Summary
Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.
Abstract
Canlı embriyonik, larva veya yavru zebra balıklarının vücudundaki bireysel hücreleri görselleştirmek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Floresan işaretli plazma zarlarına sahip canlı balıkların, kas dokusunun hacmini ve mevcut kas liflerinin sayısını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobunda taranabileceğini gösteriyoruz. Canlı hayvanlarda zaman içinde hücre sayısı ve büyüklüğünün ölçülmesi için etkili yaklaşımlar tanımlanmış ve daha zorlu segmentasyon yöntemlerine karşı doğrulanmıştır. Kas elektriksel ve dolayısıyla kasılma aktivitesinin kontrolüne izin veren yöntemler açıklanmaktadır. İskelet kası kasılma aktivitesinin kaybı, kas büyümesini büyük ölçüde azaltmıştır. Larvalarda, desenli elektriksel uyarılmış kontraktil aktivitenin yeniden sokulmasına izin veren bir protokol açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, bireyler arası değişkenliğin etkisini en aza indirir ve elektriksel, genetik, ilaç veya çevresel uyaranların canlı organizma bağlamında çeşitli hücresel ve fizyolojik büyüme parametreleri üzerindeki etkisinin analizine izin verecektir. Tanımlanmış bir erken yaşam müdahalesinin bireyler üzerindeki ölçülen etkilerinin uzun süreli takibi daha sonra yapılabilir.
Introduction
Hücre sayısındaki (hiperplazi) ve / veya hücre boyutundaki (hipertrofi) artışı içeren düzenlenmiş doku büyümesi, gelişim, rejenerasyon ve ekolojik ve evrimsel adaptasyonda çok önemli bir faktördür. Son yıllarda hem hücre hem de gelişim biyolojisinin moleküler genetik anlayışındaki büyük ilerlemelere rağmen, doku ve organ büyüklüğünün düzenlenmesine ilişkin mekanik anlayış hala emekleme aşamasındadır. Bilgideki bu lakunanın bir nedeni, canlı organizmalardaki doku büyümesini gerekli mekansal ve zamansal doğrulukla ölçmenin zorluğudur.
Tüm organizmaların büyümesinin çeşitli yönleri zaman içinde tekrar tekrar ölçülebilir ve her birbirey için büyüme eğrileri ortaya çıkar 1,2,3,4,5. Çift X-ışını absorpsiyometrisi (DXA), bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi giderek daha sofistike hale gelen tarama yöntemleri, hem insan hem de model organizmalarda tek bireylerde tüm organların ve diğer vücut bölgelerinin (örneğin, bireysel olarak tanımlanmış iskelet kasları) büyümesinin izlenmesine izin verir 6,7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yöntemler henüz bireysel hücreleri ortaya çıkarma çözünürlüğüne sahip değildir ve bu nedenle hücresel davranışlar ile doku seviyesi büyümesi arasındaki bağlantıları ayırt etmek zor olmuştur. Bu tür bağlantılar kurmak için, geleneksel çalışmalar genellikle benzer bireysel hayvanların kohortlarına güvenmiştir; bunlardan birkaçı ardışık zaman noktalarında kurban edilir ve daha sonra sitolojik ayrıntılarla analiz edilir. Bu tür yaklaşımlar, (tercihen benzer, ancak yine de değişken) birey grupları arasında gözlemlenen değişikliklerin ortalamasını almayı gerektirir ve bu nedenle zamansal ve mekansal çözünürlük eksikliğinden muzdariptir, bu da hücresel düzeyde neden-sonuç düşündüren korelasyonlu olayları bulmayı zorlaştırır.
Başlangıçta C. elegans ve D. melanogaster'de omurgasız model organizmalar üzerine yapılan çalışmalar, hücresel çözünürlük elde etmek ve tek bireylerde zaman içindeki büyümeyi doğru bir şekilde ölçmek için optik mikroskopi geliştirerek bu sorunları aşmıştır. Bu tür çalışmalar, bu küçük model organizmaların büyümesinde çarpıcı bir şekilde değişmez hücre soy davranışlarını ortaya koymuştur 11,12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, tüm omurgalılar da dahil olmak üzere birçok hayvan, belirsiz hücre soylarına sahiptir ve genetik olarak kodlanmış büyüme programını, tüm kurucu dokuları ve organları uygun şekilde eşleşen işlevsel üç boyutlu bir organizmaya dönüştürmeye yarayan gizemli geri bildirim süreçleriyle doku büyümesini kontrol eder. Bu karmaşık büyüme süreçlerini anlamak için, seçim zamanında genetik, farmakolojik veya diğer müdahalelerle deneysel olarak manipüle edilebilen ve daha sonra analiz edilen etki olan tek bireylerde zaman içinde tüm dokuların veya organların görüntülenmesi arzu edilir.
Her omurgalı iskelet kası tanımlanmış bir boyuta, şekle ve işleve kemik, tendon ve sinirler gibi bitişik dokularla iyi karakterize edilmiş etkileşimlere sahiptir. Bazı kaslar küçüktür, cildin hemen altında bulunur ve bu nedenle yüksek çözünürlüklü görüntüleme çalışmaları için iyi adaylardır. Çoğu organa benzer şekilde, her kas stabil bir yetişkin boyutuna ulaşmadan önce embriyonik, doğum sonrası ve genç yaşam boyunca büyür. Bununla birlikte, kas, yetişkin yaşamı boyunca, kullanıma ve beslenmeye bağlı olarak boyut değiştirme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir18 ve bu özelliğin organizma zindeliği, spor performansı ve bağımsız yaşam üzerinde büyük bir etkisi vardır. Yaşlılıkta kas kütlesi ve fonksiyon kaybı, sarkopeni, yaşlanan bir nüfusla karşı karşıya kalan toplumlar için artan bir endişe konusudur 19,20,21.
Biz ve diğerleri, zebra balığı larvalarının segmental olarak tekrarlayan gövdesinde, doku büyümesinin, bakımının ve onarımının gözlemlenebileceği ve manipüle edilebileceği birkaç yüz hücre içeren görünüşte kapalı bir sistem olarak tanımlanmış iskelet kas dokusu bloklarının büyümesine odaklandık22,23,24,25,26. Bazı nicel çalışmalar daha önce 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 olarak bildirilmiş olsa da, zaman içinde bireysel omurgalı organizmalarda hücresel detaylarda kas büyümesini ölçmek için ayrıntılı ve doğrulanmış bir yöntem mevcut değildir. Burada, bu tür tekrarlanan ölçümlerin nasıl yapılacağına dair etkili bir protokol, doğrulama ile birlikte tanımlanmıştır ve değiştirilmiş elektriksel aktiviteye yanıt olarak hem hipertrofik hem de hiperplastik büyümedeki değişiklikleri analiz etmek için kullanımının bir örneği verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm araştırmalar, kurumsal yönergelere uygun olarak ve 1986 Hayvan (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve sonraki değişikliklere uygun olarak İngiltere İçişleri Bakanlığı'ndan uygun lisanslar altında gerçekleştirilmiştir. Embriyolar / larvalar, gastrulasyonun tamamlanmasına kadar 28.5 ° C'de yetiştirilmelidir, ancak daha sonra gelişme hızını kontrol etmek için 22-31 ° C'de tutulabilir. Balıklar oda sıcaklığında taranabilir veya uyarılabilir.
1. Zebra balığı larvalarını anestezik hale getirin
- Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referans36 veya Tg(α-aktin:mCherry-CAAX)pc22Tg referans37 gibi uygun floresan muhabir yetişkin balıkları çapraz yapın ve38 tarif edildiği gibi embriyoları toplayın.
- Döllenmeden sonraki 2 gün (dpf) gibi seçim zamanında, Trikain içeren balık ortamını (balık suyu veya E3 ortamı) kullanarak embriyoları kısaca anestezi altına alın ve Leica MZ16F gibi bir floresan mikroskobu altında EGFP veya mCherry için tarama yapın. Birinin çok sayıda embriyosu varsa, en parlak sinyale sahip olanları seçin. Embriyoları taramadan hemen sonra normal balık ortamına geri döndürün.
2. Konfokal tarama için balık montajı
- Sistemin 30-60 dakika boyunca stabilize olmasına izin vermek için konfokal lazer tarama sistemini ve lazerleri açın.
