Summary
A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.
Abstract
Vários métodos podem ser usados para visualizar células individuais em todo o corpo de peixes-zebra embrionários, larvais ou juvenis vivos. Mostramos que peixes vivos com membranas plasmáticas marcadas fluorescentemente podem ser escaneados em um microscópio confocal de varredura a laser, a fim de determinar o volume de tecido muscular e o número de fibras musculares presentes. Abordagens eficientes para a medição do número e tamanho celular em animais vivos ao longo do tempo são descritas e validadas contra métodos de segmentação mais árduos. São descritos métodos que permitem o controle da atividade elétrica muscular e, portanto, contrátil. A perda de atividade contrátil do músculo esquelético reduziu muito o crescimento muscular. Em larvas, é descrito um protocolo que permite a reintrodução da atividade contrátil evocada elétrica padronizada. Os métodos descritos minimizam o efeito da variabilidade interindividual e permitirão a análise do efeito de estímulos elétricos, genéticos, medicamentosos ou ambientais em uma variedade de parâmetros de crescimento celular e fisiológico no contexto do organismo vivo. O acompanhamento a longo prazo dos efeitos medidos de uma intervenção definida no início da vida em indivíduos pode ser subsequentemente realizado.
Introduction
O crescimento regulado do tecido, compreendendo o aumento do número de células (hiperplasia) e/ou do tamanho celular (hipertrofia), é um fator crucial no desenvolvimento, regeneração e adaptação ecológica e evolutiva. Apesar dos enormes avanços na compreensão genética molecular da biologia celular e do desenvolvimento nas últimas décadas, a compreensão mecanicista da regulação do tamanho dos tecidos e órgãos ainda está em sua infância. Uma das razões para essa lacuna no conhecimento é a dificuldade de quantificar o crescimento tecidual em organismos vivos com a necessária precisão espacial e temporal.
Vários aspectos do crescimento de organismos inteiros podem ser medidos repetidamente ao longo do tempo, revelando curvas de crescimento para cada indivíduo 1,2,3,4,5. Métodos de varredura cada vez mais sofisticados, como a absorciometria dupla de raios X (DXA), a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), permitem o rastreamento do crescimento de órgãos inteiros e outras regiões do corpo (por exemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) em indivíduos isolados, humanos e em organismos modelo 6,7,8,9,10 . No entanto, esses métodos ainda não têm a resolução de revelar células individuais e, portanto, as ligações entre os comportamentos celulares e o crescimento do nível tecidual têm sido difíceis de discernir. Para fazer tais ligações, os estudos tradicionais muitas vezes se basearam em coortes de animais individuais semelhantes, alguns dos quais são sacrificados em pontos de tempo sucessivos e, em seguida, analisados em detalhes citológicos. Tais abordagens requerem a média das mudanças observadas entre grupos de indivíduos (de preferência semelhantes, mas ainda assim variáveis) e, portanto, sofrem de uma falta de resolução temporal e espacial, tornando difícil encontrar eventos correlacionados no nível celular sugestivos de causa e efeito.
Estudos em organismos modelo de invertebrados, inicialmente em C. elegans e D. melanogaster, contornaram esses problemas desenvolvendo microscopia óptica para alcançar a resolução celular e medir com precisão o crescimento ao longo do tempo em indivíduos individuais. Tais estudos têm revelado comportamentos de linhagem celular surpreendentemente invariantes no crescimento desses pequenos organismos-modelo 11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos animais, incluindo todos os vertebrados, têm linhagens celulares indeterminadas e controlam o crescimento de tecidos por meio de misteriosos processos de feedback que servem para transformar o programa de crescimento geneticamente codificado em um organismo tridimensional funcional com todos os seus tecidos e órgãos constituintes adequadamente combinados em tamanho. Para entender esses processos complexos de crescimento, é desejável visualizar tecidos ou órgãos inteiros ao longo do tempo em indivíduos individuais que possam ser manipulados experimentalmente por intervenções genéticas, farmacológicas ou outras em um momento de escolha e o efeito posteriormente analisado.
Cada músculo esquelético vertebrado tem um tamanho, forma e função definidos, e interações bem caracterizadas com tecidos adjacentes, como osso, tendão e nervos. Alguns músculos são pequenos, ficam logo abaixo da pele e, portanto, são bons candidatos para estudos de imagem de alta resolução. Semelhante à maioria dos órgãos, cada músculo cresce ao longo da vida embrionária, pós-natal e juvenil, antes de atingir um tamanho adulto estável. O músculo, no entanto, também tem uma capacidade única de mudar de tamanho durante a vida adulta, dependendo do uso e da nutrição18, e essa propriedade tem um grande impacto na aptidão do organismo, no desempenho esportivo e na vida independente. A perda de massa muscular e função na velhice, a sarcopenia, é uma questão de crescente preocupação para as sociedades frente ao envelhecimento da população 19,20,21.
Nós e outros temos focado no crescimento de blocos definidos de tecido muscular esquelético no corpo segmentarmente repetitivo de larvas de peixe-zebra, como um sistema aparentemente fechado contendo várias centenas de células nas quais o crescimento, manutenção e reparo tecidual podem ser observados e manipulados 22,23,24,25,26. Embora alguns trabalhos quantitativos tenham sido relatados anteriormente 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nenhum método detalhado e validado de medir o crescimento muscular em detalhes celulares em organismos vertebrados individuais ao longo do tempo está disponível. Aqui um protocolo eficiente de como realizar tais medições repetidas é descrito, juntamente com a validação, e um exemplo de seu uso para analisar mudanças no crescimento hipertrófico e hiperplásico em resposta à atividade elétrica alterada é fornecido.
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Protocol
Todas as pesquisas descritas foram realizadas em conformidade com as diretrizes institucionais e sob licenças adequadas do Ministério do Interior do Reino Unido, de acordo com a Lei Animal (Procedimentos Científicos) de 1986 e modificações subsequentes. Os embriões/larvas devem ser criados a 28,5 °C até à conclusão da gastrulação, mas podem então ser mantidos a 22-31 °C para controlar a taxa de desenvolvimento. Os peixes podem ser escaneados ou estimulados à temperatura ambiente.
1. Anestesiar larvas de peixe-zebra
- Cruzar peixes adultos repórteres fluorescentes adequados, como Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referência36 ou Tg(α-actina:mCherry-CAAX)pc22Tg referência 37 e coletar embriões conforme descrito38.
- No momento da escolha, como 2 dias após a fertilização (dpf), anestesiar embriões brevemente usando meio de peixe contendo tricaína (água de peixe ou meio E3) e rastrear EGFP ou mCherry sob um microscópio de fluorescência, como uma Leica MZ16F. Se alguém tem muitos embriões, selecione aqueles com o sinal mais brilhante. Devolver os embriões ao meio normal dos peixes imediatamente após o rastreio.
2. Peixes de montagem para varredura confocal
- Ligue o sistema de varredura a laser confocal e os lasers, para deixar o sistema se estabilizar por 30-60 min.
