Summary
Optisk klarhet er en stor fordel for cellebiologisk og fysiologisk arbeid hos sebrafisk. Det beskrives robuste metoder for måling av cellevekst hos enkeltdyr som gir ny innsikt i hvordan vekst av skjelettmuskulatur og nabovev integreres med helkroppsvekst.
Abstract
En rekke metoder kan brukes til å visualisere individuelle celler i hele kroppen av levende embryonale, larve eller unge sebrafisk. Vi viser at levende fisk med fluorescerende merkede plasmamembraner kan skannes i et konfokalt laserskanningsmikroskop for å bestemme volumet av muskelvev og antall muskelfibre som er tilstede. Effektive tilnærminger for måling av cellenummer og størrelse hos levende dyr over tid beskrives og valideres mot mer krevende segmenteringsmetoder. Metoder beskrives som tillater kontroll av muskelelektrisk, og dermed kontraktil, aktivitet. Tap av skjelettmuskulaturkontraktil aktivitet reduserte muskelveksten sterkt. Hos larver beskrives en protokoll som tillater gjeninnføring av mønstret elektrisk fremkalt kontraktil aktivitet. De beskrevne metodene minimerer effekten av interindividuell variabilitet og vil tillate analyse av effekten av elektriske, genetiske, medikamentelle eller miljømessige stimuli på en rekke cellulære og fysiologiske vekstparametere i sammenheng med den levende organismen. Langtidsoppfølging av de målte effektene av en definert tidlig livsintervensjon på enkeltpersoner kan senere utføres.
Introduction
Regulert vevsvekst, som omfatter økning i cellenummer (hyperplasi) og / eller cellestørrelse (hypertrofi), er en avgjørende faktor i utvikling, regenerering og økologisk og evolusjonær tilpasning. Til tross for store fremskritt innen molekylærgenetisk forståelse av både celle- og utviklingsbiologi de siste tiårene, er mekanistisk forståelse av regulering av vev og organstørrelse fortsatt i sin barndom. En grunn til denne lacuna i kunnskap er vanskeligheten med å kvantifisere vevsvekst i levende organismer med nødvendig romlig og tidsmessig nøyaktighet.
Ulike aspekter ved vekst av hele organismer kan måles gjentatte ganger over tid, og avslører vekstkurver for hvert individ 1,2,3,4,5. Stadig mer sofistikerte skanningsmetoder, for eksempel dobbel røntgenabsorptiometri (DXA), datastyrt tomografi (CT) og magnetisk resonansavbildning (MR), tillater sporing av vekst av hele organer og andre kroppsregioner (for eksempel individuelle identifiserte skjelettmuskler) hos enkeltindivider, både menneskelige og i modellorganismer 6,7,8,9,10 . Imidlertid har disse metodene ennå ikke oppløsningen til å avsløre individuelle celler, og dermed har koblingene mellom cellulær oppførsel og vevsnivåvekst vært vanskelig å skjelne. For å gjøre slike koblinger har tradisjonelle studier ofte stolt på kohorter av lignende individuelle dyr, hvorav noen blir ofret på suksessive tidspunkter og deretter analysert i cytologisk detalj. Slike tilnærminger krever gjennomsnittlig de observerte endringene på tvers av grupper av (helst like, men likevel variable) individer og lider dermed av mangel på tidsmessig og romlig oppløsning, noe som gjør det vanskelig å finne korrelerte hendelser på mobilnivå som tyder på årsak og virkning.
Studier på virvelløse modellorganismer, først i C. elegans og D. melanogaster, har omgått disse problemene ved å utvikle optisk mikroskopi for å oppnå cellulær oppløsning og nøyaktig måle vekst over tid hos enkeltpersoner. Slike studier har avslørt påfallende invariant cellelinjeadferd i veksten av disse små modellorganismene 11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange dyr, inkludert alle vertebrater, ubestemte cellelinjer, og kontrollerer vevsvekst ved mystiske tilbakemeldingsprosesser som tjener til å gjøre det genetisk kodede vekstprogrammet til en funksjonell tredimensjonal organisme med alle dets bestanddeler vev og organer passende tilpasset i størrelse. For å forstå disse komplekse vekstprosessene er det ønskelig å avbilde hele vev eller organer over tid hos enkeltpersoner som kan manipuleres eksperimentelt ved genetiske, farmakologiske eller andre inngrep på et tidspunkt for valg og effekten analyseres deretter.
Hver vertebrat skjelettmuskel har en definert størrelse, form og funksjon, og godt karakteriserte interaksjoner med tilstøtende vev, som bein, sene og nerver. Noen muskler er små, ligger rett under huden og er derfor gode kandidater for høyoppløselige bildestudier. I likhet med de fleste organer vokser hver muskel gjennom embryonal, postnatal og juvenilt liv, før de når en stabil voksenstørrelse. Muskel har imidlertid også en unik evne til å endre størrelse i voksenlivet, avhengig av bruk og ernæring18, og denne egenskapen har stor innvirkning på organismal fitness, sportslige prestasjoner og selvstendig liv. Tap av muskelmasse og funksjon i alderdommen, sarkopeni, er et problem med økende bekymring for samfunn som står overfor en aldrende befolkning 19,20,21.
Vi og andre har fokusert på veksten av definerte blokker av skjelettmuskelvev i den segmentalt repeterende kroppen av sebrafisklarver, som et tilsynelatende lukket system som inneholder flere hundre celler der vevsvekst, vedlikehold og reparasjon kan observeres og manipuleres 22,23,24,25,26. Mens noe kvantitativt arbeid tidligere er rapportert 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, er ingen detaljert og validert metode for å måle muskelvekst i cellulær detalj i individuelle virveldyrorganismer over tid tilgjengelig. Her beskrives en effektiv protokoll for hvordan man utfører slike gjentatte målinger, sammen med validering, og et eksempel på bruken av den til å analysere endringer i både hypertrofisk og hyperplastisk vekst som svar på endret elektrisk aktivitet er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som er beskrevet ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og under egnede lisenser fra UK Home Office i samsvar med Animal (Scientific Procedures) Act 1986 og påfølgende modifikasjoner. Embryoer/larver bør oppdrettes ved 28,5 °C til gastruleringen er fullført, men kan deretter holdes ved 22-31 °C for å kontrollere utviklingshastigheten. Fisk kan skannes eller stimuleres ved romtemperatur.
1. Bedøv sebrafisk larver
- Kryss egnet fluorescerende reporter voksen fisk som Tg (Ola.Actb: Hsa.HRAS-EGFP) vu119Tg referanse 36 eller Tg (α-actin: mCherry-CAAX) pc22Tg referanse37 og samle embryoer som beskrevet38.
- På valgtidspunktet, for eksempel 2 dager etter befruktning (dpf), bedøve embryoer kort ved hjelp av Tricaine-holdig fiskemedium (enten fiskevann eller E3 medium), og skjerm for EGFP eller mCherry under et fluorescensmikroskop, for eksempel en Leica MZ16F. Hvis man har mange embryoer, velg de med det lyseste signalet. Returner embryoer til normalt fiskemedium umiddelbart etter screening.