NOT: Burada, 20x/1,0 W suya daldırma hedefi ile donatılmış dik malzeme standına (çalışma mesafesini artıran) sahip bir Zeiss LSM 5 Exciter mikroskop kullandık. - % 1 düşük erime noktalı agaroz (LMA) hazırlayın ve 1,5 mL'lik bir tüpte tekrar tekrar kullanım için 37 ° C'lik bir ısı bloğunda saklayın. Isı şokunu önlemek için, LMA aliquot'u ısı bloğundan çıkarın ve larvaya uygulamadan önce ayarın hemen üstüne soğumasını sağlayın, bebek formülü sütünün sıcaklığını değerlendirirken olduğu gibi uygun sıcaklığı değerlendirmek için cildine karşı test edin.
- Monte edilecek balıkları seçin ve her balığı sırayla Trikain ile (balık ortamında 0,6 mM) geçici olarak uyuşturun.
- % 1'lik bir agaroz tabakası ile kaplanmış 60 mm çapında bir Petri kabı alın ve diseksiyon mikroskobunun sahnesine yerleştirin.
- Larvaları 1 mL plastik Pasteur pipetle 60 mm kaplı Petri kabına aktarın ve mümkün olduğunca fazla transfer edilen ortamı çıkarın. Daha sonra, hala Pasteur pipeti kullanarak, balığın üzerine 5 ila 10 damla LMA yerleştirin ve LMA ayarlanmadan önce forseps (veya ateşli ince cam iğne) ile yatay olarak yanal görünümde hızla konumlandırın. Optimal görüntüleme için, larvaların LMA'nın üst yüzeyine yakın konumlandırılması arzu edilir.
- Alternatif olarak, 1 mL'lik plastik bir Pasteur pipet kullanarak, larvaları mümkün olduğunca az balık ortamıyla toplayın ve larvaları soğutulmuş LMA'nın alikotuna aktarın. Larvaların LMA ile tamamen çevrili olması için 5 s boyunca batmasına izin verin. Ardından, larvaları alın ve bir damla LMA içinde agaroz kaplı Petri kabına aktarın. Larvaları yukarıda açıklandığı gibi hızlı bir şekilde yönlendirin ve konumlandırın.
- Larvayı hem anteroposterior hem de dorsoventral eksenleriyle yataydan 10 ° 'ye kadar yönlendirin (aşağıdaki 4.6. maddedeki 'Hata ve düzeltmesi üzerine' notuna bakın).
- Larva, agaroz damlasının yüzeyine yatay olarak doğru şekilde monte edilmezse, çıkarın ve yeniden gömün. Larvalar, mikroince 1 mL plastik Pasteur pipet kullanılarak nazik bir emme ile kolayca alınabilir ve LMA, Kimwipes kullanılarak nazikçe çıkarılabilir. Uygulama, montaj prosedüründe gerçekten mükemmelleştirir; Bunu gerçek bir deneyde denemeden önce bazı önemsiz larvaları gömerek bir öğleden sonra geçirin.
NOT: Mikroskop tasarımında: Birçok laboratuvar, bir kapak kapağı ile görüntüleme için ters çevrilmiş konfokal mikroskoplar kullanır. Ters çevrilmiş bir mikroskopta gözlem için bir örtü altında agarozda tutulan balıkların tekrar tekrar gömülmesi ve çıkarılmasının, tekrarlanan tarama sırasında, dik bir mikroskopla tarif edilen prosedürden daha fazla örnek kaybına yol açtığını bulduk. Bu nedenle varsa dik bir sistem kullanılması önerilir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli verilerin anahtarı, burada tartışılamayacak kadar büyük bir konu olan objektif ve tarama parametrelerinin doğru seçilmesi ve kullanılmasıdır.
- Larva, agaroz damlasının yüzeyine yatay olarak doğru şekilde monte edilmezse, çıkarın ve yeniden gömün. Larvalar, mikroince 1 mL plastik Pasteur pipet kullanılarak nazik bir emme ile kolayca alınabilir ve LMA, Kimwipes kullanılarak nazikçe çıkarılabilir. Uygulama, montaj prosedüründe gerçekten mükemmelleştirir; Bunu gerçek bir deneyde denemeden önce bazı önemsiz larvaları gömerek bir öğleden sonra geçirin.
3. Konfokal tarama
- LMA ayarlandığında, çanağı yaklaşık 10 mL Trikain içeren balık ortamı ile doldurun. Konfokal yığınları yakalamayı planlıyorsanız, bazı agaroz şişmeleri meydana geldiğinden, taramaya devam etmeden önce monte edilmiş balığın en az 10 dakika dinlenmesine izin verin.
- Numune kabını konfokal sistemin aşamasına yükleyin, larvayı bulun ve istenen somite odaklanın. Somite 17, anal havalandırma deliğine yakın lokalizasyon kolaylığı ve görüntüleme kolaylığı nedeniyle seçilebilir. Anteriordan somitleri sayarak kontrol edin.
NOT: İlk somit kulağın arkasına kaynaştırılır ve ön sınırı yoktur, ancak çizgili kas liflerine sahip olduğu kolayca gözlemlenebilir. - Üst (yani cildin hemen üstünde) ve alt (yani, notokordun hemen altında, balık hafifçe çarpık monte edilmiş olsa bile, tüm somiti içerecek şekilde) tanımlayarak bir Z-yığınını yakalamak için ayarlanmış gibi ayarlayın. Hem sol hem de sağ taraflar istenildiği gibi yakalanabilir. Bu, tüm hızlı YZ taramalarının istenen bölgeleri yakalamasını sağlayacaktır.
- Aşağıdaki gibi bir XY görüntüsü yakalayın. Konfokal yazılımın izin verdiği şekilde tarama alanını balıklara göre yönlendirin. Balıkları, görüntülenen X eksenine paralel anteroposterior eksen ve Ek Dosya 1'de gösterildiği gibi alanın merkezinde somit 17 ile dorsoventral eksen Y eksenine paralel olarak konumlandırın. En üstteki miyotomda, tüm epaxial ve hypaxial somit yarımlarının dikey ve yatay miyosepta ile birlikte görülebildiği ve yüksek çözünürlüklü bir XY görüntüsü yakaladığı orta seviyeli bir düzleme odaklanın. Görüntüyü adlandırmayı ve kaydetmeyi unutmayın.
- Aşağıdaki gibi bir veya daha fazla YZ görüntüsü yakalayın. Temsili Sonuçlarda (aşağıda) 2 dilimli ve 4 dilimli yöntemlerin doğruluğu karşılaştırılmıştır. 2 dilimli yaklaşımda tek XY ve YZ taramaları kullanılır. 4 dilimli yaklaşımda, miyotom hacminin daha doğru bir tahminini vermek için üç YZ taramasının ortalaması alınır. Konfokal yazılım tarafından isteniyorsa, tarama alanını yeniden yönlendirin.
- Seçilen bir anteroposterior pozisyonda balığın anteroposterior eksenine dik olarak seçilen somit boyunca ventral çizgiye kesin bir dorsal çizin. Z-yığını çizgi taraması gerçekleştirin.
- YZa, YZm ve YZp'yi yakalamak için seçilen miyotom boyunca tanımlanmış anteroposterior pozisyonlarda YZ hattı taramasını üç kez tekrarlayın. Temsili sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu görüntüleri adlandırın ve ilgili XY görüntüsüyle birlikte kaydedin.
NOT: YZ düzlemlerinin seçiminde: Miyotom V şeklindedir ve formu büyüme sırasında değişir. 4 kesitli yöntemle miyotom 17 hacminin en doğru değerlendirmesini elde etmek için, YZa'yı miyotomun ön ucuna, YZp'yi dorsal ve ventral ekstremitelerde miyotomun arka uçlarına ve YZm'yi YZa ile YZp arasında yarıya kadar konumlandırın . Somitin düzgün bir şekilde inceldiğini varsayarsak, her YZ bölümünden alınan ölçümlerin ortalaması miyotomu bir bütün olarak temsil edecektir. 2 dilimli yöntem için, tek YZ taraması, yatay miyoseptumun arka ucuna yerleştirilmelidir, bu da kabaca ilgilenilen miyotomun anteroposterior merkezine (YZm gibi) karşılık gelir. Alternatif olarak, yatay miyoseptumun ön, orta ve arka kısımlarında üç YZ kesitinden oluşan bir set alınabilir, ancak aşağıda gösterildiği gibi, bu ölçüm miyotom hacmini biraz fazla veya az tahmin edecektir (miyotom sivrilmesine bağlı olarak sırasıyla rostral ve kaudal somitler için). Temel olarak, YZ dilim düzlemlerinin balıklar ve deneyler arasında konumlandırılmasındaki tutarlılık, tekrarlanabilirliğin anahtarıdır.