NOTA: Aqui, usamos um microscópio Zeiss LSM 5 Exciter com suporte de materiais verticais (o que aumenta a distância de trabalho) equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x/1,0 W. - Preparar 1% de agarose de baixa fusão (LMA) e manter num bloco de calor de 37 °C para utilização repetida num tubo de 1,5 ml. Para evitar o choque térmico, remova a alíquota LMA do bloco de calor e deixe-a esfriar até um pouco acima da configuração antes de aplicar na larva, testando contra a pele para julgar a temperatura apropriada, como ao avaliar a temperatura do leite em pó para bebês.
- Selecione os peixes a serem montados e anestesiar transitoriamente cada peixe por sua vez com Tricaína (0,6 mM em meio de peixe).
- Pegue uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro que tenha sido revestida com uma camada de agarose a 1% e coloque no palco de um microscópio de dissecação.
- Transfira a larva com uma pipeta Pasteur de plástico de 1 mL para a placa de Petri revestida de 60 mm e remova o máximo de meio transferido possível. Em seguida, ainda usando a pipeta Pasteur, coloque de 5 a 10 gotas de LMA no peixe e posicione-se rapidamente horizontalmente em vista lateral com pinça (ou uma agulha de vidro fina polida pelo fogo) antes que o LMA se fixe. Para uma imagem ideal, é desejável posicionar a larva perto da superfície superior do LMA.
- Alternativamente, usando uma pipeta Pasteur de plástico de 1 mL, colete a larva com o mínimo de meio de peixe possível e transfira a larva para a alíquota do LMA resfriado. Permita que a larva afunde por 5 s para ficar totalmente cercada por LMA. Em seguida, recupere a larva e transfira-a em uma gota de LMA para a placa de Petri revestida de agarose. Oriente e posicione rapidamente a larva conforme descrito acima.
- Orientar a larva com os seus eixos anteroposterior e dorsoventral a menos de 10° da horizontal (ver a nota «Sobre o erro e a sua correcção», ponto 4.6 infra).
- Se a larva não estiver corretamente montada horizontalmente perto da superfície da gota de agarose, remova e reincorpore. As larvas podem ser facilmente recuperadas por sucção suave usando uma pipeta Pasteur de plástico microfina de 1 mL, e o LMA pode ser removido suavemente usando Kimwipes. A prática realmente faz a perfeição no procedimento de montagem; passar uma tarde incorporando algumas larvas sem importância antes de tentar isso em um experimento real.
NOTA: No projeto do microscópio: Muitos laboratórios usam microscópios confocais invertidos para imagens através de uma folha de cobertura. Descobrimos que a incorporação repetida e remoção de peixes mantidos em agarose sob uma folha de cobertura para observação em um microscópio invertido leva a uma maior perda de amostras durante a varredura repetida do que no procedimento descrito com um microscópio vertical. Por esta razão, recomenda-se o uso de um sistema vertical, se disponível. No entanto, uma chave para dados de alta qualidade é a seleção adequada e o uso de parâmetros objetivos e de varredura, um assunto muito grande para discussão aqui.
- Se a larva não estiver corretamente montada horizontalmente perto da superfície da gota de agarose, remova e reincorpore. As larvas podem ser facilmente recuperadas por sucção suave usando uma pipeta Pasteur de plástico microfina de 1 mL, e o LMA pode ser removido suavemente usando Kimwipes. A prática realmente faz a perfeição no procedimento de montagem; passar uma tarde incorporando algumas larvas sem importância antes de tentar isso em um experimento real.
3. Varredura confocal
- Quando o LMA estiver definido, inunde o prato com cerca de 10 mL de meio de peixe contendo tricaína. Se estiver planejando capturar pilhas confocais, deixe o peixe montado descansar por pelo menos 10 minutos antes de prosseguir para a varredura, pois ocorre algum inchaço de agarose.
- Carregue o prato de amostra para o estágio do sistema confocal, localize a larva e concentre-se na somita desejada. O somite 17 pode ser escolhido devido à sua facilidade de localização perto do respiradouro anal e facilidade de imagem. Verifique contando somitos de anterior.
NOTA: O primeiro somito é fundido atrás da orelha e não tem borda anterior, mas pode ser facilmente observado como tendo fibras musculares estriadas. - Configure como se quisesse capturar uma pilha Z definindo topo (ou seja, logo acima da pele) e fundo (ou seja, logo abaixo da notocorda, de modo a incluir todo o somite, mesmo que o peixe esteja montado ligeiramente inclinado). Ambos os lados esquerdo e direito podem ser capturados conforme desejado. Isso garantirá que todas as varreduras rápidas do YZ capturem a(s) região(ões) desejada(s).
- Capture uma imagem XY da seguinte maneira. Oriente a área de varredura em relação ao peixe, conforme o software confocal permitir. Posicione o peixe com o eixo anteroposterior paralelo ao eixo X fotografado e o eixo dorsoventral paralelo ao eixo Y com o somite 17 no centro do campo, conforme mostrado no Arquivo Suplementar 1. Concentre-se em um plano de nível médio no miótomo superior no qual todas as metades do somito epaxial e hipaxial juntamente com os mioseptos verticais e horizontais são visíveis e capture uma imagem XY de alta resolução. Lembre-se de nomear e salvar a imagem.
- Capture uma ou mais imagens YZ da seguinte maneira. Nos Resultados Representativos (abaixo) a precisão dos métodos de 2 fatias e 4 fatias é comparada. Na abordagem de 2 fatias, são empregadas varreduras XY e YZ únicas. Na abordagem de 4 fatias, três exames YZ são calculados em média para fornecer uma estimativa mais precisa do volume do miótomo. Se exigido pelo software confocal, reoriente o campo de varredura.
- Desenhar uma linha precisamente dorsal a ventral através do somite escolhido perpendicular ao eixo anteroposterior do peixe em uma posição anteroposterior selecionada. Execute uma varredura de linha Z-stack.
- Repita a varredura da linha YZ três vezes em posições anteroposteriores definidas ao longo do miótomo selecionado para capturar YZa, YZm e YZp. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Nomeie e salve essas imagens junto com a imagem XY relacionada.
NOTA: Na seleção de planos YZ: O miótomo é em forma de V e sua forma muda durante o crescimento. Para obter a avaliação mais precisa do volume do miótomo 17 com o método de 4 fatias, posicione YZa na ponta anterior do miotoma, YZp nas pontas posteriores do miótomo nos extremos dorsal e ventral e YZm a meio caminho entre YZa e YZp. Supondo que o somite se afunile uniformemente, a média das medidas de cada seção YZ representará o miótomo como um todo. Para o método de 2 fatias, a varredura YZ única deve ser posicionada na extremidade posterior do miosepto horizontal, que corresponde aproximadamente ao centro anteroposterior do miótomo de interesse (como YZm). Alternativamente, um conjunto de três seções YZ pode ser tomado na anterior, média e posterior do miosepto horizontal, mas, como mostrado abaixo, tal medida irá superestimar ligeiramente ou subestimar o volume do miótomo (para somitos rostral e caudal, respectivamente, devido ao afunilamento do miótomo). Fundamentalmente, a consistência no posicionamento do(s) plano(s) de fatia YZ entre peixes e experimentos é fundamental para a reprodutibilidade.
