 유충의 가치를 나타냅니다. 막대 내의 숫자는 분석된 총 물고기 수를 나타냅니다. (D) 단일 유충에서, myotome 17의 각 섬유 프로파일을 개략적으로 설명하고 CSA를 결정하였다. 상자에는 평균 ± SEM이 표시됩니다. p-값은 Bonferroni 사후 검정(B,C)을 사용한 이원 분산 분석 또는 분산이 같음(D)을 사용한 양측 t-검정의 결과를 보여줍니다. (E, F) 활성 대조군(파란색) 및 비활성(분홍색) 유충의 섬유 크기 분포를 보여주는 누적 빈도 곡선. 모든 섬유(E)의 비교, 또는 추정된 초기의 작은 또는 대안적인 극단에서, 큰 섬유(F)의 생략 후, 섬유 크기의 증가가 섬유 수의 증가가 아니라 주로 근종의 활동-주도 성장을 설명한다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 짧은 전기 자극은 마취된 제브라피쉬 유충에서 파상풍 근육 수축을 유발합니다. (A) 전기 자극이 3dpf에서 마취된 유충의 최대 수축을 유발하는 방법을 보여주는 순차 이미지(보충 파일 8의 비디오에서 캡처). 시간 단위(초)입니다. 빨간색 상자는 3개의 연속 1초 자극 열차가 시작될 때의 움직임을 나타냅니다. 각 이미지는 40ms 노출입니다. (B) 200 고주파, 20 V 전기 충격의 1 초 열차가 5 초마다 주어지는 전기 자극 체제를 보여주는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 현미경 XYZ 참조 프레임(검은색 축)에 대해 완벽하게 (왼쪽 상단) 및 불완전하게 장착된 유충의 캡처된 이미지의 개략도. 근종 (녹색), 노토 코드 (노란색), 신경관 (황갈색), 측정 된 근종 매개 변수 (빨간색), 측정 된 notochord 매개 변수 (검은 색 화살표) 및 가능한 또는 실제 물고기 회전 (파란색). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: ZEN의 XY 이미지에서 소마이트 길이 측정을 보여주는 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: ZEN의 YZ 이미지에서 CSA 측정을 보여주는 스크린 샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 피지/ImageJ의 XY 이미지에서 측정한 소마이트 길이를 보여주는 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일: ZEN에서 YZ 이미지에 대한 보정 파라미터 추출을 보여주는 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: 피지/ImageJ에서 YZ 이미지의 보정을 보여주는 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7: 피지/ImageJ의 YZ 이미지에서 CSA 측정을 보여주는 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 8: 트리카인 마취 된 3 dpf 유충의 직접적인 전기 자극 (길이 1 초)에 의해 유발되는 근육 수축을 보여주는 대표적인 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 색소 침착이 영상에 큰 방해가되지 않고 일시적인 마취 및 / 또는 고정이 잘 견딜 수있는 단계 또는 유전 적 변이에서 살아있는 제브라 피쉬 유충의 근육량을 정확하고 효율적으로 추정하는 방법을보고합니다. 우리는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용했지만 설명된 접근 방식은 스피닝 디스크 컨포칼 또는 라이트 시트 현미경 및 별개의 초점면에서 이미지 스택을 생성하는 다른 모든 방법에 적용할 수 있습니다. 조직 크기 및 세포 함량 추정에 대한 점점 더 정교해지는 일련의 접근법이 설명된다. 각 방법에는 장점과 한계가 있으며, 이를 정량화할 수 있습니다. 조직 성장 연구의 주요 한계는 급성 투여 자극에 의해 촉매되는 일련의 분자 또는 하위 세포 사건에 반응하여 성장 속도가 변함에 따라 성장 변화를 실시간으로 분석하기가 어렵다는 것입니다. 또한 개별 개인을 비교할 때 개체 차이가 문제를 일으킬 수 있습니다. 현재의 접근법은 단일 살아있는 개인에서 하루 미만의 기간 동안 조직 성장을 측정 할 수있게합니다. 접근법의 적용은 분 단위로 예상 할 수 있습니다.
설명 된 방법은 지금까지 실행 불가능했던 분석을 허용합니다. 4슬라이스 방법을 사용하면 숙련된 작업자가 약 20마리의 물고기 샘플에서 한 시간 이내에 근육 성장 분석의 이미징 부분을 완료할 수 있습니다. 이것은 동일한 수의 물고기에 대해 최소 3시간이 걸리는 기존의 Full Stack 방법(즉, 3배 더 길게)과 완전히 대조됩니다. 후속 하위 세포 분석에 고해상도 이미지가 필요한 경우 Full Stack 방법은 물고기 당 30 분이 쉽게 필요할 수 있으므로 유사한 발달 단계에서 동물 코호트의 성장 분석이 불가능합니다. 대조적으로, 2슬라이스 또는 4슬라이스 방법을 사용하면 빠른 고품질 이미지 캡처가 가능합니다. 이미지 분석을 고려하면 Full Stack 방법에 비해 작업자 시간(자동화된 이미지 분할이 없는 경우)을 절약할 수 있는 2슬라이스 또는 4슬라이스 방법의 이점은 엄청납니다. 각 물고기는 풀 스택 분석에는 약 20분이 필요하지만 4슬라이스 분석에는 3-4분밖에 걸리지 않습니다. 거의 정확한 2슬라이스 방법을 사용하여 작업자 시간을 추가로 절약할 수 있습니다. 따라서, 설명된 방법은 효율적이고, 따라서 실험 설계에서 유연성을 증가시킨다.