4. Analiz
- Miyotom balık boyunca derecelendirilmiş bir şekilde boyut değiştirdiğinden, karşılaştırmalı çalışmalarda daima aynı somit ile çalışın.
- Miyotom hacmini ölçmek ve hesaplamak için, konfokal yazılımı (Zeiss ZEN mikroskop yazılımı kullanılarak oluşturulan .lsm dosyaları gibi) veya Fiji/ImageJ gibi açık kaynaklı evrensel görüntü analiz yazılımını kullanın.
NOT: Dosya biçimlerini değiştiriyorsanız, Z-adım boyutunun doğru aktarıldığından emin olun, çünkü tüm yazılımlar özel konfokal dosya biçimlerini doğru okuyamaz. Örneğin, bir ZEN satır tarama görüntüsünü Fiji'ye içe aktarmak için, önce Dosya/Dışa Aktar komutunu kullanarak Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde .tif olarak dışa aktarın - tek düzlem biçimi, ardından Fiji'ye içe aktarın. YZ scan.lsm doğrudan Fiji'de açılabilse de, elde edilen YZ görüntüleri, Z adım boyutunun yanlış değerlendirilmesi nedeniyle genellikle Z boyutunda sıkıştırılır. - ZEN kullanarak analiz
- İlk olarak, XY scan.lsm dosyalarını ZEN'de açın. Grafikler sekmesine gidin ve Çizgi aracını seçin. Tüm miyotom uzunluğunu kapsayan iki dikey somit 17 miyoseptası arasında bir çizgi çizin (balığın anteroposterior eksenine paralel). Ölçümün değerlerini görmek için M kutusunu işaretleyin (Uzunluk = 89,71 μm, Ek Dosya 2'ye bakın).
- YZ scan.lsm dosyalarını açın. Grafikler sekmesi altında, Kapalı Bezier aracını seçin. Miyotomun çevresini çizin. Tamamlandığında, M kutusunu işaretleyin, bu ölçümün değerini gösterir (Alan = 11980.01 μm2, Ek Dosya 3'e bakınız).
- Her ölçümün değerlerini manuel olarak bir e-tabloya kaydedin. CSA ölçümlerinin ortalamasını gerektiği gibi alın. Miyotomun hacmi Hacim = Miyotom uzunluğu x CSA, yani 89.71 μm x 11980.01 μm2 = 1.075 x 106 μm3 olarak hesaplanabilir.
- Fiji/ImageJ kullanarak analiz
- XY scan.lsm dosyalarını Fiji/ImageJ içinde açın. Doğrudan Fiji'de açılan XY görüntülerinin, olması gerektiği gibi doğru ölçekte kalibre edilip edilmediğini kontrol edin.
- Simgelerden Düz Çizgi aracını seçin. Adım 4.3.1'de açıklandığı gibi somit 17'nin uzunluğu boyunca bir çizgi çizin. Analiz Et'e giderek ölçüm parametrelerini ayarlayın, ardından Ölçümleri Ayarla...'yı seçin ve aşağıdaki Alan ve Etiketi Görüntüle kutularını işaretleyin. Ölçmek için, M kısayol tuşuna basmanız veya Analiz menüsüne gidip Ölç'ü seçmeniz yeterlidir. Ortaya çıkan bir açılır pencere tüm ölçüm değerlerini listeler (yani, Uzunluk = 90,023 μm; Ek Dosya 4'e bakın). Sonuçlar .csv şeklinde kaydedilebilir ve sonraki analizler için Microsoft Excel veya benzerlerinde açılabilir.
- YZ görüntülerinde CSA'yı ölçmek için, adım 4.2'de açıklandığı gibi YZ görüntülerini .tif biçiminde açın.
- YZ .tif görüntülerini, dışa aktarıldıklarında kalibre edilmedikleri için kalibre edin. Kalibrasyon parametreleri, seçilen görüntülerin Bilgisi'ne giderek ZEN'de elde edilebilir: Scaling X (0.489 μm) ve Scaling Z değerlerini (0.890 μm; bakınız Ek Dosya 5) kaydedin. Ardından, görüntüler Fiji'de açıkken, Görüntü'ye gidin ve Özellikler...'i seçin. Piksel genişliği ve piksel yüksekliği için 0,489 μm ve Voksel derinliği için 0,890 μm girin. YZ görüntülerinin tekrarlanan ölçümü bekleniyorsa kalibrasyonu evrensel olarak uygulamak için Global kutusunu işaretleyin (Ek Dosya 6'ya bakın).
NOT: Tüm YZ görüntülerinin aynı tarama parametreleri kullanılarak yakalandığından emin olun; Fiji/ImageJ'yi yeniden başlatın veya yeni bir kalibrasyon seti gerekiyorsa kalibrasyon değerlerini değiştirin. - Kalibre edilmiş YZ görüntülerinin CSA'sını ölçmek için, simgelerden Poligon Seçimleri aracını seçin. Somitin çevresini çizin ve ölçümün değerlerini ortaya çıkarmak için M düğmesine basın ( Alan = 11980.395 μm2; bakınız Ek Dosya 7). Miyotomun hacmi Hacim = Miyotom uzunluğu x CSA, yani 90.023 μm x 11980.395 μm2 = 1.079 x 106 μm3 olarak hesaplanabilir.
- Ölçümleri diğer XY ve YZ görüntülerinde tekrarlayın. Tutarlılık için deneysel bir seri içindeki tüm ölçümler için aynı yazılımın kullanılması önerilir. Her yazılımdan elde edilen hacim tahmini benzerdir, ancak farklı çizim araçları nedeniyle aynı değildir, örneğin, ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 ve Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3. Miyotomun iki zaman noktası (yani, 3 ila 4 dpf) arasındaki büyümesi şu şekilde hesaplanabilir: (Hacim 4 dpf - Cilt 3 dpf)/ Cilt 3 dpf ×% 100.
NOT: Hata ve düzeltilmesi üzerine. Montaj sırasında, balıklar sırasıyla sapma ve yuvarlanmayı önlemek için sagital düzlemi (yani anteroposterior ve dorsoventral eksenler) ile yataya mümkün olduğunca yakın yönlendirilmelidir. Bunun nedeni, hem XY taramasından ölçülen miyotom uzunluğu L'nin hem de bir YZ taramasından ölçülen CSA'nın, balıkların eğik anteroposterior montajı nedeniyle sapma (dorsoventral eksen etrafında rotasyon) göstermesi durumunda aşırı tahmin edilmesidir. Montaj sırasında ne eğim ne de rulo, bölüm 3'te açıklandığı gibi taramadan sonraki ölçümleri etkilememelidir. Bununla birlikte, dorsoventral rotasyon (rulo) görüntü kalitesini düşürür. Basit trigonometri, 10 ° 'ye kadar sapmanın hacim ölçümünde% 3 hata vereceğini, ölçülen L ve CSA'nın her birinin (cosq) -1 ile orantılı olarak arttığını gösterir; burada q, anteroposterior yataydan (yaw) uzak açıdır. 15 ° ve 20 ° kapalı, sırasıyla% 7 ve% 13 fazla hacim tahminleri verecektir.
Notochord silindirik olduğundan, tüm notokordun YZ taramasına dahil edilmesi, majör ve minör eksenlerin oryantasyonu ve büyüklüğünden eğikliğin açısını ve derecesini hesaplamak ve böylece doğruluğu en üst düzeye çıkarmak için ölçülen L ve CSA'yı düzeltmek için kullanılabilir. Düzeltilmiş CSA = Ölçülen CSA x Notochord minör eksen/Notochord majör ekseni. Düzeltilmiş L = Mikroskop Z yönünde ölçülen L x Notochord minör eksen/Notochord ekseni.