4. Análise
- Como o miótomo muda de tamanho ao longo do peixe de forma gradual, trabalhe sempre com o mesmo somite em estudos comparativos.
- Para medir e calcular o volume do miótomo, use o software confocal (como os arquivos .lsm criados usando o software de microscópio Zeiss ZEN) ou o software universal de análise de imagem de código aberto, como Fiji/ImageJ.
NOTA: Se estiver alterando os formatos de arquivo, verifique se o tamanho da etapa Z foi transferido corretamente, pois nem todos os softwares podem ler os formatos de arquivo confocais proprietários corretamente. Por exemplo, para importar uma imagem de varredura de linha ZEN para Fiji, primeiro use o comando Arquivo/Exportar para exportar como .tif na janela Imagem de resolução total - formato de plano único e, em seguida, importe para Fiji. Embora o YZ scan.lsm possa ser aberto diretamente em Fiji, as imagens YZ resultantes geralmente são compactadas na dimensão Z devido à avaliação incorreta do tamanho da etapa Z. - Análise utilizando ZEN
- Primeiro, abra os arquivos scan.lsm XY no ZEN. Vá para a guia Gráficos e selecione a ferramenta Linha. Desenhe uma linha entre os dois mioseptos verticais do somite 17 abrangendo todo o comprimento do miótomo (paralelo ao eixo anteroposterior do peixe). Marque a caixa M para revelar os valores da medição (Comprimento = 89,71 μm, consulte o Arquivo Suplementar 2).
- Abra os arquivos scan.lsm do YZ . Na guia Gráficos , selecione a ferramenta Bezier fechado . Desenhe ao redor do perímetro do miotoma. Uma vez concluída, marque a caixa M, isso revelaria o valor da medição (Área = 11980,01 μm2, consulte o Arquivo Suplementar 3).
- Registre os valores de cada medição manualmente em uma planilha. Faça a média das medições do CSA conforme necessário. O volume do miótomo pode ser calculado como Volume = Comprimento do miótomo x CSA, ou seja, 89,71 μm x 11980,01 μm2 = 1,075 x 106 μm3.
- Análise usando Fiji/ImageJ
- Abra os arquivos scan.lsm XY em Fiji/ImageJ. Verifique se as imagens XY abertas diretamente em Fiji estão corretamente calibradas em escala, como deveriam ser.
- Selecione a ferramenta Linha reta nos ícones. Desenhe uma linha ao longo do comprimento do somite 17, conforme descrito na etapa 4.3.1. Defina os parâmetros de medição indo para Analisar, selecione Definir medidas..., e marque as seguintes caixas Área e Exibir rótulo. Para medir, basta pressionar a tecla de atalho M ou ir para o menu Analisar e selecionar Medir. Uma janela pop-up resultante lista todos os valores de medição (ou seja, Comprimento = 90,023 μm; consulte Arquivo Suplementar 4). Os resultados podem ser salvos na forma de .csv e abertos no Microsoft Excel ou similar para análise subsequente.
- Para medir CSA nas imagens YZ , abra imagens YZ no formato .tif, conforme descrito na etapa 4.2.
- Calibre as imagens de .tif YZ à medida que elas não são calibradas quando exportadas. Os parâmetros para a calibração podem ser obtidos no ZEN acessando as Informações das imagens selecionadas: registre os valores de Escala X (0,489 μm) e Escala Z (0,890 μm; consulte o Arquivo Suplementar 5). Em seguida, enquanto as imagens estiverem abertas em Fiji, vá para Imagem e selecione Propriedades.... Insira 0,489 μm para a largura e a altura do pixel e 0,890 μm para a profundidade do Voxel. Marque a caixa Global para aplicar a calibração universalmente se a medição repetida de imagens YZ for antecipada (consulte o Arquivo Suplementar 6).
NOTA: Certifique-se de que todas as imagens YZ são capturadas usando os mesmos parâmetros de digitalização; reinicie Fiji/ImageJ ou modifique os valores de calibração se um novo conjunto de calibração for necessário. - Para medir o CSA das imagens YZ calibradas, selecione a ferramenta Seleções de polígonos nos ícones. Desenhe em torno do perímetro da somita e pressione M para revelar os valores da medição (Área = 11980,395 μm2; consulte o Arquivo Suplementar 7). O volume do miótomo pode ser calculado como Volume = Comprimento do miótomo x CSA, ou seja, 90,023 μm x 11980,395 μm2 = 1,079 x 106 μm3.
- Repita as medições nas outras imagens XY e YZ. Recomenda-se usar o mesmo software para todas as medições dentro de uma série experimental para consistência. A estimativa de volume de cada software é semelhante, mas não idêntica, devido às ferramentas de desenho distintas, ou seja, ZEN = 1,074 × 10 6 μm 3 e Fiji/ImageJ = 1,079 × 106 μm3. O crescimento do miótomo entre dois pontos de tempo (ou seja, 3 a 4 dpf) pode ser calculado como: (Volume 4 dpf - Volume 3 dpf)/ Volume 3 dpf × 100%.
Observação : sobre o erro e sua correção. Durante a montagem, o peixe deve ser orientado com seu plano sagital (ou seja, os eixos anteroposterior e dorsoventral) o mais próximo possível da horizontal, para evitar guinada e rolagem, respectivamente. Isso ocorre porque tanto o comprimento L do miótomo medido a partir da varredura XY quanto o CSA medido a partir de uma varredura YZ serão superestimados se o peixe mostrar guinada (rotação em torno do eixo dorsoventral) devido à montagem anteroposterior oblíqua. Nem o passo nem o rolo durante a montagem devem afetar as medições após a digitalização, conforme descrito na secção 3. No entanto, a rotação dorsoventral (rolo) degrada a qualidade da imagem. A trigonometria simples mostra que até 10° de guinada dará 3% de erro na medida do volume, como medido L e CSA cada aumento em proporção a (cosq)-1, onde q é o ângulo afastado da horizontal anteroposterior (guinada). 15° e 20° off darão 7% e 13% de superestimativas de volume, respectivamente.
Como a notocorda é cilíndrica, a inclusão de toda a notocorda na varredura YZ pode ser usada para calcular o ângulo e a extensão da obliquidade a partir da orientação e magnitude dos eixos maior e menor e, assim, corrigir o L e o CSA medidos para maximizar a precisão. CSA corrigido = CSA medido x Eixo menor Notocordd/Eixo maior Notochord. L corrigido = L medido x eixo menor da notocorda/eixo da notocorda na direção Z do microscópio.