2. Montering av fisk for konfokal skanning
- Slå på det konfokale laserskanningssystemet og laserne for å la systemet stabilisere seg i 30-60 minutter.
MERK: Her brukte vi et Zeiss LSM 5 Exciter-mikroskop med stående materialstativ (som forbedrer arbeidsavstanden) utstyrt med et 20x/1.0 W vann-nedsenkningsmål. - Forbered 1% lavsmeltende agarose (LMA) og hold i en 37 ° C varmeblokk for gjentatt bruk i et 1,5 ml rør. For å unngå varmesjokk, fjern LMA aliquot fra varmeblokken og la den avkjøles til like over innstillingen før du påfører larven, tester mot huden for å bedømme riktig temperatur, som når du vurderer temperaturen på babyens formel melk.
- Velg fisk som skal monteres og bedøve hver fisk etter tur med Tricaine (0,6 mM i fiskemedium).
- Ta en petriskål med en diameter på 60 mm som er belagt med et lag på 1% agarose og legg på scenen i et dissekeringsmikroskop.
- Overfør larven med en 1 ml plast Pasteur-pipette på den 60 mm belagte petriskålen og fjern så mye overført medium som mulig. Deretter, fortsatt ved hjelp av Pasteur-pipetten, legg 5 til 10 dråper LMA på fisken og plasser raskt horisontalt i lateral visning med tang (eller en brannpolert fin glassnål) før LMA setter seg. For optimal avbildning er det ønskelig å plassere larven nær den øvre overflaten av LMA.
- Alternativt kan du bruke en 1 ml plast Pasteur-pipette, samle larven med så lite fiskemedium som mulig, og overføre larven til aliquot av avkjølt LMA. La larven synke i 5 s for å bli helt omgitt av LMA. Hent deretter larven og overfør den i en dråpe LMA på den agarosebelagte petriskålen. Orienter og plasser larven raskt som beskrevet ovenfor.
- Orienter larven med både anteroposterior- og dorsoventralaksene innenfor 10° fra horisontalaksen (se merknaden "Ved feil og korreksjon", punkt 4.6 nedenfor).
- Hvis larven ikke er riktig montert horisontalt nær overflaten av agarosedråpen, fjern og legg den inn igjen. Larver kan enkelt hentes ved forsiktig sug ved hjelp av en mikrofin 1 ml plast Pasteur-pipette, og LMA kan fjernes forsiktig ved hjelp av Kimwipes. Øvelse gjør virkelig perfekt i monteringsprosedyren; Tilbring en ettermiddag med å legge inn noen uviktige larver før du prøver dette på et ekte eksperiment.
MERK: På mikroskopdesign: Mange laboratorier bruker inverterte konfokale mikroskoper for avbildning gjennom en coverslip. Vi har funnet at gjentatt innebygd og fjerning av fisk holdt i agarose under en coverslip for observasjon i et omvendt mikroskop fører til større tap av prøver under gjentatt skanning enn i den beskrevne prosedyren med et oppreist mikroskop. Av denne grunn anbefales bruk av et oppreist system, hvis tilgjengelig. Likevel er en nøkkel til data av høy kvalitet riktig valg og bruk av objektive og skanneparametere, et emne som er for stort for diskusjon her.
- Hvis larven ikke er riktig montert horisontalt nær overflaten av agarosedråpen, fjern og legg den inn igjen. Larver kan enkelt hentes ved forsiktig sug ved hjelp av en mikrofin 1 ml plast Pasteur-pipette, og LMA kan fjernes forsiktig ved hjelp av Kimwipes. Øvelse gjør virkelig perfekt i monteringsprosedyren; Tilbring en ettermiddag med å legge inn noen uviktige larver før du prøver dette på et ekte eksperiment.
3. Konfokal skanning
- Når LMA har satt, oversvømme retten med rundt 10 ml Tricaine-holdig fiskemedium. Hvis du planlegger å fange konfokale stabler, la den monterte fisken hvile i minst 10 minutter før du fortsetter til skanning, da det oppstår noe agarosehevelse.
- Legg prøveskålen til scenen i det konfokale systemet, finn larven og fokuser på ønsket somite. Somite 17 kan velges på grunn av sin enkle lokalisering nær analventilen og enkel avbildning. Sjekk ved å telle somitter fra fremre.
MERK: Den første somitten er smeltet bak øret og har ingen fremre kant, men kan lett observeres å ha strikkede muskelfibre. - Sett opp som for å fange en Z-stack ved å definere topp (dvs. like over huden) og bunn (dvs. like under notokordet, for å inkludere hele somite, selv om fisken er montert litt skjevt). Både venstre og høyre side kan fanges etter ønske. Dette vil sikre at alle raske YZ-skanninger fanger opp ønsket region (er).
- Ta et XY-bilde som følger. Orienter skanneområdet i forhold til fisken, slik den konfokale programvaren tillater. Plasser fisken med anteroposterioraksen parallelt med den avbildede X-aksen og dorsoventralaksen parallelt med Y-aksen med somite 17 i midten av feltet som vist i tilleggsfil 1. Fokuser på et mellomnivåplan i det øverste myotomet der hele epaxiale og hypaksiale somitthalvdeler sammen med den vertikale og horisontale myosepta er synlige og tar et høyoppløselig XY-bilde . Husk å navngi og lagre bildet.
- Ta ett eller flere YZ-bilder som følger. I de representative resultatene (nedenfor) sammenlignes nøyaktigheten av 2-skive- og 4-skivemetodene. I 2-skive-tilnærmingen brukes enkle XY - og YZ-skanninger . I 4-skive-tilnærmingen er tre YZ-skanninger i gjennomsnitt for å gi et mer nøyaktig estimat av myotomvolum. Hvis det kreves av den konfokale programvaren, må du orientere skannefeltet på nytt.
- Tegn en nøyaktig dorsal til ventral linje over den valgte somitten vinkelrett på fiskens anteroposteriorakse i en valgt anteroposterior posisjon. Utfør en Z-stack linjeskanning.
- Gjenta YZ-linjeskanningen tre ganger ved definerte anteroposteriorposisjoner langs den valgte myotomen for å fange YZa, YZm og YZp. Representative resultater er vist i figur 2A. Navngi og lagre disse bildene sammen med det relaterte XY-bildet.
MERK: Ved valg av YZ-plan: Myotomen er V-formet og formen endres under vekst. For å oppnå den mest nøyaktige vurderingen av myotome 17-volum med 4-skivemetoden, plasser YZa på den fremre spissen av myotomet, YZp på myotomens bakre spisser ved dorsale og ventrale ekstremer, og YZm halvveis mellom YZa og YZp. Forutsatt at somittene smalner jevnt, vil gjennomsnittet av målinger fra hver YZ-seksjon representere myotomet som helhet. For 2-skivemetoden skal den enkle YZ-skanningen plasseres i den bakre enden av det horisontale myoseptumet, som omtrent tilsvarer anteroposterior-senteret av myotomet av interesse (for eksempel YZm). Alternativt kan et sett med tre YZ-seksjoner tas ved fremre, midtre og bakre av det horisontale myoseptumet, men som vist nedenfor vil en slik måling litt over- eller underestimere myotomvolum (for henholdsvis rostrale og kaudale somitter på grunn av myotom-nedtrapping). I utgangspunktet er konsistens i posisjonering av YZ-skiveplan (er) mellom fisk og eksperimenter nøkkelen til reproduserbarhet.