Başka bir husus, L'nin ek olarak düzeltilmesine izin verir. Miyotom büyüdükçe, koronal düzlemde (dorsoventral eksene normal) çarpıktır, böylece medial miyotom lateral miyotomun biraz önündedir. Dorsaldan bakıldığında, sol ve sağ taraflardaki dikey miyosepta, ön tarafı işaret eden geniş bir chevron oluşturur. Eğer sapma düşükse, bu morfoloji L ölçümünü etkilemez. Ancak sapma önemliyse, trigonometrik düzeltme zorlaşır ve daha iyi bir yaklaşım, ön ve arka dikey miyoseptanın yatay miyoseptumdaki notokordla buluştuğu iki noktanın XYZ koordinatlarını tahmin ederek Gerçek L'yi doğrudan ölçmektir. Basit trigonometri, bu koordinatlardan Gerçek L'nin L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2] olarak hesaplanmasına izin verir. Bu son yaklaşımın zayıf yönleri, a) noktaların seçiminin operatöre göre değişebilmesi ve b) seçilen noktaların görsel kaydının tutulmamasıdır. Bu husus CSA düzeltmesini etkilemez.
5. İsteğe bağlı yöntem: Kas elektriksel aktivitesini çıkarın ve yeniden tanıtın
- Bir stimülasyon odası oluşturun.
- 6 x 35 mm'lik bir kuyu plakası alın, dar bir havya kullanarak her bir kuyucuğun her iki tarafında iki küçük açıklık (<5 mm çapında, 1 cm arayla) oluşturun (bkz. Şekil 1).
NOT: Sıcak havyayı dikkatli bir şekilde kullanın ve buharın solunmasını önlemek için isterseniz bir duman davlumbazında çalışın. - Her bir kuyucuğun açıklıklarından bir çift gümüş veya platin tel (~ 20 cm uzunluğunda) geçirin (bkz. Şekil 1). Yeniden kullanılabilir yapışkan malzeme (örneğin, BluTack), telleri yerinde tutmak ve teller arasında 1 cm'lik bir ayrım sağlamak için açıklıkların yakınına uygulanabilir (bkz. Şekil 1).
- 6 x 35 mm'lik bir kuyu plakası alın, dar bir havya kullanarak her bir kuyucuğun her iki tarafında iki küçük açıklık (<5 mm çapında, 1 cm arayla) oluşturun (bkz. Şekil 1).
- 3 dpf'de balıkları üç koşula ayırın: balık ortamı Kontrol, Aktif Değil ve Aktif Değil + Stim.
- İnaktif ve İnaktif + Stim grupları için, larvaları döllenmeden 72 saat sonra (hpf) Trikain (0.6 mM) ile uyuşturun.
NOT: Referans38'i takiben, trikain stoğunun dondurulmuş alikotları çözülür ve balığa eklenmeden önce seyreltilir (40 μL / mL balık ortamı, 0,6 mM'lik son konsantrasyona). Bazı balıklar yüksek dozlarda alabileceğinden, balık içeren suya doğrudan trikain eklemeyin. Trikain stoğu bir ay içinde kullanılmalı ve asla tekrar dondurulmamalıdır. - Balık ortamı için Kontrol balığı, anestezi olmadan bırakın.
- İnaktif ve İnaktif + Stim grupları için, larvaları döllenmeden 72 saat sonra (hpf) Trikain (0.6 mM) ile uyuşturun.
- Trikain maruziyetinin başlamasından sonra seçilen zamanlarda (yani, 80 hpf'de), Inactive + Stim grubunu stimülasyon için hazırlayın.
- 60 mL% 2 agaroz (60 mL balık ortamında 1.2 g agaroz tozu) hazırlayın ve mikrodalga kullanarak tamamen eritin, soğutun, trikain ekleyin ve stimülasyon odasının her bir oluğuna 4 mL dökün (Şekil 1).
- Hemen elektrotların arasına özel yapım 4 delikli taraklar ekleyin (istenen boyutlardaki plastiklerin (örneğin, polipropilen) kesilmesi ve Superglue kullanılarak birbirine yapıştırılmasıyla oluşturulur; bkz. Şekil 1). Jelin ayarlanması için 10 dakika bekleyin. Dört dikdörtgen kuyucuk oluşturmak için tarakları dikkatlice çıkarın.
- Her bir kuyuyu trikain suyuyla doldurun ve bir mikropipet kullanarak her bir kuyucuğa, anteroposterior eksenleri elektrotlara dik olacak şekilde tek bir anestezik Inactive + Stim larvası yerleştirin (bkz. Şekil 1).
- Diseksiyon floresan mikroskobu altında, her bir balığın odanın her bir kuyucuğunda tamamen anestezi uygulanıp uygulanmadığını kontrol edin.
- Ayarlanabilir bir elektrofizyolojik desen üreten uyarıcıyı, odanın bir tarafındaki elektrotların her birine bağlı timsah klipslerini kullanarak bir Polarite Kontrolörü aracılığıyla odaya bağlayın (bkz. Şekil 1).
NOT: Polarite kontrolörü, elektrolizi ve elektrotların korozyonunu önlemek için polariteyi her 5 sn'de bir tersine çevirmek için kullanılır. - Balıkları teşvik edin. Örneğin, 200, 20 V darbeli bir trene sahip 1'ler, 0.5 ms darbe süresi ve 4.5 ms darbe ayrımı ile, her 5 s'de bir etkili bir tekrarlanan-tetanik kasılma direnci rejimi verir.
- Balıkların uyarıldığını doğrulamak için mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin; örnek elektriksel uyaran, her 5 saniyede bir, gözle görülür bir bilateral kasılmaya ve hafif bir harekete neden olmalıdır.
- Bir direnç / yüksek kuvvet rejimi için, balıkları 5 dakikalık bir süre boyunca, üç kez, her bir nöbet 5 dakikalık dinlenme ile ayrılarak yüksek bir frekansta uyarın.
NOT: Odanın bir tarafındaki balıklar dinlenirken, timsah klipsleri odanın diğer tarafındaki elektrot çiftine bağlanabilir ve bu ek balıklar uyarılabilir. - Uyarımdan sonra, balıkları plastik bir pipetle hafifçe yıkayarak her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve taze trikain içeren balık ortamında inkübatöre geri dönün.
- Üçlü suyu odanın içinden dökün ve agarozu her bir kuyucuktan kesmek ve çıkarmak için forseps kullanın. Kuyuları musluk suyuyla durulayın ve kurumaya bırakın.
NOT: Gümüş tel elektrotlar kullanılıyorsa, bazen bir stimülasyon deneyinden sonra telin yüzeyinde gümüş oksit birikebilir. Gümüş oksit gümüşten daha az iletken olduğundan, tekrarlanabilirliği korumak için, kurulumu yeniden kullanmadan önce Kimwipes kullanarak gümüş oksidi telden dikkatlice ovalayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Somit hacminin hızlı ve hassas bir ölçümü
Zebra balığı larvalarında kas büyümesinin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlayan bir numune hazırlama, veri toplama ve hacimsel analiz yöntemi açıklanmaktadır. Kas büyüklüğü, plazma zarlarında membran hedefli GFP (β-aktin:HRAS-EGFP ) veya mCherry (α-aktin:mCherry-CAAX ) ile etiketlenmiş balıklar kullanılarak canlı hayvanlarda ölçülebilir. Larvalar trikain kullanılarak geçici olarak uyuşturuldu, düşük erime noktalı agaroza monte edildi ve konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Somite 17, gövde-kuyruk arayüzü31'deki erişilebilirliği göz önüne alındığında kas büyüklüğünün analizi için seçildi. Uygulamada, teoride olduğu gibi, miyotom hacmi, miyotom uzunluğunun (L) ve üç kesitsel alan ölçüsünün (CSA) ortalamasının ürünü olarak hesaplanabilir (4 dilimli yöntem olarak adlandırılan Şekil 2A).