Uma consideração adicional permite a correção adicional de L. À medida que o miótomo cresce, ele se inclina no plano coronal (normal ao eixo dorsoventral) de tal forma que o miótomo medial é ligeiramente anterior ao miotomo lateral. Vistos de dorsal, os mioseptos verticais nos lados esquerdo e direito formam uma ampla divisa apontando para o lado anterior. Se a guinada for baixa, essa morfologia não afeta a medição de L. Mas se a guinada for significativa, a correção trigonométrica torna-se desafiadora e uma abordagem melhor é medir o L verdadeiro diretamente, estimando as coordenadas XYZ dos dois pontos onde os mioseptos verticais anterior e posterior encontram a notocorda no miosepto horizontal. A trigonometria simples permite o cálculo de L verdadeiro a partir dessas coordenadas como L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Os pontos fracos desta última abordagem são que a) a seleção dos pontos pode variar de acordo com o operador e b) nenhum registro visual dos pontos escolhidos é mantido. Esta consideração não afeta a correção da CSA.
5. Método opcional: Remover e reintroduzir a atividade elétrica muscular
- Crie uma câmara de estimulação.
- Pegue uma placa de poço de 6 x 35 mm, crie duas pequenas aberturas (<5 mm de diâmetro, 1 cm de distância) em cada lado de cada poço (veja a Figura 1) usando um ferro de solda estreito.
NOTA: Manuseie o ferro de solda quente com cuidado e trabalhe em um exaustor, se desejar, para evitar a inalação de vapor. - Enfie um par de fios de prata ou platina (~20 cm de comprimento) através das aberturas de cada poço (ver Figura 1). O material adesivo reutilizável (por exemplo, BluTack) pode ser aplicado perto das aberturas para manter os fios no lugar e garantir uma separação de 1 cm entre os fios (consulte a Figura 1).
- Pegue uma placa de poço de 6 x 35 mm, crie duas pequenas aberturas (<5 mm de diâmetro, 1 cm de distância) em cada lado de cada poço (veja a Figura 1) usando um ferro de solda estreito.
- A 3 dpf, divida os peixes em três condições: Peixe médio Controle, Inativo e Inativo + Stim.
- Para os grupos Inativo e Inativo+Stim, anestesiar larvas às 72 horas pós-fertilização (hpf) com Tricaína (0,6 mM).
NOTA: Seguindo a referência38, as alíquotas congeladas da unidade populacional de tricazina são descongeladas e diluídas (meio de peixe de 40 μL/ml, até uma concentração final de 0,6 mM) antes da adição ao peixe. Não adicione tricaine diretamente na água contendo peixes, pois alguns peixes podem receber altas doses. O estoque de tricaína deve ser usado dentro de um mês e nunca ser recongelado. - Para os peixes médios Controle de peixes, deixe-os não anestesiados.
- Para os grupos Inativo e Inativo+Stim, anestesiar larvas às 72 horas pós-fertilização (hpf) com Tricaína (0,6 mM).
- Em momento(s) selecionado(s) após o início da exposição à tricapina (ou seja, a 80 hpf), prepare o grupo Inactive+Stim para estimulação.
- Preparar 60 mL de agarose a 2% (1,2 g de agarose em pó em 60 mL de meio peixe) e derreter totalmente com micro-ondas, esfriar, adicionar tricapina e despejar 4 mL em cada poço da câmara de estimulação (Figura 1).
- Adicione imediatamente pentes personalizados de 4 poços entre os eletrodos (criados pelo corte de plásticos (por exemplo, polipropileno) das dimensões desejadas e pela união usando Supercola; veja a Figura 1). Aguarde 10 minutos para o gel definir. Remova os pentes cuidadosamente para criar quatro poços retangulares.
- Encha cada poço com água tricaina e coloque uma única larva Inactive+Stim anestesiada em cada poço usando uma micropipeta, com seu eixo anteroposterior perpendicular aos eletrodos (ver Figura 1).
- Verifique sob o microscópio fluorescente de dissecação se cada peixe está totalmente anestesiado dentro de cada poço da câmara.
- Conecte um estimulador gerador de padrões eletrofisiológicos ajustável à câmara por meio de um controlador de polaridade, usando clipes de crocodilo conectados a cada um dos eletrodos de um lado da câmara (veja a Figura 1).
NOTA: O controlador de polaridade é usado para inverter a polaridade a cada 5 s, de modo a evitar eletrólise e corrosão dos eletrodos. - Estimule os peixes. Por exemplo, 1s com um trem de 200, 20 V pulsos, com 0,5 ms de duração de pulso e 4,5 ms de separação de pulso, uma vez a cada 5 s dá um regime eficaz de resistência à contração tetânica repetida.
- Verifique regularmente sob o microscópio para confirmar se os peixes estão sendo estimulados; o estímulo elétrico de exemplo deve induzir uma contração bilateral visível e um leve movimento, uma vez a cada 5 s.
- Para um regime de resistência/força elevada, estimule o peixe a uma frequência elevada para uma luta de 5 min, três vezes, com cada luta separada por 5 min de descanso.
NOTA: Enquanto os peixes de um lado da câmara estão descansando, os clipes de crocodilo podem ser conectados ao par de eletrodos do outro lado da câmara, e esses peixes adicionais estimulados. - Após a estimulação, remova cuidadosamente os peixes de cada poço, lavando-os suavemente com uma pipeta de plástico e retorne à incubadora em meio de peixe fresco contendo tricaine.
- Despeje a água tricaine de dentro da câmara e use fórceps para cortar e remover a agarose de cada poço. Lave os poços com água da torneira e deixe secar.
NOTA: Se estiver usando eletrodos de fio de prata, ocasionalmente o óxido de prata pode se acumular na superfície do fio após um experimento de estimulação. Como o óxido de prata é menos condutor do que a prata, para manter a reprodutibilidade, esfregue cuidadosamente o óxido de prata do fio usando Kimwipes antes de reutilizar a configuração.
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Representative Results
Uma medida rápida e precisa do volume de somite
Um método de preparação de amostras, aquisição de dados e análise volumétrica que permite a rápida medição do crescimento muscular em larvas de peixe-zebra é descrito. O tamanho do músculo pode ser medido em animais vivos usando peixes marcados em suas membranas plasmáticas com uma GFP direcionada à membrana (β-actina: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). As larvas foram anestesiadas transitoriamente com tricaína, montadas em agarose de baixo ponto de fusão e fotografadas por microscopia de fluorescência confocal. O somite 17 foi escolhido para análise do tamanho muscular devido à sua acessibilidade na interface tronco-cauda31. Na prática, como na teoria, o volume do miótomo pode ser calculado como o produto do comprimento do miótomo (L) e a média de três medidas de área transversal (CSA) (Figura 2A, que é referida como o método de 4 fatias).