4. Analyse
- Når myotomet endrer størrelse langs fisken på en gradert måte, må du alltid jobbe med samme somitt i komparative studier.
- For å måle og beregne myotomevolumet, bruk konfokal programvare (for eksempel LSM-filer opprettet ved hjelp av Zeiss ZEN-mikroskopprogramvare) eller åpen kildekode universell bildeanalyseprogramvare, for eksempel Fiji / ImageJ.
MERK: Hvis du endrer filformater, må du kontrollere at Z-trinnsstørrelsen er riktig overført, da ikke all programvare kan lese proprietære konfokale filformater riktig. Hvis du for eksempel vil importere et ZEN-linjeskanningsbilde til Fiji, bruker du først File/Export-kommandoen til å eksportere som .tif i bildevinduet Full oppløsning – enkeltplanformat, og deretter importerer du til Fiji. Selv om YZ scan.lsm kan åpnes direkte i Fiji, blir de resulterende YZ-bildene vanligvis komprimert i Z-dimensjonen på grunn av feil evaluering av Z-trinnstørrelsen. - Analyse ved hjelp av ZEN
- Først åpner du XY scan.lsm-filene i ZEN. Gå til Grafikk-fanen og velg linjeverktøyet. Tegn en linje mellom de to vertikale myosepta av somite 17 som spenner over hele myotomlengden (parallelt med fiskens anteroposterior-akse). Merk av i M-boksen for å vise måleverdiene (Lengde = 89,71 μm, se Tilleggsfil 2).
- Åpne YZ scan.lsm-filene. Under Grafikk-fanen velger du Closed Bezier-verktøyet . Tegn rundt omkretsen av myotomet. Når du er ferdig, merk av i M-boksen, dette vil avsløre verdien av målingen (Areal = 11980,01 μm2, se Tilleggsfil 3).
- Registrer verdiene for hver måling manuelt i et regneark. Gjennomsnittlig CSA-målingene etter behov. Volum av myotomet kan beregnes som Volum = Myotome lengde x CSA, dvs. 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
- Analyse ved hjelp av Fiji/ImageJ
- Åpne XY scan.lsm-filene i Fiji/ImageJ. Sjekk om XY-bilder som åpnes direkte på Fiji, er riktig kalibrert i skala, slik de skal være.
- Velg rett linje-verktøyet fra ikonene. Tegn en linje langs lengden på somitt 17 som beskrevet i trinn 4.3.1. Angi måleparametere ved å gå til Analyser, velg deretter Angi mål ..., og merk av i følgende bokser Område og Vis etikett. For å måle, trykk bare på hurtigtasten M, eller gå til Analyser-menyen og velg Mål. Et resulterende popup-vindu viser alle måleverdier (dvs. lengde = 90,023 μm; se tilleggsfil 4). Resultatene kan lagres i form av .csv og åpnes i Microsoft Excel eller lignende for senere analyse.
- Hvis du vil måle CSA på YZ-bildene, åpner du YZ-bilder i .tif format som beskrevet i trinn 4.2.
- Kalibrer YZ -.tif-bildene ettersom de ikke er kalibrert når de eksporteres. Parametere for kalibrering kan fås i ZEN ved å gå til Info for de valgte bildene: ta opp verdiene Skalering X (0,489 μm) og Skalering Z (0,890 μm; se Tilleggsfil 5). Deretter, mens bildene er åpne i Fiji, gå til Image og velg Egenskaper .... Skriv inn 0,489 μm for pikselbredde og pikselhøyde, og 0,890 μm for Voxel-dybden. Merk av for Global for å bruke kalibreringen universelt hvis gjentatt måling av YZ-bilder forventes (se tilleggsfil 6).
MERK: Forsikre deg om at alle YZ-bilder er tatt med de samme skanneparametrene; start Fiji/ImageJ på nytt eller endre kalibreringsverdiene hvis et nytt sett med kalibrering er nødvendig. - Hvis du vil måle CSA for de kalibrerte YZ-bildene , velger du markeringsverktøyet for mangekant fra ikonene. Tegn rundt omkretsen av somitten, og trykk på M for å vise måleverdiene (Areal = 11980,395 μm2; se tilleggsfil 7). Volum av myotomet kan beregnes som Volum = Myotome lengde x CSA, dvs. 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
- Gjenta målingene på de andre XY- og YZ-bildene. Det anbefales å bruke samme programvare for alle målinger i en eksperimentell serie for konsistens. Volumestimatet fra hver programvare er likt, men ikke identisk på grunn av de forskjellige tegneverktøyene, dvs. ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 og Fiji / ImageJ = 1,079 × 106 μm3. Vekst av myotomet mellom to tidspunkter (dvs. 3 til 4 dpf) kan beregnes som: (Volum 4 dpf - Volum 3 dpf) / Volum 3 dpf × 100%.
MERK: På feil og dens korreksjon. Under montering bør fisken orienteres med sitt sagittalplan (dvs. anteroposterior og dorsoventralaksene) så nært som mulig horisontalt, for å unngå henholdsvis yaw og roll. Dette skyldes at både myotomlengden L målt fra XY-skanningen og CSA målt fra en YZ-skanning vil bli overestimert hvis fisken viser yaw (rotasjon rundt dorsoventralaksen) på grunn av skrå anteroposterior montering. Verken stigning eller rulling under montering skal påvirke målingene etter skanning som beskrevet i avsnitt 3. Likevel forringer dorsoventral rotasjon (roll) bildekvaliteten. Enkel trigonometri viser at opptil 10° yaw vil gi 3% feil i volummåling, målt L og CSA hver økning i forhold til (cosq)-1, hvor q er vinkelen vekk fra anteroposterior horisontal (yaw). 15° og 20° rabatt vil gi henholdsvis 7% og 13% overestimater av volum.
Siden notokordet er sylindrisk, kan inkludering av hele notokordet i YZ-skanningen brukes til å beregne vinkelen og omfanget av obliquity fra orienteringen og størrelsen på de store og mindre aksene og derved korrigere den målte L og CSA for å maksimere nøyaktigheten. Korrigert CSA = Målt CSA x Notochord minor axis/Notochord major axis. Korrigert L = Målt L x Notochord minor axis/Notochord-aksen i mikroskop Z-retning .