Bu yöntemi doğrulamak için, canlı zebra balığı larvalarının tüm miyotom konfokal Z-yığınları (Şekil 2B) elde edildi ve her dilimdeki (80-100 dilim) somit 17 profil alanlarının toplamının dilimler arası mesafe (1-1.2 μm) ile çarpılmasıyla somit hacmi hesaplandı. 4 kesitli ve tam yığınlı hesaplama yöntemleri arasında güçlü bir korelasyon gözlenmiştir (Şekil 2C). Bununla birlikte, 4 dilimli yöntem genellikle biraz daha büyük bir hacim tahmini verdi (ortalama olarak ~% 2 daha büyük) (Şekil 2D). Bu fark, a) hatalı bir şekilde büyük hacim ölçümü veren örneklerin eğikliğinden veya b) zebra balığı miyotomlarının anteroposterior eksen boyunca konik olduğu ve hayvanın kuyruğuna doğru daha küçük olduğu gözleminden kaynaklanabilir. YZa, YZm ve YZp CSA ölçümleri somit 17 miyotom chevronunun ön kısmına doğru olduğundan (Şekil 2A), ikinci yorum somit 16 ve 18 miyotomlarının hacimsel analizi ile test edilmiştir. Her somit, arkadakine göre yaklaşık% 7 daha büyüktü (Şekil 2E). Daha ileri analizler, epaxial ve hypaxial yarımların yatay miyoseptumda (YZm) buluştuğu somitin ortasında bulunan ve XY diliminde bulunan sadece tek bir YZ ölçümü gerektiren 2 dilimli bir yöntemin, miyotom hacminin makul derecede doğru bir tahminini verdiğini ortaya koymuştur (Şekil 2F, G). 2 dilimli yaklaşım, zaman kısıtlamaları taranabilecek balık sayısını sınırladığında daha hızlı veri toplama sağlar. Özetle, bu veriler canlı zebra balığı larvalarında miyotom hacminin hızlı ve doğru bir şekilde ölçülebileceğini göstermektedir. Tek larvalar, tekrar tekrar, bu yöntemle 6 günlük bir süre boyunca başarıyla ölçüldü.
Tanımlanmış bir doku biriminin büyümesinin karşılaştırmalı çalışması için, tarif edilen yöntem güvenilir ve kesin hacim tahminleri sağlar. Bununla birlikte, doğru mutlak hacimler elde etmek için, bir dizi değişiklik uygulanabilir. İlk olarak, görüntüleme sırasında daha iyi enine YZ ve parasagittal XY dilimleri elde etmek için çanak veya mikroskop aşamasının eğilmesiyle veya YZ dilimlerinde notokord profili kullanılarak eğik montajın neden olduğu hatalar için düzeltme yapılabilir; kesitsel minör eksen, silindirik notokordun gerçek çapını ortaya çıkarırken, ana ekseni eğikliğin açısını ve büyüklüğünü ortaya koymaktadır (bkz. yukarıdaki madde 4.6'daki Not). İkincisi, tarama sırasında XY ve YZ kesitlemenin yeri, istenen miyotom (lar) ı doğru bir şekilde yansıtacak şekilde seçilmelidir. (Yukarıdaki madde 4.6'daki Not'a bakınız). Bununla birlikte, miyotom köşeli ayraçlarının formunun gelişim aşamasına bağlı olarak değiştiğini ve YZ taramalarını seçerken bunun dikkate alınması gerektiğini unutmayın. Son olarak, miyotom 17'deki değişikliklerin eksen boyunca kas büyümesini yansıtıp yansıtmadığını belirlemek için, gövde veya kuyruk bölgelerine daha fazla miyotomlar tarif edilen yöntemle ölçülebilir.
Tekrarlanan ölçümler somit büyümesini ortaya koyuyor
Tarif edilen yöntemin bir avantajı, tek balıklarda tekrarlanan analizlerin kolaylığıdır. Bireysel embriyolar ve larvalar, belirgin uzun vadeli etkilere maruz kalmadan tekrar tekrar gömülebilir, ölçülebilir ve serbest bırakılabilir (Şekil 2H). Miyotom hem L'de hem de CSA'da 2 ila 5 dpf arasında saptanabilir şekilde büyür ve hacimde sürekli artışa yol açar (Şekil 2H). Büyüme bu şekilde 1 ila 8 dpf arasında görüntülendi ve larvalar da görüntülemeden sonra serbest bırakıldı ve yetişkinliğe kadar büyüdü. Geç larva dönemine kadar yapılan analizlerin mümkün olması beklenmektedir, ancak tekrarlanan görüntülemenin beslenme davranışı üzerindeki etkilerinin, görüntülenmeyen kardeşlerle karşılaştırıldığında dikkatlice izlenmesi gerekecektir. Önemli olarak, pigmentasyonun gelişimi görüntülemeyi gizleyebilir. Pigmentasyon düzgün yönlendirilmiş balıklarda bir sorun olmasa da, melanofor çizgileri gerekli ölçümleri engellemediğinden, eğik olarak monte edilmiş numunelerde pigment daha sorunlu olabilir. Roy;mitfa39 gibi pigmentasyon mutant hatlarının kullanılması beklenmektedir, bu da uygulanabilir konfokal tarama derinliğinin sınırlarına ulaşılana kadar büyüme ölçümlerinin zaman penceresini uzatacaktır.
Tarif edilen prosedürün bir başka avantajı, kısa süreler boyunca tüm miyotomlarına kıyasla tek liflerin büyümesinin ayrıntılı analizinin kolaylığıdır. DNA enjeksiyonu yoluyla liflerin mozaik etiketlenmesiyle, 4 saat boyunca bireysel olarak tanımlanmış liflerde nükleer kazanım ve büyümeyi tespit etmek ve daha sonra daha sonraki zamanlarda yeniden analiz edilmesine izin vermek için bir yöntem geliştirilmiştir (Şekil 2I). Dahası, tüm miyotomun büyümesi 12 saat veya daha az26 saat boyunca ölçülebilir (ve veriler gösterilmemiştir). Aynı balığı tekrar tekrar ölçerek, bireyler arası değişkenlik ortadan kaldırılır ve az sayıda hayvan istatistiksel olarak sağlam sonuçlar verebilir26.
Somit hacmini değiştiren manipülasyonlar kolayca tespit edilebilir
Mevcut protokol, kişinin değiştirilmiş fiziksel hareketsizlik gibi çeşitli biyolojik ve fizyolojik koşullar altında kas büyümesindeki değişiklikleri sorgulamasına izin verir. Voltaj kapılı Na+ kanalları40'ı inhibe ederek sinir aksiyon potansiyellerini bloke eden anestezik trikain, β-aktin:HRAS-EGFP larvalarında kas hareketsizliğini indüklemek için kullanıldı. Daha önce26'da gösterildiği gibi, üçüncü ve dördüncü dpf arasındaki 24 saat boyunca hareketsizlik, larva kas büyümesinin aktiviteye bağlı olduğunu gösteren miyotom hacmini büyük ölçüde azaltmıştır (Şekil 3A). Hareketsizliğin etkisi, mCherry-CAAX (transgenik bir çizgide veya mRNA enjeksiyonu ile) veya larvaların BODIPY boyasına gece boyunca daldırılması (Şekil 3A) gibi somitin yapısını ortaya çıkaran diğer tespit yöntemleri kullanılarak da araştırılabilir. İkinci yaklaşım, balıkları transgenik arka planlara geçirme veya embriyo enjekte etme ihtiyacını ortadan kaldırırken, BODIPY'nin toksisitesi nedeniyle tekrarlanan ölçümler için kullanılamaz. Böylece, mevcut yöntem, kas dokusunun hacmindeki değişiklikleri tekrar tekrar ölçmeye izin verir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, genetik işaretleme yöntemleri, miyotom hacminin tekrarlanan ölçümlerini yapmak için kullanılabilir ve bireysel balıklarda birbirini izleyen günlerde kas boyutundaki değişimin izlenmesine izin verir. Aynı gelişim aşamasındaki bireysel balıklar ve bütün yumruklar mutlak miyotom hacminde farklılık gösterdiğinden (Şekil 3A; belki de yumurtaların büyüklüğü veya sağlığı nedeniyle), her bireyin büyümesini ölçme yeteneği, eşleştirilmiş örnek istatistiksel analizlere izin vererek bireysel varyasyonun etkilerini azaltır. Aynı balığın tekrar tekrar ölçülmesi, etkileri sağlam bir şekilde tespit etmek için gereken balık sayısını azaltır. Bu etkiyi göstermek için, aktif ve inaktif larva popülasyonlarında her bireyin 3 ila 4 dpf arasındaki büyümesini analiz etmekten elde edilen sonuçlar, 4 dpf'de yapılan miyotom boyutunun sadece tek bir ölçüsü kullanılarak aynı iki popülasyonun analizi ile karşılaştırılmıştır. Yatmadan yatmaya, miyotom hacmini 4 dpf'de ölçerken, her birey için 4/3 dpf hacminin ölçülmesine kıyasla miyotom boyutunun belirgin azalmasında daha büyük bir değişiklik gözlenmiştir (Şekil 3B). Yalnızca 4 dpf ölçümünde, 4/3 dpf yöntemine (%78-%89) kıyasla daha geniş bir azalma aralığına (%68-%91) ve iki ölçü arasındaki zayıf korelasyona dikkat edin. Beklendiği gibi, her bir değerlendirmede 13 biyolojik replikasyonun tümündeki ortalama azalma benzer olmasına rağmen (Şekil 3C), 4/3 dpf yöntemi için 82.62 ±% 1.01 (ortalama ± SEM, n = 13) ve yalnızca 4 dpf yöntemi için 82.31 ±% 1.92 olmasına rağmen, yalnızca 4 dpf yöntemiyle ilgili tahmini hata, 4/3 dpf yöntemiyle neredeyse iki katıydı. Bu nedenle, tekrarlanan ölçümlerle bireysel büyümeyi ölçmek, daha önce gösterildiği gibi, aynı tabakadaki balıklar arasındaki boyut değişkenliğini ortadan kaldırarak daha doğru bir yöntemdir26. Bununla birlikte, miyotom hacmini sadece 4 dpf'de ölçerken hareketsizliğin neden olduğu miyotom hacmindeki azalmada anlamlı bir fark gözlenmediğinden (Şekil 3C), veriler ~ 6-8 balığın bir döşeme içindeki bireyler arası boyut farkının ortalamasını almak için yeterli olduğunu göstermektedir. Açıkçası, boyut değişiklikleri küçük olduğunda 4/3 dpf yöntemi tercih edilir.