Para validar esse método, foram obtidas pilhas Z confocais inteiras de larvas vivas de peixe-zebra (Figura 2B) e o volume de somita foi calculado multiplicando-se a soma das 17 áreas de perfil do somite em cada fatia (80-100 fatias) pela distância inter-fatia (1-1,2 μm). Observou-se forte correlação entre os métodos de cálculo de 4-slice e full stack (Figura 2C). No entanto, o método de 4 fatias geralmente forneceu uma estimativa de volume ligeiramente maior (~2% maior em média) (Figura 2D). Essa diferença pode ser devida tanto à a) obliquidade das amostras dando uma medida de volume erroneamente grande quanto b) à observação de que os miótomos do peixe-zebra se afunilam ao longo do eixo anteroposterior, sendo menores em direção à cauda do animal. Como as medidas de YZa, YZm e YZp CSA estão voltadas para a porção anterior da divisa do miotomo do somita 17 (Figura 2A), esta última interpretação foi testada pela análise volumétrica dos miótomos dos somitos 16 e 18. Cada somite foi cerca de 7% maior que o de trás (Figura 2E). Uma análise mais aprofundada revelou que um método de 2 fatias que requer apenas uma única medida de ZH, localizada no meio do somito, onde as metades epaxial e hipaxial se encontram no miosepto horizontal (YZm) e na fatia XY, fornece uma estimativa razoavelmente precisa do volume do miótomo (Figura 2F,G). A abordagem de 2 fatias permite uma aquisição de dados mais rápida quando as restrições de tempo limitam o número de peixes que podem ser digitalizados. Em resumo, esses dados mostram que o volume do miótomo pode ser medido com rapidez e precisão em larvas vivas de peixe-zebra. Larvas únicas foram medidas com sucesso, repetidamente, durante um período de 6 dias com este método.
Para o estudo comparativo do crescimento de uma unidade tecidual identificada, o método descrito fornece estimativas de volume confiáveis e precisas. Para obter volumes absolutos precisos, no entanto, uma série de modificações podem ser aplicadas. Primeiro, a correção pode ser feita para erros causados pela montagem oblíqua, seja inclinando o prato ou o estágio do microscópio para obter melhores fatias transversais YZ e parasagitais XY durante a imagem ou usando o perfil notocorda em fatias YZ ; o eixo menor transversal revela o verdadeiro diâmetro da notocorda cilíndrica, ao passo que o seu eixo maior revela o ângulo e a magnitude da obliquidade (ver nota no ponto 4.6 supra). Em segundo lugar, a localização do corte XY e YZ durante a varredura deve ser selecionada para refletir, com precisão, o(s) mioto(s) desejado(s). (Ver nota no ponto 4.6 supra). Note, no entanto, que a forma dos diversões do miótomo muda dependendo do estágio de desenvolvimento e isso deve ser levado em conta ao selecionar exames YZ . Por fim, para determinar se as alterações no miótomo 17 refletem o crescimento muscular em todo o eixo, os miótomos mais adiante nas regiões do tronco ou da cauda podem ser medidos pelo método descrito.
Medidas repetidas revelam crescimento do somite
Uma vantagem do método descrito é a facilidade de análise repetida em um único peixe. Embriões e larvas individuais podem ser repetidamente incorporados, medidos e liberados sem sofrer efeitos óbvios a longo prazo (Figura 2H). O miótomo cresce detectavelmente tanto em L quanto em CSA entre 2 e 5 dpf, levando a um aumento constante de volume (Figura 2H). O crescimento foi fotografado desta forma entre 1 e 8 dpf e as larvas também foram liberadas após a imagem e cresceram até a idade adulta. Espera-se que análises mais adiante no final do período larval sejam possíveis, embora os efeitos de imagens repetidas sobre o comportamento alimentar precisem ser monitorados cuidadosamente em comparação com irmãos que não são fotografados. É importante ressaltar que o desenvolvimento da pigmentação pode obscurecer a imagem. Considerando que a pigmentação não é um problema em peixes adequadamente orientados, já que as listras de melanóforo não impedem as medições necessárias, o pigmento pode ser mais problemático em amostras montadas obliquamente. Prevê-se o uso de linhas mutantes de pigmentação, como a roy;mitfa39, o que estenderia a janela de tempo das medições de crescimento até que os limites da profundidade de varredura confocal praticável sejam atingidos.
Uma outra vantagem do procedimento descrito é a facilidade de análise detalhada do crescimento de fibras únicas em comparação com todo o seu miótomo em curtos períodos. Por meio da marcação em mosaico de fibras por injeção de DNA, foi desenvolvido um método para detectar a aquisição e o crescimento nuclear em fibras individuais identificadas ao longo de 4 h e, em seguida, permitir a reanálise em momentos posteriores (Figura 2I). Além disso, o crescimento de todo o miótomo pode ser medido ao longo de 12 h ou menos26 (e os dados não mostrados). Ao medir repetidamente o mesmo peixe, a variabilidade interindividual é eliminada e um pequeno número de animais pode produzir resultados estatisticamente robustos26.
Manipulações que alteram o volume do somite podem ser prontamente detectadas
O protocolo atual permite interrogar mudanças no crescimento muscular sob várias condições biológicas e fisiológicas, como inatividade física alterada. A tricapina anestésica, que bloqueia os potenciais de ação nervosa inibindo os canais de Na+ dependentes de voltagem40, foi utilizada para induzir inatividade muscular em larvas de β-actina:HRAS-EGFP . Como mostrado anteriormente26, a inatividade por 24 h entre o terceiro e o quarto dpf reduziu muito o volume do miótomo, indicando que o crescimento muscular larval é dependente da atividade (Figura 3A). O efeito da inatividade também pode ser investigado usando outros métodos de detecção que revelam a estrutura da somita, como mCherry-CAAX (seja em uma linha transgênica ou por injeção de mRNA) ou por imersão noturna de larvas em corante BODIPY (Figura 3A). Esta última abordagem, ao mesmo tempo que elimina a necessidade de cruzar peixes em fundos transgénicos ou de injetar embriões, não pode ser utilizada para medições repetidas devido à toxicidade da BODIPY. Assim, o método atual permite medir de forma reprodutível as mudanças no volume do tecido muscular.
Como descrito acima, os métodos de marcação genética podem ser usados para fazer medições repetidas do volume do miótomo, permitindo o rastreamento da mudança no tamanho do músculo ao longo de dias sucessivos em peixes individuais. Como peixes individuais e posturas inteiras no mesmo estágio de desenvolvimento diferem em volume absoluto de miótomos (Figura 3A; talvez devido ao tamanho ou à saúde dos ovos), a capacidade de medir o crescimento de cada indivíduo reduz os efeitos da variação individual, permitindo análises estatísticas de amostras pareadas. Medir repetidamente o mesmo peixe reduz o número de peixes necessários para detectar efeitos de forma robusta. Para ilustrar esse efeito, os resultados da análise do crescimento de cada indivíduo de 3 a 4 dpf em populações de larvas ativas e inativas foram comparados com a análise das mesmas duas populações usando apenas a única medida de tamanho de miótomo feita a 4 dpf. De lay para lay, observou-se maior variação na redução aparente do tamanho do miótomo ao medir o volume do miótomo a 4 dpf apenas em comparação com a medição do volume de 4/3 dpf para cada indivíduo (Figura 3B). Nota-se a maior faixa de redução (68%-91%) nas medidas apenas de 4 dpf, em comparação com o método de 4/3 dpf (78%-89%) e a fraca correlação entre as duas medidas. Embora, como esperado, a redução média em todas as 13 repetições biológicas tenha sido semelhante em cada avaliação (Figura 3C), sendo 82,62 ± 1,01% (média ± MEV, n = 13) para o método 4/3 dpf e 82,31 ± 1,92% para o método somente 4 dpf, o erro estimado com o método somente 4 dpf foi quase o dobro do método 4/3 dpf. Assim, quantificar o crescimento individual por meio de medidas repetidas é o método mais preciso, eliminando a variabilidade de tamanho entre peixes dentro de uma mesma postura, como demonstrado anteriormente26. No entanto, como nenhuma diferença significativa na redução do volume do miótomo causada pela inatividade foi observada ao medir o volume do miótomo a apenas 4 dpf (Figura 3C), os dados sugerem que ~6-8 peixes são suficientes para calcular a diferença de tamanho interindividual dentro de uma postura. Claramente, quando as mudanças de tamanho são pequenas, o método 4/3 dpf é preferido.