4- 또는 2-슬라이스 방법의 주요 한계는 두 방법 모두 체세포의 겹치는 갈매기 모양(예를 들어, 두 개의 인접한 체세포(예를 들어, 근종 16 및 17)의 영역의 부피)으로 인해 추정치라는 것이다. 이것은 YZ 슬라이스가 선택된 정확한 위치에 따라 실제 myotome 17 부피를 약 2 % 과대 평가할 수 있음을 보여줍니다. 또한 측정 중 소마이트 경계를 수동으로 추적하면 추정치의 변동에 기여할 수 있지만 실험자 간 차이는 거의 발견되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 측정 오류는 임계값, 필터링 및 분할 알고리즘을 사용하여 해결하여 보다 객관적이고 재현 가능한 방식으로 표면적을 획득할 수 있습니다. 그러나 배경 형광의 변화(예: LMA의 임베딩 및/또는 두께로 인한) 및 시간 경과에 따른 개별 유충의 형광 단백질 발현 수준을 설명하기 위해서는 여전히 사용자 정의가 필요합니다. 이러한 자동 측정은 β-actin:HRAS-EGFP 라인과 같이 근육특이적이지 않은 리포터를 사용하는 경우 훨씬 더 어려울 것입니다. 그럼에도 불구하고, 많은 상황에서, 예를 들어, 모든 근육 조직에 영향을 미칠 것으로 예상되는 다른 치료를받은 물고기 사이의 조작 효과를 비교할 때, 부정확성은 중요하지 않을 수 있습니다. 그러나, 예를 들어, myotome 17에서만 계산된 섬유 또는 핵 수와 비교하기 위해 최대 정확도가 필요한 경우, '슬라이스' 방법이 개선될 수 있다. 이는 힘든 Full Stack 방법을 사용하거나, 측정된 4슬라이스 부피에 0.98을 곱하여 수학적 보정을 하거나, YZ CSA 스캔의 위치를 후방으로 이동하여 근종 17의 실제 CSA를 보다 정확하게 반영함으로써 달성할 수 있습니다.
이 방법의 두 번째 한계는 물고기의 장착 방향에 대한 민감성입니다. 실제로 숙련된 작업자는 많은 샘플을 삽입하기 위해 신속하게 작업하는 경우에도 대부분의 경우 합리적인 한계 내에서 물고기의 방향을 지정할 수 있습니다. 현미경 스테이지의 장비 수정은 스캔 전에 요 및 롤을 수정할 수 있도록 예상할 수 있습니다. 이러한 장치 없이, 측정된 부피를 보정하는데 사용될 수 있는 오배향을 정량화하는 방법이 설명된다. 또한, 잘못된 방향이 측정 된 부피의 변동성을 증가시켜 작은 효과 크기를 관찰 할 기회를 감소 시키더라도, 많은 상황에서 이러한 변화는 대조군 및 실험 샘플에 유사하게 영향을 미칩니다. 따라서 운영자가 문제를 알고 있는 경우 거짓 긍정 결과가 발생할 가능성은 거의 없습니다.
기술된 방법은 초기에 근육 성장에서 전기적 활동의 역할을 분석하기 위해 적용되었으며, 광범위한 종에서 분석의 오랜 역사를 가진 주제이다(18에서 검토됨). 이를 위해 내인성으로 유발 된 활동을 차단하는 간단한 방법을 자세히 설명하고 제브라 피쉬 유충에서 제어 된 패턴 전기 자극으로 대체합니다. 이 접근법의 장점은 신경 피드백 대조군 (40)의 제거, 변경된 영양의 영향의 제거 및 단백질 회전율(26)과 같은 성장 프록시보다는 성장 자체에 대한 일주기 효과를 분석하는 능력이다. 전기적 활동의 다른 패턴이 섬유 유형, 크기 및 신진 대사 41,42,43,44,45,46,47,48을 조절하는 뚜렷한 근육 반응을 유발함에 따라 현재의 방법은 제브라 피쉬를 그러한 분석에 개방합니다.
설명 된 방법은 상대적으로 탐험되지 않은 제브라 피쉬를 활용하여 근육 생리학, 세포 생물학 및 병리학의 여러 측면을 전례없는 시간적 및 공간적 해상도로 분석 할 수있는 일련의 기술을 제공합니다. 현재의 접근법은 다른 종, 신체 부위 및 발달 단계에 분명히 적용될 수 있습니다. 제브라 피쉬 유충의 빠른 초기 성장은 조직 성장 및 형태 형성에 대한 조작의 급성 효과를 감지하는 것을 특히 매력적인 연구 분야로 만듭니다. 또한, 제브라 피쉬 근육은 포유류와 다양한 성장 메커니즘 및 제어를 공유하는 것으로 나타났습니다. 제브라 피쉬는 인간과 근육 분자 유전학, 세포 및 발달 생물학의 여러 측면을 보존하는 척추 동물이지만 근육 성장 제어에도 상당한 차이가 있습니다. 예를 들어, 느리고 빠른 섬유 유형은 물고기에서 공간적으로 더 명확하게 분리되어 있으며 근육의 신경 분포는 차이를 보여줍니다. 또한 지금까지 개발 초기 단계 만 분석 할 수 있었다는 점을 명심해야합니다. 나중 단계에서도 유사한 분석이 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 Hughes 연구소 구성원인 Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin 및 Vladimir Snetkov가 설명된 프로토콜의 개발을 위해 기울인 노력과 플라스미드 또는 제브라피쉬 라인을 공유한 Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau 및 Peter Currie에게 깊은 빚을 지고 있습니다. SMH는 프로그램 보조금 G1001029, MR / N021231 / 1 및 MR / W001381 / 1 지원을받는 의학 연구위원회 (MRC) 과학자입니다. MA는 King 's College London에서 MRC 박사 과정 과정 박사 과정 학생을 취득했습니다. 이 작업은 학자, 멘토 및 친구인 David M. Robinson의 삼각법 입력의 혜택을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
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