En ytterligere vurdering tillater ytterligere korreksjon av L. Etter hvert som myotomet vokser, forskyves det i koronalplanet (normalt til dorsoventralaksen) slik at medial myotom er litt fremre for lateral myotom. Sett fra dorsal danner den vertikale myosepta på venstre og høyre side en bred chevron som peker fremre. Hvis yaw er lav, påvirker denne morfologien ikke måling av L. Men hvis yaw er signifikant, blir trigonometrisk korreksjon utfordrende, og en bedre tilnærming er å måle True L direkte ved å estimere XYZ-koordinatene til de to punktene der den fremre og bakre vertikale myosepta møter notokordet ved det horisontale myoseptumet. Enkel trigonometri tillater beregning av True L fra disse koordinatene som L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Svakheter ved denne siste tilnærmingen er at a) valg av poeng kan variere med operatør og b) ingen visuell oversikt over de valgte punktene beholdes. Dette hensynet påvirker ikke CSA-korreksjonen.
5. Valgfri metode: Fjern og gjeninnfør muskel elektrisk aktivitet
- Lag et stimuleringskammer.
- Ta en 6 x 35 mm brønnplate, lag to små åpninger (<5 mm i diameter, 1 cm fra hverandre) på hver side av hver brønn (se figur 1) ved hjelp av et smalt loddejern.
NOTAT: Håndter det varme loddejernet med forsiktighet og arbeid i en avtrekkshette hvis ønskelig for å unngå å inhalere damp. - Tre et par sølv- eller platinatråder (~20 cm lange) gjennom åpningene til hver brønn (se figur 1). Gjenbrukbart limmateriale (f.eks. BluTack) kan påføres nær åpningene for å holde ledningene på plass, og sikre en 1 cm separasjon mellom ledningene (se figur 1).
- Ta en 6 x 35 mm brønnplate, lag to små åpninger (<5 mm i diameter, 1 cm fra hverandre) på hver side av hver brønn (se figur 1) ved hjelp av et smalt loddejern.
- Ved 3 dpf deles fisken inn i tre forhold: fiskemedium Control, Inactive og Inactive+Stim.
- For inaktive og inaktive + Stim-grupper, bedøve larver 72 timer etter befruktning (hpf) med Tricaine (0,6 mM).
MERK: Etter referanse38 tines og fortynnes frosne aliquots av trikainbestand (40 μL / ml fiskemedium, til en endelig konsentrasjon på 0,6 mM) før tilsetning til fisk. Ikke tilsett tricaine rett i vannet som inneholder fisk, da noen fisk kan få høye doser. Trikainbestand bør brukes innen en måned og aldri fryses på nytt. - For fiskemediet Kontroller fisk, la dem være ubedøvet.
- For inaktive og inaktive + Stim-grupper, bedøve larver 72 timer etter befruktning (hpf) med Tricaine (0,6 mM).
- Ved valgt(e) tidspunkt(er) etter utbruddet av trikaineksponering (dvs. ved 80 hkf), klargjør Inactive+Stim-gruppen for stimulering.
- Forbered 60 ml 2% agarose (1,2 g agarosepulver i 60 ml fiskemedium), og smelt helt ved hjelp av mikrobølgeovn, avkjøl, tilsett trikain og hell 4 ml i hver brønn i stimuleringskammeret (figur 1).
- Tilsett umiddelbart skreddersydde 4-brønns kammer mellom elektrodene (laget ved å kutte ut plast (f.eks. Polypropylen) med ønskede dimensjoner og stikke sammen ved hjelp av Superglue; se figur 1). La 10 minutter for gel å sette. Fjern kammene forsiktig for å lage fire rektangulære brønner.
- Fyll hver brønn med trikainvann og legg en enkelt bedøvet Inactive + Stim larve i hver brønn ved hjelp av en mikropipette, med deres anteroposterior akse vinkelrett på elektrodene (se figur 1).
- Sjekk under dissekering fluorescerende mikroskop om hver fisk er fullt bedøvet i hver brønn i kammeret.
- Koble en justerbar elektrofysiologisk mønstergenererende stimulator til kammeret via en polaritetsregulator ved hjelp av krokodilleklemmer koblet til hver av elektrodene på den ene siden av kammeret (se figur 1).
MERK: Polaritetsregulatoren brukes til å reversere polariteten hver 5. s, for å forhindre elektrolyse og korrosjon av elektrodene. - Stimulere fisk. For eksempel, 1s med et tog på 200, 20 V pulser, med 0,5 ms pulsvarighet og 4,5 ms pulsseparasjon, en gang hver 5 s gir et effektivt gjentatt tetanisk kontraksjonsmotstandsregime.
- Kontroller regelmessig under mikroskopet for å bekrefte at fisken blir stimulert; Eksemplet elektrisk stimulans bør indusere en synlig bilateral sammentrekning og liten bevegelse, en gang hver 5.
- For et motstands- / høykraftregime, stimuler fisken med høy frekvens i et anfall på 5 min, tre ganger, med hver kamp atskilt med 5 minutters hvile.
MERK: Mens fisk på den ene siden av kammeret hviler, kan krokodilleklemmene kobles til elektrodeparet på den andre siden av kammeret, og de ekstra fiskene stimuleres. - Etter stimulering, fjern forsiktig fisk fra hver brønn ved å skylle dem forsiktig ut med en plastpipette og gå tilbake til inkubatoren i fersk trikaineholdig fiskemedium.
- Hell bort trikainvannet fra kammeret og bruk tang til å kutte rundt og fjerne agarose fra hver brønn. Skyll brønnene med vann fra springen og la det tørke.
MERK: Hvis du bruker sølvtrådelektroder, kan det av og til samle seg sølvoksid på overflaten av ledningen etter et stimuleringseksperiment. Siden sølvoksid er mindre ledende enn sølv, må du forsiktig gni sølvoksid av ledningen ved hjelp av Kimwipes for å opprettholde reproduserbarheten før du bruker oppsettet på nytt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et raskt og presist mål på smittvolum
En metode for prøvepreparering, datainnsamling og volumetrisk analyse som muliggjør rask måling av muskelvekst i sebrafisklarver er beskrevet. Muskelstørrelse kan måles hos levende dyr ved hjelp av fisk merket på plasmamembranene med en membranmålrettet GFP (β-aktin: HRAS-EGFP) eller mCherry (α-aktin: mCherry-CAAX). Larvene ble forbigående bedøvet ved hjelp av trikain, montert i lavsmeltepunktagarose og avbildet ved hjelp av konfokal fluorescensmikroskopi. Somite 17 ble valgt for analyse av muskelstørrelse gitt tilgjengeligheten ved trunk-tail-grensesnittet31. I praksis, som i teorien, kan myotomvolum beregnes som produktet av myotomlengde (L) og gjennomsnittet av tre tverrsnittsarealmål (CSA) (figur 2A, som kalles 4-skivemetoden).