Análise da base celular do crescimento
A ACS do miótomo é determinada pelo número de fibras musculares e pelo tamanho da fibra. O número de fibras pode ser estimado contando o número de fibras rápidas e lentas em três seções YZ (YZ a, YZ m, YZ p). Embora regiões de dois miótomos adjacentes estejam contidas nessas seções ZH, como mostrado pela presença de mioseptos verticais (VM) na maioria das seções (Figura 2A), essas contagens refletem com precisão o número de fibras. A supercontagem ocorre nas VMs devido ao afunilamento de pares de fibras de cada segmento adjacente na VM (Figura 4A). Essa supercontagem pode ser explicada utilizando-se a seguinte equação: Número de fibras = Contagem total de fibras - (fibras em contato com VM) / 2 referência33. Além disso, o volume médio de fibras pode ser determinado dividindo o volume do miótomo pelo número de fibras. Utilizamos essas análises para revelar que a atividade controla ambos os aspectos celulares do crescimento (Figura 4B,C).
Fica evidente a partir da Figura 2A que as fibras variam de tamanho ao longo do miotoma, uma realidade que não se reflete nas medidas calculadas do volume médio de fibras. Ao desenhar em torno de cada fibra de somite 17 de dois peixes, a área da seção transversal da fibra medida mostrou variar de 28 μm 2 a 217 μm2 (Figura 4D). Na realidade, no entanto, muitas fibras são anguladas obliquamente dentro do miotoma, de modo que tais medidas de CSA não refletem a verdadeira CSA de uma fibra perpendicular ao seu longo eixo. Por outro lado, devido aos diferentes ângulos de fibras dentro do miótomo, todas as fibras que correm em orientações que não estão alinhadas anteroposteriormente têm comprimentos que diferem do comprimento do miótomo. Apesar dessas ressalvas, que só podem ser contornadas pela segmentação completa do miótomo em volumes únicos de fibra ou pelo cálculo após a medição do ângulo de obliquidade de cada fibra, os CSAs medidos fornecem uma estimativa da diversidade de tamanho da fibra em cada peixe. Por exemplo, as fibras individuais diminuíram na ACS com a inatividade, resultando em um deslocamento para a esquerda na curva de frequência cumulativa em relação às larvas de controle ativas (não anestesiadas) (Figura 4E). Como os peixes inativos têm ~10 fibras a menos do que os peixes ativos (Figura 4B), as 10 menores fibras de peixes ativos não anestesiados (na suposição de que são as novas) ou as 10 maiores (como o extremo alternativo) foram omitidas da comparação, o que mostrou que a maior parte da perda do volume do miótomo é devido à falta de crescimento de fibras, em vez de falha na formação de novas fibras (Figura 4F). Tomados em conjunto, esses dados mostram que o método descrito permite uma investigação detalhada do papel da atividade física na formação e crescimento do tecido muscular.
Reimposição de atividade por estimulação elétrica
A atividade física é necessária para o crescimento muscular (Figura 3A). Um método para reimpor contrações musculares por estimulação elétrica em larvas de outra forma inativas, evocando uma forte resposta contrátil é descrito (Figura 5A, Arquivo Suplementar 8). Embora parâmetros precisos de estimulação sejam descritos aqui (Figura 5B) para ativar ao máximo a musculatura, o protocolo pode ser alterado (alterando a amplitude da corrente, frequência, duração do pulso, etc.) para controlar a ativação muscular e a dosagem do exercício. Assim, o método atual proporciona um estímulo de atividade controlada com comportamento padronizado entre as sessões de atividade, superando uma importante limitação dos modelos animais atuais de exercício18.
Os métodos descritos demonstram o potencial do uso de larvas de peixe-zebra para estudar vários aspectos do crescimento muscular (por exemplo, hiperplasia e hipertrofia). Em particular, a miogênese em larvas de peixe-zebra mostra-se passível de análise por meio de inatividade farmacologicamente induzida e contratilidade induzida eletricamente. A abordagem permite o estudo dos mecanismos moleculares pelos quais a atividade física leva ao crescimento muscular in vivo.