Büyümenin hücresel temelinin analizi
Myotome CSA, kas lifi sayısı ve lif büyüklüğü ile belirlenir. Lif sayısı, üç YZ kesitindeki (YZ a, YZ m, YZp) hızlı ve yavaş liflerin sayısını sayarak tahmin edilebilir. Her ne kadar iki bitişik miyotomun bölgeleri bu tür YZ bölümlerinde bulunsa da, çoğu bölümde dikey miyosepta (VM) varlığı ile gösterildiği gibi (Şekil 2A), bu sayımlar lif sayısını doğru bir şekilde yansıtmaktadır. VM'lerde aşırı sayım, VM'deki her bitişik segmentten gelen fiber çiftlerinin sivrilmesi nedeniyle oluşur (Şekil 4A). Bu tür fazla sayım, aşağıdaki denklem kullanılarak açıklanabilir: Fiber sayısı = Toplam lif sayısı - (VM ile temas eden lifler) / 2 referans33. Ayrıca, ortalama lif hacmi, miyotom hacminin lif sayısına bölünmesiyle belirlenebilir. Bu analizleri, aktivitenin büyümenin her iki hücresel yönünü de kontrol ettiğini ortaya koymak için kullandık (Şekil 4B, C).
Şekil 2A'dan, liflerin miyotom boyunca boyut olarak değiştiği açıktır, bu da hesaplanan ortalama lif hacmi ölçümlerine yansıtılmayan bir gerçektir. İki balıktan her bir somit 17 lifinin etrafına çizilerek, ölçülen lif kesit alanının 28 μm 2 ila217 μm2 arasında değiştiği gösterilmiştir (Şekil 4D). Bununla birlikte, gerçekte, birçok lif miyotom içinde eğik olarak açılıdır, bu nedenle bu tür CSA ölçümleri, uzun eksenine dik bir lifin gerçek CSA'sını yansıtmaz. Tersine, miyotom içindeki liflerin değişen açıları nedeniyle, anteroposteriorda hizalanmayan oryantasyonlarda çalışan tüm lifler, miyotom uzunluğundan farklı uzunluklara sahiptir. Sadece miyotomun tek lif hacimlerine tam olarak bölümlenmesiyle veya her bir lifin eğiklik açısını ölçtükten sonra hesaplanarak atlatılabilen bu uyarılara rağmen, ölçülen CSA'lar her balıkta lif büyüklüğü çeşitliliğinin bir tahminini sağlar. Örneğin, bireysel lifler CSA'da hareketsizlikle azaldı ve aktif (anestezi yapılmamış) kontrol larvalarına göre kümülatif frekans eğrisinde sola kaymaya neden oldu (Şekil 4E). Aktif olmayan balıklar aktif balıklardan ~ 10 daha az lif içerdiğinden (Şekil 4B), aktif anestezi yapılmamış balıklardan elde edilen en küçük 10 lif (yenileri oldukları varsayımıyla) veya en büyük 10 lif (alternatif aşırı olarak) karşılaştırmadan çıkarılmıştır, bu da miyotom hacminin çoğunun lif büyümesinin eksikliğinden kaynaklandığını göstermiştir. yeni lif oluşumunun başarısızlığından ziyade (Şekil 4F). Birlikte ele alındığında, bu veriler tarif edilen yöntemin fiziksel aktivitenin kas dokusunun oluşumu ve büyümesi üzerindeki rolünün ayrıntılı bir şekilde araştırılmasına izin verdiğini göstermektedir.
Elektriksel stimülasyon ile aktivitenin yeniden uygulanması
Kas büyümesi için fiziksel aktivite gereklidir (Şekil 3A). Aksi takdirde aktif olmayan larvalarda elektriksel stimülasyon yoluyla kas kasılmalarını yeniden empoze etmek için güçlü bir kasılma yanıtı uyandıran bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 5A, Ek Dosya 8). Kasları maksimuma çıkarmak için burada (Şekil 5B) kesin stimülasyon parametreleri açıklanmasına rağmen, protokol kas aktivasyonunu ve egzersiz dozajını kontrol etmek için değiştirilebilir (akım genliğini, frekansı, nabız süresini vb. Değiştirerek). Böylece, mevcut yöntem, aktivite nöbetleri arasında standartlaştırılmış davranışla kontrollü bir aktivite uyaranı sağlar ve mevcut hayvan egzersiz modellerinin önemli bir sınırlamasının üstesinden gelir18.
Tarif edilen yöntemler, kas büyümesinin çeşitli yönlerini (örneğin, hiperplazi ve hipertrofi) incelemek için zebra balığı larvalarını kullanma potansiyelini göstermektedir. Özellikle, zebra balığı larvalarındaki miyogenezin, farmakolojik olarak indüklenen hareketsizlik ve elektriksel olarak indüklenen kontraktilite yoluyla analize uygun olduğu gösterilmiştir. Yaklaşım, fiziksel aktivitenin in vivo kas büyümesine yol açtığı moleküler mekanizmaların incelenmesine izin verir.