For å validere denne metoden ble hele myotome konfokale Z-stabler av levende sebrafisklarver (figur 2B) oppnådd, og somittvolum ble beregnet ved å multiplisere summen av somite 17 profilområder i hver skive (80-100 skiver) med mellomskiveavstanden (1-1,2 μm). Det ble observert en sterk korrelasjon mellom beregningsmetodene 4-skive og full stack (figur 2C). Imidlertid ga 4-skivemetoden generelt et litt større volumestimat (~ 2% større i gjennomsnitt) (figur 2D). Denne forskjellen kan skyldes enten a) obliquity av prøvene som gir feilaktig stor volummåling eller b) observasjonen at sebrafisk myotomer taper langs anteroposterior aksen, blir mindre mot halen av dyret. Ettersom YZa-, YZm- og YZp CSA-målingene er mot den fremre delen av somite 17 myotome chevron (figur 2A), ble sistnevnte tolkning testet ved volumetrisk analyse av myotomene til somitter 16 og 18. Hver somitt var omtrent 7% større enn den bak (figur 2E). Videre analyse viste at en 2-skivemetode som bare krever en enkelt YZ-måling, plassert i midten av somitten der de epaksiale og hypaksiale halvdelene møtes ved det horisontale myoseptum (YZm), og XY-skiven, gir et rimelig nøyaktig estimat av myotomvolum (figur 2F, G). 2-skivetilnærmingen muliggjør raskere datainnsamling når tidsbegrensninger begrenser antall fisk som kan skannes. Oppsummert viser disse dataene at myotomvolumet kan måles raskt og nøyaktig i levende sebrafisklarver. Enkeltlarver ble vellykket, gjentatte ganger, målt over en 6-dagers periode med denne metoden.
For komparativ studie av vekst av en identifisert vevsenhet gir den beskrevne metoden pålitelige og presise volumestimater. For å oppnå nøyaktige absolutte volumer kan imidlertid en rekke modifikasjoner brukes. For det første kan korreksjon gjøres for feil forårsaket av skrå montering enten ved å vippe parabolen eller mikroskopstadiet for å oppnå bedre tverrgående YZ- og parasagittal XY-skiver under avbildning eller ved bruk av notokordprofilen i YZ-skiver; tverrsnitts mindre akse avslører den sanne diameteren til det sylindriske notokordet, mens hovedaksen avslører vinkelen og størrelsen på obliquity (se merknad i punkt 4.6 ovenfor). For det andre må plasseringen av XY- og YZ-seksjonering under skanning velges for å gjenspeile, nøyaktig, ønsket myotom (er). (Se merknad i punkt 4.6 ovenfor). Vær imidlertid oppmerksom på at formen på myotome chevrons endres avhengig av utviklingsstadiet, og dette må tas i betraktning ved valg av YZ-skanninger. Til slutt, for å avgjøre om endringer i myotome 17 reflekterer muskelvekst gjennom hele aksen, kan myotomer lenger inn i stammen eller haleområdene måles ved den beskrevne metoden.
Gjentatte målinger avslører somittvekst
En fordel med den beskrevne metoden er den enkle gjentatte analysen på enkeltfisk. Individuelle embryoer og larver kan gjentatte ganger legges inn, måles og frigjøres uten å lide åpenbare langsiktige effekter (figur 2H). Myotomet vokser påviselig både i L og CSA mellom 2 og 5 dpf, noe som fører til jevn økning i volum (figur 2H). Veksten ble avbildet på denne måten mellom 1 og 8 dpf, og larver ble også frigjort etter avbildning og vokst til voksen alder. Analyser videre inn i den sene larveperioden forventes å være mulige, selv om effekter av gjentatt avbildning på fôringsatferd må overvåkes nøye ved sammenligning med søsken som ikke er avbildet. Det er viktig at utviklingen av pigmentering kan skjule bildebehandling. Mens pigmentering ikke er et problem i riktig orientert fisk, da melanoforstripene ikke forhindrer de nødvendige målingene, kan pigment være mer problematisk i skråmonterte prøver. Bruken av pigmenteringsmutantlinjer, som roy;mitfa39, forventes, noe som vil forlenge tidsvinduet for vekstmålinger til grensene for praktisk mulig konfokal skannedybde er nådd.
En annen fordel ved den beskrevne prosedyren er den enkle detaljerte analysen av vekst av enkeltfibre i sammenligning med hele myotomen over korte perioder. Ved mosaikkmerking av fibre gjennom DNA-injeksjon ble det utviklet en metode for å oppdage kjernefysisk oppkjøp og vekst i individuelle identifiserte fibre over 4 timer, og deretter tillate reanalyse på senere tidspunkter (figur 2I). Videre kan veksten av hele myotomet måles over 12 timer eller mindre26 (og data ikke vist). Ved å måle den samme fisken gjentatte ganger, elimineres interindividuell variabilitet og et lite antall dyr kan gi statistisk robuste resultater26.
Manipulasjoner som endrer somitvolumet kan lett oppdages
Den nåværende protokollen tillater en å forhøre endringer i muskelvekst under ulike biologiske og fysiologiske forhold, for eksempel endret fysisk inaktivitet. Bedøvelse tricaine, som blokkerer nervevirkningspotensialer ved å hemme spenningsstyrte Na + -kanaler40, ble brukt til å indusere muskelinaktivitet i β-actin: HRAS-EGFP larver. Som vist tidligere26, reduserte inaktivitet i 24 timer mellom tredje og fjerde dpf sterkt myotomvolum, noe som indikerer at larvemuskelvekst er aktivitetsavhengig (figur 3A). Effekten av inaktivitet kan også undersøkes ved hjelp av andre deteksjonsmetoder som avslører somittens struktur, for eksempel mCherry-CAAX (enten i en transgen linje eller ved mRNA-injeksjon) eller ved nedsenking av larver over natten i BODIPY-fargestoff (figur 3A). Sistnevnte tilnærming, mens du fjerner behovet for å krysse fisk på transgene bakgrunner eller injisere embryoer, kan ikke brukes til gjentatte målinger på grunn av toksisitet av BODIPY. Dermed tillater den nåværende metoden en reproduserbar å måle endringer i volumet av muskelvev.
Som beskrevet ovenfor kan genetiske markeringsmetoder brukes til å gjøre gjentatte målinger av myotomvolum, noe som gjør det mulig å spore endring i muskelstørrelse over påfølgende dager hos enkeltfisk. Siden enkeltfisk og hele legginger på samme utviklingsstadium varierer i absolutt myotomvolum (figur 3A, kanskje på grunn av eggets størrelse eller helse), reduserer evnen til å måle vekst for hvert individ effekten av individuell variasjon ved å tillate parvise statistiske analyser. Gjentatt måling av samme fisk reduserer antall fisk som trengs for å oppdage effekter robust. For å illustrere denne effekten ble resultater fra analyse av veksten til hvert individ fra 3 til 4 dpf i populasjoner av aktive og inaktive larver sammenlignet med analyse av de samme to populasjonene ved bruk av bare det eneste målet for myotomstørrelse laget ved 4 dpf. Fra lå til lå ble det observert større variasjon i tilsynelatende reduksjon av myotomstørrelse ved måling av myotomvolum ved 4 dpf kun sammenlignet med måling av 4/3 dpf volum for hvert individ (figur 3B). Legg merke til det større reduksjonsområdet (68% -91%) i 4 dpf-målingene, sammenlignet med 4/3 dpf-metoden (78% -89%) og den svake korrelasjonen mellom de to tiltakene. Selv om gjennomsnittlig reduksjon på tvers av alle 13 biologiske replikasjoner som forventet var lik i hver vurdering (figur 3C) var 82,62 ± 1,01 % (gjennomsnittlig ± SEM, n = 13) for 4/3 dpf-metoden og 82,31 ± 1,92 % for metoden med bare 4 dpf, var den estimerte feilen med metoden med bare 4 dpf nesten dobbelt så stor som med 4/3 dpf-metoden. Dermed er kvantifisering av individuell vekst gjennom gjentatt måling den mer nøyaktige metoden, ved å eliminere størrelsesvariabilitet mellom fisk innenfor samme legg, som vist tidligere26. Likevel, da det ikke ble observert noen signifikant forskjell i reduksjonen i myotomvolum forårsaket av inaktivitet ved måling av myotomvolum bare ved 4 dpf (figur 3C), antyder dataene at ~ 6-8 fisk er tilstrekkelig til å gjennomsnittlig ut interindividuell størrelsesforskjell innen en lå. Det er klart at når størrelsesendringene er små, foretrekkes 4/3 dpf-metoden.