Figura 1: Projeto de uma câmara de estimulação para reintrodução da atividade elétrica muscular em larvas de peixe-zebra. Uma placa de cultura de células de 6 poços equipada com eletrodos permite a manutenção de larvas em poços feitos dentro de gel de agarose a 2%. Os pentes personalizados de 4 poços são feitos para criar poços retangulares (dimensões, conforme indicado) em agarose para manter a posição e a orientação de larvas de peixes individuais e para evitar que elas entrem em contato com os fios de prata durante a contração vigorosa após a estimulação elétrica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medição do volume muscular em peixes-zebra vivos α-actina:mCherry-CAAX (A,B,E) ou β-actina:Larvas transgênicas HRAS-EGFP (H,I). Larvas fotografadas a partir de vista lateral e mostradas dorsais para cima, anterior à esquerda nos painéis superiores (A,B,E). (A) No método de 4 fatias, o volume do miótomo foi calculado multiplicando-se o comprimento do somita 17 (L) medido entre os mioseptos verticais (VM) em um plano XY (seta azul) pela média de três áreas transversais (CSA) medidas nos planos YZ (YZm, YZa e YZp; linhas amarelas tracejadas). (B) No método Full Stack, a área do miótomo do somite 17 foi medida (exemplos descritos em amarelo) em cada fatia de uma pilha Z inteira de uma larva viva de peixe-zebra e a soma das áreas miotomais foi multiplicada pela distância entre fatias. (C) Alta concordância entre os métodos 4-slice e Full Stack. As cores denotam β-actina individual: HRAS-EGFP (quadrados) ou α-actina: mCherry-CAAX (círculos) peixe. (D) O volume do miótomo é ligeiramente, mas significativamente, maior quando calculado usando o método de 4 fatias. (E) Nas larvas de peixe-zebra afiladas, mais somitos anteriores são maiores do que os somitos posteriores, conforme medido pelo método de 4 fatias. (F,G) Forte correlação entre as medidas de volume realizadas utilizando a média de três seções CSA (método de 4 fatias) ou uma única ACS de YZm (método de 2 fatias). Os valores de p mostram resultados de testes t bicaudais com variância igual (D,G) ou ANOVA unidirecional com testes post hoc de Bonferroni (E). ns, não significativo. (H) Medida do miótomo 16 volume, comprimento (L) e área transversal (CSA) de 2 a 5 dpf em três peixes individuais (cores) expressando β-actina:HRAS-EGFP e myog:H2B-mRFP. As imagens YZm do indivíduo verde em cada ponto de tempo são mostradas acima. (I) Crescimento de fibra única medido por segmentação automatizada de limiar constante. Um peixe β-actina:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP marcado mosaicalmente por injeção de um plasmídeo CMV:Cerulean no estágio de célula 1-2. Uma única fibra marcada com cerúleo no somite 10 foi digitalizada com pilhas XYZ completas de alta resolução repetidamente em um Zeiss LSM880. As imagens mostradas são fatias únicas representativas (esquerda) e a projeção do volume segmentado tridimensional (direita). Cada ponto de dados no gráfico representa uma única varredura da mesma fibra, a 3 dpf (0 h), após 4 h e a 5 dpf (54 h). Foram realizadas varreduras tripladas e segmentadas por ponto de tempo para mostrar reprodutibilidade. As pontas das setas brancas apontam para os núcleos das fibras; note que dois núcleos são adicionados entre 3 e 5 dpf. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento muscular dependente da atividade no somite 17. (A) Inibir a atividade por 24 h pela aplicação de tricaína (rosa) entre 3 e 4 dpf reduz o volume de miótomos tanto em linhagens transgênicas quanto em peixes não transgênicos corados com BODIPY em comparação com controles de veículos em irmãos (azul). Volume quantificado pelo método de 4 fatias. A forma do símbolo indica replicar experimentos de lays distintos (replicações biológicas). Símbolos grandes denotam valores médios ± de MEV. Pequenos símbolos fracos mostram o volume de larvas replicadas individuais. (B) Comparação da redução do volume do miótomo em peixes inativos em comparação com irmãos controle determinada pela medição única do volume do miótomo a 4 dpf (apenas 4 dpf, esquema superior) ou mudança no volume do miótomo entre 3 e 4 dpf (4/3 dpf, esquema inferior). Cada símbolo representa o volume médio do miótomo 17 em ~5 peixes inativos de um único leito dividido pelo volume médio do miótomo 17 de ~5 irmãos controle ativos. (C) Não foi observada diferença na redução média do crescimento muscular em peixes inativos, quando medida pelos métodos de 4 dpf apenas ou 4/3 dpf. Os números dentro das barras representam o número total de peixes analisados. Os valores de p mostram resultados de ANOVA bidirecional com testes post hoc de Bonferroni (A) ou teste t bicaudal com variância desigual (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações no nível celular no crescimento muscular causadas pela inatividade. (A) Esquema mostrando como a supercontagem ocorre em VMs devido à dupla contagem de fibras afiladas onde os miótomos azuis e vermelhos se encontram. Observe que a contagem média de fibras é 6, mas o valor médio verdadeiro é 5,5. A contagem corrigida dá uma melhor aproximação. (B,C) O número de fibras (B) e o volume médio de fibras (C) são reduzidos em larvas inativas (rosa) em comparação com larvas ativas (bue). A forma do símbolo indica replicar experimentos de lays distintos (replicações biológicas). Símbolos grandes denotam valores médios ± de MEV. Símbolos fracos menores mostram o valor de larvas replicadas individuais. Os números dentro das barras representam o número total de peixes analisados. (D) Em larvas únicas, cada perfil de fibra no miótomo 17 foi delineado e a ACS determinada. Os valores de p mostram ±os resultados da ANOVA two-way com testes post hoc de Bonferroni (B,C) ou teste t de duas caudas com variância igual (D). (E,F) Curvas de frequência cumulativas mostrando a distribuição do tamanho da fibra em larvas de controle ativo (azul) e inativo (rosa). A comparação de todas as fibras (E), ou após a omissão de fibras pequenas presumidamente nascentes ou, no extremo alternativo, grandes fibras (F) mostra que o aumento do tamanho da fibra, e não o aumento do número de fibras, é responsável principalmente pelo crescimento do miotomo impulsionado pela atividade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Estimulação elétrica breve evoca contrações musculares tetânicas em larvas de peixe-zebra anestesiadas . (A) Imagens sequenciais (capturadas do vídeo no Arquivo Suplementar 8) mostrando como a estimulação elétrica desencadeia contrações máximas de uma larva anestesiada a 3 dpf. Escala de tempo em segundos. Caixas vermelhas indicam movimentos no início de três trens de estimulação 1 s sucessivos. Cada imagem tem uma exposição de 40 ms. (B) Esquema mostrando o regime de estimulação elétrica, no qual um trem de 1 s de 200 impulsos elétricos de alta frequência e 20 V é dado a cada 5 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Esquemas de imagens capturadas de larvas perfeitamente (canto superior esquerdo) e imperfeitamente montadas em relação ao quadro de referência XYZ do microscópio (eixos pretos). Miótomo (verde), notocorda (amarelo), tubo neural (bronzeado), parâmetros miotomais medidos (vermelho), parâmetros de notocorda medidos (setas pretas) e rotações de peixes possíveis ou reais (azul). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Captura de tela mostrando a medição do comprimento do somite a partir de imagens XY em ZEN. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: Captura de tela mostrando a medição CSA de imagens YZ em ZEN. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 4: Captura de tela mostrando a medição do comprimento do somite a partir de imagens XY em Fiji/ImageJ. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar: Captura de tela mostrando a extração de parâmetros de calibração para imagens YZ do ZEN. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 6: Captura de tela mostrando a calibração de imagens YZ em Fiji/ImageJ. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 7: Captura de tela mostrando a medição CSA de imagens YZ em Fiji / ImageJ. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 8: Vídeo representativo mostrando contração muscular evocada por estimulação elétrica direta (comprimento 1 s) de uma larva de 3 dpf anestesiada com tricaina. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui relatamos um método para estimativa precisa e eficiente do volume muscular de larvas vivas de peixe-zebra em estágios ou em variantes genéticas em que a pigmentação não é um grande obstáculo à imagem e quando a anestesia transitória e/ou imobilização é bem tolerada. Considerando que empregamos a microscopia confocal de varredura a laser, as abordagens descritas são aplicáveis à microscopia confocal ou de folha de luz de disco giratório e a qualquer outro método que crie pilhas de imagens em planos focais distintos. Uma série de abordagens cada vez mais sofisticadas para o tamanho do tecido e a estimativa do conteúdo celular é descrita. Cada método tem vantagens e limitações, que mostramos que podem ser quantificadas. Uma grande limitação no estudo do crescimento tecidual é a dificuldade de analisar as mudanças de crescimento em tempo real, à medida que as taxas de crescimento se alteram em resposta a uma série de eventos moleculares ou subcelulares catalisados por estímulos administrados agudamente. Além disso, a variação individual pode criar problemas quando indivíduos separados são comparados. A abordagem atual permite a medição do crescimento tecidual em períodos inferiores a um dia em indivíduos vivos solteiros. A aplicação da abordagem pode ser prevista no prazo minuto.