Resim 1: Zebra balığı larvalarına kas elektriksel aktivitesinin yeniden sokulması için bir stimülasyon odasının tasarımı. Elektrotlarla donatılmış 6 delikli bir hücre kültürü plakası,% 2 agaroz jeli içinde yapılan kuyucuklarda larvaların bakımına izin verir. Özel 4 kuyucuklu taraklar, bireysel balık larvalarının konumunu ve yönünü korumak ve elektriksel stimülasyon üzerine kuvvetli seğirme sırasında gümüş tellere temas etmelerini önlemek için agarozda dikdörtgen kuyucuklar (belirtildiği gibi boyutlar) oluşturmak için yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Canlı zebra balığı α-aktin:mCherry-CAAX (A,B,E) veya β-aktin:HRAS-EGFP transgenik larvalarında (H,I) kas hacminin ölçülmesi. Larvalar lateral görünümden görüntülendi ve üst panellerde (A, B, E) DORSAL yukarıdan, ön soldan sola gösterildi. (A) 4 kesitli yöntemde, miyotom hacmi, XY düzleminde (mavi ok) dikey miyosepta (VM) arasında ölçülen somit 17 (L) uzunluğunun, YZ düzlemlerinde (YZm, YZa ve YZp; kesikli sarı çizgiler) ölçülen üç kesitsel alanın (CSA) ortalaması ile çarpılmasıyla hesaplanmıştır. (B) Full Stack yönteminde, canlı bir zebra balığı larvasının bütün bir Z-yığınının her diliminde somit 17 miyotom alanı ölçüldü (sarı ile özetlenen örnekler) ve miyotomal alanların toplamı dilimler arası mesafe ile çarpıldı. (C) 4 dilimli ve Full Stack yöntemleri arasında yüksek uyum. Renkler tek tek β-aktin: HRAS-EGFP (kareler) veya α-aktin: mCherry-CAAX (daireler) balıklarını gösterir. (D) Myotome hacmi, 4 dilimli yöntem kullanılarak hesaplandığında biraz ama önemli ölçüde daha büyüktür. (E) Sivrilen zebra balığı larvalarında, 4 dilimli yöntemle ölçüldüğü gibi, daha fazla ön somit, posterior somitlerden daha büyüktür. (F,G) Üç CSA kesitinin ortalaması (4 dilimli yöntem) veya tek bir YZm CSA (2 dilimli yöntem) kullanılarak yapılan hacim ölçümleri arasında güçlü korelasyon. p-değerleri, eşit varyanslı (D,G) iki kuyruklu t-testinin veya Bonferroni post hoc testleri (E) ile tek yönlü ANOVA'nın sonuçlarını gösterir. ns, önemli değil. (H) β-aktin:HRAS-EGFP ve myog:H2B-mRFP'yi ifade eden üç ayrı balıkta (renklerde) miyotom 16 hacim, uzunluk (L) ve kesit alanının (CSA) 2 ila 5 dpf arasında ölçülmesi. Yeşil bireyin her zaman noktasındaki YZm görüntüleri yukarıda gösterilmiştir. (I) Otomatik sabit eşik segmentasyonu ile ölçülen tek fiber büyümesi. Bir β-aktin:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP balığı, 1-2 hücre aşamasında bir CMV:Cerulean plazmid enjeksiyonu ile mozaik olarak etiketlenmiştir. Somit 10'daki tek bir Cerulean işaretli fiber, Zeiss LSM880 üzerinde tekrar tekrar yüksek çözünürlüklü tam XYZ yığınlarıyla tarandı. Gösterilen görüntüler temsili tek dilimler (solda) ve üç boyutlu parçalı hacmin projeksiyonudur (sağda). Grafikteki her veri noktası, 3 dpf (0 saat), 4 saat sonra ve 5 dpf (54 saat) hızında aynı fiberin tek bir taramasını temsil eder. Tekrarlanabilirliği göstermek için üçlü taramalar yapıldı ve zaman noktası başına bölümlere ayrıldı. Beyaz ok uçları fiber çekirdeklere işaret eder; 3 ila 5 dpf arasında iki çekirdeğin eklendiğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Somitte aktiviteye bağlı kas büyümesi 17. (A) 3 ila 4 dpf arasında trikain (pembe) uygulayarak 24 saat boyunca aktiviteyi inhibe etmek, kardeşler üzerindeki araç kontrollerine kıyasla hem transgenik çizgilerde hem de BODIPY ile boyanmış transgenik olmayan balıklarda miyotom hacmini azaltır (mavi). 4 dilimli yöntemle ölçülen hacim. Sembol şekli, farklı katmanlardan (biyolojik kopyalar) replikasyon deneylerini gösterir. Büyük semboller ortalama ± SEM değerlerini gösterir. Küçük soluk semboller, bireysel çoğalan larvaların hacmini gösterir. (B) Aktif olmayan balıklarda miyotom hacmindeki azalmanın, 4 dpf'de (yalnızca 4 dpf, üst şematik) miyotom hacminin tek bir ölçümü veya miyotom hacmindeki 3 ila 4 dpf (4/3 dpf, alt şematik) arasındaki değişimle belirlenen kontrol kardeşlerle karşılaştırılması. Her sembol, tek bir yataktan ~5 inaktif balıkta 17 miyotomun ortalama hacmini, ~ 5 aktif kontrol kardeşinin ortalama miyotom 17 hacmine bölünmesiyle temsil eder. (C) Aktif olmayan balıklarda kas büyümesindeki ortalama azalmada, sadece 4 dpf veya 4/3 dpf yöntemleriyle ölçüm yaparken hiçbir fark gözlenmemiştir. Barlar içindeki sayılar, analiz edilen toplam balık sayısını temsil eder. p-değerleri, Bonferroni post hoc testleri (A) ile iki yönlü ANOVA veya eşit olmayan varyanslı (C) iki kuyruklu t-testinin sonuçlarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hareketsizlikten kaynaklanan kas büyümesindeki hücresel seviye değişiklikleri. (A) Mavi ve kırmızı miyotomların buluştuğu yerde sivrilen liflerin çift sayımı nedeniyle VM'lerde aşırı sayımın nasıl gerçekleştiğini gösteren şematik. Ortalama lif sayısının 6 olduğunu, ancak gerçek ortalama değerin 5,5 olduğunu unutmayın. Düzeltilmiş sayım daha iyi bir yaklaşım sağlar. (B,C) Lif sayısı (B) ve ortalama lif hacmi (C), aktif olmayan (pembe) larvalara kıyasla azalır. Sembol şekli, farklı katmanlardan (biyolojik kopyalar) replikasyon deneylerini gösterir. Büyük semboller ortalama ± SEM değerlerini gösterir. Daha küçük soluk semboller, bireysel replikasyon larvalarının değerini gösterir. Barlar içindeki sayılar, analiz edilen toplam balık sayısını temsil eder. (D) Tek larvalarda, miyotom 17'deki her lif profili özetlenmiş ve CSA belirlenmiştir. Kutular ortalama ± SEM gösterir. p-değerleri, Bonferroni post hoc testleri (B, C) veya eşit varyanslı (D) iki kuyruklu t-testi ile iki yönlü ANOVA'nın sonuçlarını gösterir. (E,F) Aktif kontrol (mavi) ve inaktif (pembe) larvalarda lif boyutu dağılımını gösteren kümülatif frekans eğrileri. Tüm liflerin (E) karşılaştırılması veya başlangıçta ortaya çıktığı varsayılan küçük veya alternatif uçta büyük liflerin (F) ihmal edilmesinden sonra, lif sayısındaki artışın değil, lif boyutunun öncelikle miyotomun aktiviteye bağlı büyümesini açıkladığını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kısa elektriksel stimülasyon, anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarında tetanik kas kasılmalarını uyandırır. (A) Elektriksel stimülasyonun anestezi uygulanmış bir larvanın 3 dpf'de maksimum kasılmalarını nasıl tetiklediğini gösteren sıralı görüntüler (Ek Dosya 8'deki videodan alınmıştır). Saniye cinsinden zaman ölçeği. Kırmızı kutular, birbirini izleyen üç 1 s stimülasyon treninin başlangıcındaki hareketleri gösterir. Her görüntü 40 ms'lik bir pozlamadır. (B) Her 5 saniyede bir 200 yüksek frekanslı, 20 V elektriksel impulsların verildiği elektriksel stimülasyon rejimini gösteren şema.
Ek Dosya 1: Mikroskop XYZ referans çerçevesine (siyah eksenler) göre mükemmel (sol üstte) ve kusurlu monte edilmiş larvaların yakalanan görüntülerinin şemaları. Miyotom (yeşil), notokord (sarı), nöral tüp (bronz), ölçülen miyotomal parametreler (kırmızı), ölçülen notokord parametreleri (siyah oklar) ve olası veya gerçek balık rotasyonları (mavi). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: ZEN'deki XY görüntülerinden somit uzunluğu ölçümünü gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3: ZEN'deki YZ görüntülerinden CSA ölçümünü gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 4: Fiji / ImageJ'deki XY görüntülerinden somit uzunluğu ölçümünü gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya: YZ görüntüleri için kalibrasyon parametrelerinin ZEN'den çıkarıldığını gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 6: Fiji/ImageJ'de YZ görüntülerinin kalibrasyonunu gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 7: Fiji / ImageJ'deki YZ görüntülerinden CSA ölçümünü gösteren ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 8: Trikain-anestezi uygulanmış 3 dpf larvasının doğrudan elektriksel stimülasyonu (uzunluk 1 s) ile uyarılan kas kasılmasını gösteren temsili video. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, pigmentasyonun görüntülemeye büyük bir engel teşkil etmediği ve geçici anestezi ve/veya immobilizasyonun iyi tolere edildiği aşamalarda veya genetik varyantlarda canlı zebra balığı larvalarının kas hacminin doğru ve etkili bir şekilde tahmin edilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Lazer taramalı konfokal mikroskopiyi kullanmış olsak da, açıklanan yaklaşımlar dönen disk konfokal veya ışık tabakası mikroskobu ve farklı odak düzlemlerinde görüntü yığınları oluşturan diğer yöntemlere uygulanabilir. Doku boyutu ve hücre içeriği tahminine yönelik giderek daha sofistike hale gelen bir dizi yaklaşım açıklanmaktadır. Her yöntemin, ölçülebileceğini gösterdiğimiz avantajları ve sınırlamaları vardır. Doku büyümesini incelemedeki önemli bir sınırlama, büyüme oranları akut olarak uygulanan uyaranlar tarafından katalize edilen bir dizi moleküler veya hücre altı olaya yanıt olarak değiştiğinden, büyüme değişikliklerini gerçek zamanlı olarak analiz etmenin zorluğudur. Dahası, bireysel varyasyon, ayrı bireyler karşılaştırıldığında sorun yaratabilir. Mevcut yaklaşım, tek canlı bireylerde bir günden az süreler boyunca doku büyümesinin ölçülmesine izin vermektedir. Yaklaşımın uygulanması dakika zaman çizelgesinde öngörülebilir.