Analyse av det cellulære grunnlaget for vekst
Myotome CSA bestemmes av muskelfibernummer og fiberstørrelse. Fibertall kan estimeres ved å telle antall raske og langsomme fibre på tre YZ-seksjoner (YZ a, YZ m, YZ p). Selv om regioner med to tilstøtende myotomer er inneholdt i slike YZ-seksjoner, som vist ved tilstedeværelsen av vertikal myosepta (VM) i de fleste seksjoner (figur 2A), reflekterer disse tellingene nøyaktig fibernummer. Overtelling skjer ved VM-er på grunn av nedtrapping av fiberpar fra hvert tilstøtende segment ved VM (figur 4A). Slik overtelling kan forklares ved å bruke følgende ligning: Fibernummer = Totalt fiberantall - (fibre i kontakt med VM) / 2 referanse33. Videre kan gjennomsnittlig fibervolum bestemmes ved å dele myotomvolum med antall fibre. Vi har brukt disse analysene til å avdekke at aktivitet styrer begge de cellulære aspektene ved vekst (figur 4B,C).
Det fremgår av figur 2A at fibrene varierer i størrelse over myotomet, en realitet som ikke gjenspeiles i beregnede gjennomsnittlige fibervolummålinger. Ved å tegne rundt hver fiber av somitt 17 fra to fisk, ble målt fibertverrsnittsareal vist å variere fra 28 μm 2 til 217 μm2 (figur 4D). I virkeligheten er imidlertid mange fibre vinklet skrått i myotomet, slik at slike CSA-tiltak ikke gjenspeiler den sanne CSA av en fiber vinkelrett på sin lange akse. Omvendt, på grunn av de varierende vinklene av fibre i myotomet, har alle fibre som kjører i retninger som ikke er justert anteroposteriorly, lengder som avviger fra myotomlengden. Til tross for disse forbeholdene, som bare kan omgås enten ved fullstendig segmentering av myotomet i enkeltfibervolumer eller ved beregning etter måling av vinkelen for obliquity av hver fiber, gir de målte CSA-ene et estimat av fiberstørrelsesdiversitet i hver fisk. For eksempel ble individuelle fibre redusert i CSA med inaktivitet, noe som resulterte i et skifte til venstre i den kumulative frekvenskurven med hensyn til aktive (ikke-bedøvede) kontrolllarver (figur 4E). Siden inaktiv fisk har ~ 10 færre fibre enn aktiv fisk (figur 4B), ble enten de 10 minste fibrene fra aktiv ubedøvet fisk (forutsatt at de er de nye) eller de 10 største (som den alternative ekstreme) utelatt fra sammenligningen, som viste at det meste av tapet av myotomvolumet skyldes mangel på fibervekst, snarere enn svikt i ny fiberdannelse (figur 4F). Samlet sett viser disse dataene at den beskrevne metoden tillater detaljert undersøkelse av rollen som fysisk aktivitet på dannelse og vekst av muskelvev.
Reimposition av aktivitet ved elektrisk stimulering
Fysisk aktivitet er nødvendig for muskelvekst (figur 3A). En metode for å re-pålegge muskelkontraksjoner ved elektrisk stimulering i ellers inaktive larver, som fremkaller en sterk kontraktil respons, er beskrevet (figur 5A, tilleggsfil 8). Selv om presise stimuleringsparametere er beskrevet her (figur 5B) for å maksimalt aktivere muskulaturen, kan protokollen endres (ved å endre strømamplitude, frekvens, pulsvarighet, etc.) for å kontrollere muskelaktivering og treningsdosering. Dermed gir den nåværende metoden en kontrollert aktivitetsstimulus med standardisert oppførsel mellom aktivitetskamper, og overvinner en viktig begrensning av dagens dyremodeller av øvelse18.
De beskrevne metodene demonstrerer potensialet for å bruke sebrafisklarver for å studere ulike aspekter av muskelvekst (f.eks. Hyperplasi og hypertrofi). Spesielt er myogenese hos sebrafisklarver vist å være egnet til analyse gjennom farmakologisk inaktivitet og elektrisk indusert kontraktilitet. Tilnærmingen tillater studiet av de molekylære mekanismene som fysisk aktivitet fører til muskelvekst in vivo.