Os métodos descritos permitem análises até então impraticáveis. Usando o método de 4 fatias, a parte de imagem do ensaio de crescimento muscular pode ser concluída em um tamanho de amostra de cerca de 20 peixes dentro de uma hora por um operador treinado. Isso está em contraste com o método convencional Full Stack, que leva pelo menos 3 h para o mesmo número de peixes (ou seja, três vezes mais). Se imagens de alta resolução forem necessárias para análises subcelulares subsequentes, o método Full Stack pode facilmente exigir 30 minutos por peixe, tornando impossíveis ensaios de crescimento de coortes de animais em um estágio de desenvolvimento semelhante. Em contraste, os métodos de 2 ou 4 fatias permitem uma rápida captura de imagem de alta qualidade. Passando a considerar a análise de imagem, as vantagens do método de 2 ou 4 fatias na economia de tempo do operador (na ausência de segmentação automatizada de imagem) em relação ao método Full Stack são enormes. Cada peixe requer cerca de 20 minutos para análise Full Stack, mas apenas 3-4 min para análise de 4 fatias. O tempo do operador pode ser conservado usando o método de 2 fatias quase tão preciso. Assim, o método descrito é eficiente e, assim, aumenta a flexibilidade no desenho experimental.
A principal limitação dos métodos de 4 ou 2 fatias é que ambos os métodos são estimativas, devido à sobreposição da forma da divisa dos somitos (por exemplo, o volume de regiões de dois somitos vizinhos (por exemplo, miótomo 16 e 17). Mostra-se que isso pode superestimar o volume real do miótomo 17 em cerca de 2%, dependendo precisamente de onde as fatias YZ foram selecionadas. Além disso, o rastreamento manual das bordas do somite durante as medições pode contribuir para variações nas estimativas, embora pouca diferença entre os experimentadores tenha sido encontrada (dados não mostrados). Os erros de medição podem ser resolvidos usando algoritmos de limiar, filtragem e segmentação para adquirir área de superfície de maneira mais objetiva e reprodutível. No entanto, personalizações ainda serão necessárias para levar em conta as variações na fluorescência de fundo (como devido à incorporação e / ou espessura do LMA) e o nível de expressão de proteínas de fluorescência de larvas individuais ao longo do tempo. Observe que tais medições automatizadas serão ainda mais desafiadoras se um repórter não específico do músculo for usado, como a linha β-actina:HRAS-EGFP . No entanto, em muitas circunstâncias, por exemplo, ao comparar os efeitos das manipulações entre peixes submetidos a diferentes tratamentos que se espera que afetem todo o tecido muscular, a imprecisão pode ser irrelevante. No entanto, se a precisão máxima for necessária para comparação com números de fibras ou nucleares contados apenas a partir do miótomo 17, por exemplo, os métodos de "fatia" podem ser melhorados. Isso pode ser alcançado usando o árduo método Full Stack, por correção matemática multiplicando os volumes de 4 fatias medidos por 0,98, ou movendo a localização dos exames de ACS YZ posteriormente para refletir com mais precisão a verdadeira ACS do miótomo 17.
Uma segunda limitação do método é a sua sensibilidade à orientação de montagem do peixe. Na prática, operadores qualificados podem orientar os peixes dentro de limites razoáveis na maioria das vezes, mesmo quando trabalham rapidamente para incorporar muitas amostras. Modificações no equipamento no estágio do microscópio podem ser previstas que permitiriam a correção da guinada e do rolo antes da digitalização. Sem esse aparelho, descreve-se um método para quantificar a desorientação que pode então ser usado para corrigir os volumes medidos. Além disso, mesmo que a má orientação aumente a variabilidade no volume medido e, portanto, reduza a chance de observar pequenos tamanhos de efeito, em muitas situações essa variação afetará as amostras de controle e experimentais de forma semelhante. Portanto, resultados falsos positivos são improváveis, se os operadores estiverem cientes do problema.
Os métodos descritos foram inicialmente aplicados para analisar o papel da atividade elétrica no crescimento muscular, um assunto com uma longa história de análise em uma ampla gama de espécies (revisado em18). Para este fim, métodos simples para bloquear a atividade desencadeada endogenamente são descritos em detalhes e substituídos por estimulação elétrica padronizada controlada na larva de peixe-zebra. As vantagens dessa abordagem são a remoção dos controles de feedback neural40, a eliminação dos efeitos da nutrição alterada e a capacidade de analisar os efeitos circadianos sobre o próprio crescimento, e não sobre os proxies de crescimento, como o turnover proteico26. Como diferentes padrões de atividade elétrica desencadeiam respostas musculares distintas, regulando o tipo, o tamanho e o metabolismo da fibra 41,42,43,44,45,46,47,48, os métodos atuais abrem o peixe-zebra para tais análises.
Os métodos descritos oferecem um conjunto de técnicas com as quais muitos aspectos da fisiologia muscular, biologia celular e patologia podem ser analisados em resolução temporal e espacial sem precedentes, aproveitando o peixe-zebra relativamente inexplorado. As abordagens atuais poderiam ser claramente aplicadas a outras espécies, regiões do corpo e estágios de desenvolvimento. O rápido crescimento precoce de larvas de peixe-zebra torna a detecção de efeitos agudos de manipulações no crescimento tecidual e morfogênese particularmente atraentes áreas de estudo. Além disso, o músculo peixe-zebra é mostrado para compartilhar vários mecanismos de crescimento e controles com mamíferos. Embora o peixe-zebra seja um vertebrado que conserva muitos aspectos da genética molecular muscular, da biologia celular e do desenvolvimento com os seres humanos, também existem diferenças significativas no controle do crescimento muscular. Por exemplo, os tipos de fibras lentas e rápidas são mais claramente segregados espacialmente em peixes e a inervação do músculo mostra diferenças. Além disso, deve-se ter em mente que, até agora, só pudemos analisar os estágios iniciais do desenvolvimento. Estão previstas análises semelhantes em fases posteriores.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores estão profundamente em dívida com os esforços dos membros do laboratório Hughes, Drs. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin e Vladimir Snetkov, para o desenvolvimento dos protocolos descritos, e para Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau e Peter Currie para compartilhar plasmídeos ou linhas de peixe-zebra. A SMH é uma cientista do Conselho de Pesquisa Médica (MRC) com a Bolsa do Programa G1001029, MR/N021231/1 e MR/W001381/1 de apoio. MA realizou um MRC Doctoral Training Program PhD Studentship do King's College London. Este trabalho se beneficiou da contribuição trigonométrica de David M. Robinson, estudioso, mentor e amigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