Açıklanan yöntemler, şimdiye kadar uygulanamayan analizlere izin verir. 4 dilimli yöntemi kullanarak, kas büyüme testinin görüntüleme kısmı, eğitimli bir operatör tarafından bir saat içinde yaklaşık 20 balıklık bir örneklem büyüklüğünde tamamlanabilir. Bu, aynı sayıda balık için en az 3 saat süren (yani üç kat daha uzun) geleneksel Full Stack yönteminin tam tersidir. Sonraki hücre altı analizler için yüksek çözünürlüklü görüntüler gerekiyorsa, Full Stack yöntemi balık başına kolayca 30 dakika gerektirebilir ve bu da benzer bir gelişim aşamasındaki hayvan kohortlarının büyüme tahlillerini imkansız hale getirir. Buna karşılık, 2 veya 4 dilimli yöntemler hızlı ve yüksek kaliteli görüntü yakalamaya izin verir. Görüntü analizini göz önünde bulundurursak, 2 veya 4 dilimli yöntemin operatör zamanından tasarruf etmedeki avantajları (otomatik görüntü segmentasyonunun yokluğunda) Full Stack yöntemine göre muazzamdır. Her balık, Full Stack analizi için yaklaşık 20 dakika gerektirir, ancak 4 dilimli analiz için sadece 3-4 dakika gerekir. Operatör zamanı, neredeyse doğru 2 dilimli yöntem kullanılarak daha da korunabilir. Böylece, tarif edilen yöntem verimlidir ve böylece deneysel tasarımda esnekliği arttırır.
4 veya 2 dilimli yöntemlerin en büyük sınırlaması, somitlerin örtüşen chevron şekli (örneğin, iki komşu somitin bölgelerinin hacmi (örneğin, miyotom 16 ve 17) nedeniyle her iki yöntemin de tahmin edilmesidir. Bunun, YZ dilimlerinin tam olarak nerede seçildiğine bağlı olarak, gerçek miyotom 17 hacmini yaklaşık% 2 oranında fazla tahmin edebileceği gösterilmiştir. Dahası, ölçümler sırasında somit sınırlarının manuel olarak izlenmesi, deneyler arası çok az fark bulunmasına rağmen tahminlerdeki değişikliklere katkıda bulunabilir (veriler gösterilmemiştir). Ölçüm hataları, yüzey alanını daha objektif ve tekrarlanabilir bir şekilde elde etmek için eşikleme, filtreleme ve segmentasyon algoritmaları kullanılarak ele alınabilir. Bununla birlikte, arka plan floresansındaki (LMA'nın gömülmesi ve / veya kalınlığı nedeniyle) ve zaman içinde bireysel larvaların floresan proteinlerinin ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri hesaba katmak için özelleştirmeler gerekecektir. β-actin:HRAS-EGFP hattı gibi kaslara özgü olmayan bir muhabir kullanıldığında bu tür otomatik ölçümlerin daha da zor olacağını unutmayın. Bununla birlikte, birçok koşulda, örneğin, tüm kas dokusunu etkilemesi beklenen farklı tedavilere tabi tutulan balıklar arasındaki manipülasyonların etkilerini karşılaştırırken, yanlışlık önemsiz olabilir. Bununla birlikte, yalnızca miyotom 17'den sayılan lif veya nükleer sayılarla karşılaştırmak için maksimum doğruluk gerekiyorsa, örneğin, 'dilim' yöntemleri geliştirilebilir. Bu, zorlu Full Stack yöntemini kullanarak, ölçülen 4 dilimli hacimleri 0.98 ile çarparak matematiksel düzeltme yaparak veya miyotom 17'nin gerçek CSA'sını daha doğru yansıtmak için YZ CSA taramalarının yerini arkaya taşıyarak elde edilebilir.
Yöntemin ikinci bir sınırlaması, balığın montaj yönüne duyarlılığıdır. Uygulamada, yetenekli operatörler, birçok numuneyi yerleştirmek için hızlı bir şekilde çalışırken bile, çoğu zaman balıkları makul sınırlar içinde yönlendirebilir. Mikroskop aşamasındaki ekipmanda, taramadan önce sapma ve yuvarlanmanın düzeltilmesine izin verecek değişiklikler öngörülebilir. Böyle bir aparat olmadan, ölçülen hacimleri düzeltmek için kullanılabilecek yanlış yönlendirmeyi ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Dahası, yanlış yönlendirme ölçülen hacimdeki değişkenliği artırsa ve böylece küçük etki boyutlarını gözlemleme şansını azaltsa bile, birçok durumda bu tür varyasyonlar kontrol ve deneysel numuneleri benzer şekilde etkileyecektir. Bu nedenle, operatörler sorunun farkındaysa, yanlış pozitif sonuçlar olası değildir.
Tarif edilen yöntemler başlangıçta, çok çeşitli türlerde uzun bir analiz geçmişine sahip bir konu olan kas büyümesinde elektriksel aktivitenin rolünü analiz etmek için uygulanmıştır (18'de gözden geçirilmiştir). Bu amaçla, endojen olarak tetiklenen aktiviteyi bloke etmek için basit yöntemler ayrıntılı olarak tanımlanmış ve zebra balığı larvalarında kontrollü desenli elektriksel stimülasyon ile değiştirilmiştir. Bu yaklaşımın avantajları, nöral geri besleme kontrollerinin kaldırılması40, değiştirilmiş beslenmenin etkilerinin ortadan kaldırılması ve protein devri26 gibi büyüme vekilleri yerine büyümenin kendisi üzerindeki sirkadiyen etkileri analiz etme yeteneğidir. Farklı elektriksel aktivite kalıpları, lif tipini, boyutunu ve metabolizmasını düzenleyen farklı kas tepkilerini tetiklediğinden, 41,42,43,44,45,46,47,48, mevcut yöntemler zebra balıklarını bu tür analizlere açmaktadır.
Açıklanan yöntemler, kas fizyolojisinin, hücre biyolojisinin ve patolojisinin birçok yönünün, nispeten keşfedilmemiş zebra balıklarından yararlanarak benzeri görülmemiş zamansal ve mekansal çözünürlükte analiz edilebileceği bir dizi teknik sunmaktadır. Mevcut yaklaşımlar diğer türlere, vücudun bölgelerine ve gelişim aşamalarına açıkça uygulanabilir. Zebra balığı larvalarının hızlı erken büyümesi, manipülasyonların doku büyümesi ve morfogenez üzerindeki akut etkilerinin tespitini özellikle çekici çalışma alanları haline getirmektedir. Dahası, zebra balığı kasının çeşitli büyüme mekanizmalarını ve kontrollerini memelilerle paylaştığı gösterilmiştir. Zebra balığı, insanlarla kas moleküler genetiğinin, hücrenin ve gelişim biyolojisinin birçok yönünü koruyan omurgalılar olsa da, kas büyümesinin kontrolünde de önemli farklılıklar vardır. Örneğin, yavaş ve hızlı lif türleri balıklarda mekansal olarak daha net bir şekilde ayrılır ve kasın innervasyonu farklılıklar gösterir. Ayrıca, şimdiye kadar, gelişimin yalnızca ilk aşamalarını analiz edebildiğimiz akılda tutulmalıdır. Daha sonraki aşamalarda da benzer analizler öngörülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Hughes laboratuvar üyeleri Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin ve Vladimir Snetkov'un açıklanan protokollerin geliştirilmesi için ve Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau ve Peter Currie'nin plazmidleri veya zebra balığı çizgilerini paylaşma çabalarına derinden borçludur. SMH, Program Hibe G1001029, MR / N021231 / 1 ve MR / W001381 / 1 desteğine sahip bir Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) Bilim Adamıdır. Yüksek Lisans, King's College London'dan MRC Doktora Eğitim Programı Doktora Öğrencisi olarak görev yaptı. Bu çalışma, akademisyen, akıl hocası ve arkadaşı David M. Robinson'un trigonometrik girdilerinden yararlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