Figur 1: Design av et stimuleringskammer for gjeninnføring av muskelelektrisk aktivitet til sebrafisklarver. En 6-brønns cellekulturplate utstyrt med elektroder tillater vedlikehold av larver i brønner laget innen 2% agarosegel. Tilpassede 4-brønns kammer er laget for å lage rektangelbrønner (dimensjoner som angitt) i agarose for å opprettholde posisjon og orientering av individuelle fiskelarver, og for å forhindre at de kommer i kontakt med sølvtrådene under kraftig rykninger ved elektrisk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Måling av muskelvolum i levende sebrafisk α-aktin:mCherry-CAAX (A,B,E) eller β-aktin:HRAS-EGFP transgene larver (H,I). Larver avbildet fra lateral visning og vist dorsal til topp, fremre til venstre i øvre paneler (A, B, E). (A) I 4-skivemetoden ble myotomvolumet beregnet ved å multiplisere lengden på somitt 17 (L) målt mellom vertikal myosepta (VM) på et XY-plan (blå pil) med gjennomsnittet av tre tverrsnittsareal (CSA) målt på YZ-plan (YZm, YZa og YZp; stiplede gule linjer). (B) I Full Stack-metoden ble arealet av somite 17 myotome målt (eksempler skissert i gult) i hver skive av en hel Z-stack av en levende sebrafisklarve og summen av myotomale områder ble multiplisert med mellomskiveavstanden. (C) Høy samsvar mellom 4-skive- og Full Stack-metodene. Farger betegner individuell β-aktin:HRAS-EGFP (firkanter) eller α-aktin:mCherry-CAAX (sirkler)-fisk. (D) Myotomvolumet er litt, men betydelig, større når det beregnes ved hjelp av 4-skivemetoden. (E) I de avsmalnende sebrafisklarvene er flere fremre somitter større enn bakre somitter, målt ved 4-skivemetoden. (F,G) Sterk korrelasjon mellom volummålinger gjort ved hjelp av gjennomsnittet av tre CSA-seksjoner (4-skivemetode) eller en enkelt YZm CSA (2-skivemetode). p-verdier viser resultater fra to tailed t-tester med lik varians (D,G) eller enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-tester (E). ns, ikke signifikant. (H) Måling av myotom 16 volum, lengde (L) og tverrsnittsareal (CSA) fra 2 til 5 dpf i tre individuelle fisk (farger) som uttrykker β-aktin: HRAS-EGFP og myog: H2B-mRFP. YZm-bilder av den grønne personen ved hvert tidspunkt er vist ovenfor. (I) Enkeltfibervekst målt ved automatisert konstantterskelsegmentering. En β-aktin: HRAS-EGFP; myog: H2B-mRFP fisk mosaikkisk merket ved injeksjon av en CMV: Cerulean plasmid på 1-2 celletrinn. En enkelt Cerulean-merket fiber i somite 10 ble skannet med høyoppløselige fulle XYZ-stabler gjentatte ganger på en Zeiss LSM880. Bildene som vises er representative enkeltstykker (til venstre) og projeksjonen av det tredimensjonale segmenterte volumet (høyre). Hvert datapunkt på grafen representerer en enkelt skanning av samme fiber, ved 3 dpf (0 t), etter 4 timer og ved 5 dpf (54 timer). Tredoble skanninger ble gjort og segmentert per tidspunkt for å vise reproduserbarhet. Hvite pilspisser peker på fiberkjerner; Merk at to kjerner tilsettes mellom 3 og 5 dpf. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Aktivitetsavhengig muskelvekst i somitt 17. (A) Hemming av aktivitet i 24 timer ved bruk av trikaine (rosa) mellom 3 og 4 dpf reduserer myotomvolumet både i transgene linjer og hos ikke-transgene fisk farget med BODIPY sammenlignet med kjøretøykontroller på søsken (blå). Volum kvantifisert ved 4-skive metode. Symbolform indikerer replikere eksperimenter fra forskjellige legger (biologiske replikasjoner). Store symboler angir ± SEM-verdier. Små svake symboler viser volumet av individuelle replikasjonslarver. (B) Sammenligning av myotomvolumreduksjon hos inaktiv fisk sammenlignet med kontrollsøsken bestemt ved enkeltmåling av myotomvolum ved 4 dpf (kun 4 dpf, øvre skjematisk) eller endring i myotomvolum mellom 3 og 4 dpf (4/3 dpf, lavere skjematisk). Hvert symbol representerer gjennomsnittlig volum av myotome 17 i ~ 5 inaktiv fisk fra en enkelt lå delt på gjennomsnittlig myotome 17 volum på ~ 5 aktive kontrollsøsken. (C) Ingen forskjell ble observert i gjennomsnittlig reduksjon i muskelvekst hos inaktiv fisk ved måling med 4 dpf eller 4/3 dpf-metodene. Tall innenfor stolpene representerer totalt antall analyserte fisk. p-verdier viser resultater av toveis ANOVA med Bonferroni post hoc-tester (A) eller tosidig t-test med ulik varians (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Endringer i muskelvekst på cellenivå forårsaket av inaktivitet. (A) Skjematisk som viser hvordan overtelling skjer ved VM-er på grunn av dobbelttelling av avsmalnende fibre der de blå og røde myotomene møtes. Merk at gjennomsnittlig fibertall er 6, men den sanne middelverdien er 5,5. Den korrigerte tellingen gir en bedre tilnærming. (B,C) Fibertall (B) og gjennomsnittlig fibervolum (C) reduseres hos inaktive (rosa) sammenlignet med aktive (bue) larver. Symbolform indikerer replikere eksperimenter fra forskjellige legger (biologiske replikasjoner). Store symboler angir ± SEM-verdier. Mindre svake symboler viser verdien av individuelle replikasjonslarver. Tall innenfor stolpene representerer totalt antall analyserte fisk. (D) I enkeltlarver ble hver fiberprofil i myotome 17 skissert og CSA bestemt. Bokser viser gjennomsnitt ± SEM. p-verdier viser resultater av toveis ANOVA med Bonferroni post hoc-tester (B,C) eller tosidig t-test med lik varians (D). (E,F) Kumulative frekvenskurver som viser fiberstørrelsesfordeling i aktive kontrolllarver (blå) og inaktive (rosa). Sammenligning av alle fibre (E), eller etter utelatelse av antatt små eller, i den alternative ytterligheten, store fibre (F) viser at fiberstørrelsesøkning, ikke økning i fiberantall, primært står for aktivitetsdrevet vekst av myotomet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kort elektrisk stimulering fremkaller tetaniske muskelkontraksjoner i bedøvede sebrafisklarver . (A) Sekvensielle bilder (tatt fra video i tilleggsfil 8) som viser hvordan elektrisk stimulering utløser maksimale sammentrekninger av en bedøvet larve ved 3 dpf. Tidsskala i sekunder. Røde bokser indikerer bevegelser ved starten av tre påfølgende 1 s stimuleringstog. Hvert bilde er en eksponering på 40 ms. (B) Skjematisk som viser det elektriske stimuleringsregimet, der et 1 s tog med 200 høyfrekvente, 20 V elektriske impulser gis hver 5.
Tilleggsfil 1: Skjemaer av tatt bilder av perfekt (øverst til venstre) og ufullkommen montert larver med hensyn til mikroskopet XYZ referanseramme (svarte akser). Myotome (grønn), notokord (gul), nevralrør (brunfarge), målte myotomale parametere (rød), målte notokordparametere (svarte piler) og mulige eller faktiske fiskerotasjoner (blå). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Skjermbilde som viser somitelengdemåling fra XY-bilder i ZEN. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Skjermbilde som viser CSA-måling fra YZ-bilder i ZEN. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Skjermbilde som viser somitelengdemåling fra XY-bilder i Fiji/ImageJ. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil: Skjermbilde som viser ekstraksjon av kalibreringsparametere for YZ-bilder fra ZEN. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Skjermbilde som viser kalibrering av YZ-bilder i Fiji/ImageJ. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 7: Skjermbilde som viser CSA-måling fra YZ-bilder i Fiji/ImageJ. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 8: Representativ video som viser muskelkontraksjon fremkalt ved direkte elektrisk stimulering (lengde 1 s) av en trikainbedøvet 3 dpf larve. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporterer vi en metode for nøyaktig og effektiv estimering av muskelvolumet til levende sebrafisklarver i stadier eller i genetiske varianter der pigmentering ikke er et stort hinder for avbildning og når forbigående anestesi og/eller immobilisering tolereres godt. Mens vi har brukt laserskanning konfokal mikroskopi, er de beskrevne tilnærmingene anvendelige for spinnende diskkonfokal eller lysarkmikroskopi og til enhver annen metode som skaper stabler med bilder på forskjellige fokalplan. En rekke stadig mer sofistikerte tilnærminger til vevsstørrelse og estimering av celleinnhold er beskrevet. Hver metode har fordeler og begrensninger, som vi viser kan kvantifiseres. En stor begrensning i å studere vevsvekst er vanskeligheten med å analysere vekstendringer i sanntid ettersom vekstratene endres som svar på en rekke molekylære eller subcellulære hendelser katalysert av akutt administrerte stimuli. Videre kan individuell variasjon skape problemer når separate individer sammenlignes. Den nåværende tilnærmingen tillater måling av vevsvekst over perioder på mindre enn en dag hos enkeltlevende individer. Anvendelse av tilnærmingen kan tenkes på minuttskalaen.
De beskrevne metodene tillater analyser som hittil var upraktiske. Ved hjelp av 4-skivemetoden kan bildedelen av muskelvekstanalysen fullføres på en prøvestørrelse på rundt 20 fisk innen en time av en utdannet operatør. Dette står i sterk kontrast til den konvensjonelle Full Stack-metoden, som tar minst 3 timer for samme antall fisk (dvs. tre ganger lenger). Hvis det kreves bilder med høy oppløsning for påfølgende subcellulære analyser, kan Full Stack-metoden lett kreve 30 minutter per fisk, noe som gjør vekstanalyser av kohorter av dyr på et lignende utviklingsstadium umulig. I motsetning til dette tillater 2- eller 4-skivemetodene rask bildeopptak av høy kvalitet. Når det gjelder vurdering av bildeanalyse, er fordelene med 2- eller 4-skivemetoden for å spare operatørtid (i fravær av automatisert bildesegmentering) fremfor Full Stack-metoden enorme. Hver fisk krever ca 20 min for Full Stack analyse, men bare 3-4 min for 4-skive analyse. Operatørens tid kan bevares ytterligere ved hjelp av den nesten like nøyaktige 2-skivemetoden. Dermed er den beskrevne metoden effektiv og øker dermed fleksibiliteten i eksperimentell design.
Den største begrensningen av 4- eller 2-skivemetodene er at begge metodene er estimater, på grunn av den overlappende chevronformen til somitter (f.eks. volumet av regioner av to nærliggende somitter (f.eks. Myotome 16 og 17). Det er vist at dette kan overestimere det faktiske myotome 17-volumet med rundt 2%, avhengig av nøyaktig hvor YZ-skiver ble valgt. Videre kan manuell sporing av somittgrensene under målinger bidra til variasjoner i estimater, selv om det ble funnet liten intereksperimentell forskjell (data ikke vist). Målefeil kan løses ved hjelp av terskel-, filtrerings- og segmenteringsalgoritmer for å skaffe overflateareal på en mer objektiv og reproduserbar måte. Imidlertid vil tilpasninger fortsatt være nødvendig for å ta hensyn til variasjoner i bakgrunnsfluorescensen (for eksempel på grunn av innebygging og / eller tykkelse av LMA) og ekspresjonsnivået av fluorescensproteiner av individuelle larver over tid. Vær oppmerksom på at slike automatiserte målinger vil være enda mer utfordrende hvis en ikke-muskelspesifikk reporter brukes, for eksempel β-actin:HRAS-EGFP-linjen . Likevel, under mange omstendigheter, for eksempel når man sammenligner effekter av manipulasjoner mellom fisk utsatt for ulike behandlinger som forventes å påvirke alt muskelvev, kan unøyaktigheten være uvesentlig. Men hvis maksimal nøyaktighet er nødvendig for sammenligning med fiber- eller kjernefysiske tall som bare telles fra myotome 17, for eksempel, kan "skive" -metodene forbedres. Dette kan oppnås enten ved å bruke den vanskelige Full Stack-metoden, ved matematisk korreksjon ved å multiplisere de målte 4-skivevolumene med 0,98, eller ved å flytte plasseringen av YZ CSA-skanningene bakre for å reflektere mer nøyaktig den sanne CSA av myotome 17.
En annen begrensning av metoden er dens følsomhet overfor fiskens monteringsretning. I praksis kan dyktige aktører orientere fisken innenfor rimelighetens grenser mesteparten av tiden, også når man jobber raskt med å legge inn mange prøver. Modifikasjoner på utstyr på mikroskopstadiet kan tenkes som vil tillate korreksjon av yaw og rulle før skanning. Uten et slikt apparat beskrives en metode for å kvantifisere feilorientering som deretter kan brukes til å korrigere de målte volumene. Videre, selv om feilorientering øker variabiliteten i målt volum, og dermed reduserer sjansen for å observere små effektstørrelser, vil slik variasjon i mange situasjoner påvirke kontroll- og eksperimentelle prøver på samme måte. Så falske positive resultater er usannsynlige, hvis operatørene er klar over problemet.
De beskrevne metodene har i utgangspunktet blitt brukt til å analysere rollen som elektrisk aktivitet i muskelvekst, et emne med en lang historie med analyse i et bredt spekter av arter (gjennomgått i18). Til dette formål beskrives enkle metoder for å blokkere endogent utløst aktivitet i detalj og erstattes med kontrollert mønstret elektrisk stimulering i sebrafisklarven. Fordelene med denne tilnærmingen er fjerning av nevrale tilbakemeldingskontroller40, eliminering av effekten av endret ernæring og evnen til å analysere sirkadiske effekter på selve veksten, i stedet for på vekstproxyer, for eksempel proteinomsetning26. Ettersom forskjellige mønstre av elektrisk aktivitet utløser forskjellige muskelresponser, regulerer fibertype, størrelse og metabolisme 41,42,43,44,45,46,47,48, åpner dagens metoder sebrafisken for slike analyser.
De beskrevne metodene tilbyr en rekke teknikker som mange aspekter av muskelfysiologi, cellebiologi og patologi kan analyseres i enestående tidsmessig og romlig oppløsning ved å dra nytte av den relativt uutforskede sebrafisken. De nåværende tilnærmingene kan tydelig brukes på andre arter, kroppsområder og utviklingsstadier. Den raske tidlige veksten av sebrafisklarver gjør påvisning av akutte effekter av manipulasjoner på vevsvekst og morfogenese spesielt attraktive studieområder. Videre er sebrafiskmuskel vist å dele ulike vekstmekanismer og kontroller med pattedyr. Mens sebrafisk er vertebrater som bevarer mange aspekter av muskelmolekylær genetikk, celle og utviklingsbiologi med mennesker, er det også betydelige forskjeller i kontrollen av muskelvekst. For eksempel er langsomme og raske fibertyper tydeligere romlig segregert i fisk, og innerveringen av muskler viser forskjeller. Videre må det tas i betraktning at vi hittil bare har vært i stand til å analysere de tidlige utviklingsstadiene. Lignende analyser på senere stadier er planlagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne står i dyp gjeld til innsatsen til Hughes lab medlemmer Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin, og Vladimir Snetkov for utvikling av de beskrevne protokoller, og til Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau og Peter Currie for deling plasmids eller sebrafisk linjer. SMH er forsker i Medisinsk forskningsråd (MRC) med programstipend G1001029, MR/N021231/1 og MR/W001381/1support. MA holdt et MRC doktorgradsprogram PhD Studentship fra King's College London. Dette arbeidet dro nytte av trigonometriske innspill fra David M. Robinson, forsker, mentor og venn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
