Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

كريسبر / كاس 9 التحرير الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية لتطبيقات العلاج الجيني

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64064
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1
1Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي إجراء زراعة الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPC) الأمثل للتطعيم القوي للخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.

Abstract

كريسبر / كاس 9 هي أداة تحرير جينية متعددة الاستخدامات وفعالة للغاية تم اعتمادها على نطاق واسع لتصحيح الطفرات الجينية المختلفة. إن جدوى التلاعب الجيني للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) في المختبر تجعل HSPCs خلية مستهدفة مثالية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، تفقد HSPCs بشكل معتدل قدرتها على إعادة التوطين وتعدد السلالات في الثقافة خارج الجسم الحي . في هذه الدراسة ، تم وصف ظروف الاستزراع المثالية التي تعمل على تحسين نقش HSPC وتوليد عدد متزايد من الخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي. يعرض التقرير الحالي ظروف الثقافة المحسنة في المختبر ، بما في ذلك نوع وسائط الاستزراع ، ومكملات كوكتيل الجزيئات الصغيرة الفريدة ، وتركيز السيتوكين ، وألواح زراعة الخلايا ، وكثافة الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إجراء محسن لتحرير الجينات HSPC ، جنبا إلى جنب مع التحقق من صحة أحداث تحرير الجينات. للتحقق من الصحة في الجسم الحي ، يتم عرض تسريب HSPCs المحرر جينيا وتحليل ما بعد التطعيم في مستلمي الفئران. أظهرت النتائج أن نظام الاستزراع زاد من تواتر HSCs الوظيفية في المختبر ، مما أدى إلى نقش قوي للخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.

Introduction

إن عدم إمكانية الوصول إلى المتبرعين المطابقين لمستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) في أماكن زرع الخلايا الخيفية والتطور السريع لأدوات الهندسة الوراثية متعددة الاستخدامات والآمنة للغاية تجعل زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية (HSCT) استراتيجية علاجية لاضطرابات الدم الوراثية 1,2. يتضمن العلاج الجيني الذاتي للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPC) جمع HSPCs للمرضى ، والتلاعب الجيني ، وتصحيح الطفرات المسببة للأمراض ، وزرع HSPCs المصححة للجينات في المريض 3,4. ومع ذلك ، فإن النتيجة الناجحة للعلاج الجيني تعتمد على جودة الكسب غير المشروع المعدل جينيا القابل للزرع. تؤثر خطوات التلاعب الجيني والثقافة خارج الجسم الحي ل HSPCs على جودة الكسب غير المشروع عن طريق تقليل تواتر الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل (LT-HSCs) ، مما يستلزم ضخ جرعات كبيرة من HSPCsالتي يتم التلاعب بها جينيا 2،5،6.

يتم حاليا استخدام العديد من الجزيئات الصغيرة ، بما في ذلك SR1 و UM171 ، لتوسيع HSPCs من دم الحبل السري بقوة 7,8. بالنسبة ل HSPCs البالغة ، نظرا لارتفاع إنتاجية الخلايا التي تم الحصول عليها عند التعبئة ، فإن التوسع القوي غير مطلوب. ومع ذلك ، فإن الاحتفاظ بجذعية HSPCs المعزولة في الثقافة خارج الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لتطبيقات العلاج الجيني. لذلك ، تم تطوير نهج يركز على إثراء زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) باستخدام مزيج من الجزيئات الصغيرة: ريسفيراترول ، UM729 ، و SR1 (RUS) 7. تعزز ظروف زراعة HSPC المحسنة إثراء HSCs ، مما يؤدي إلى زيادة تواتر HSCs المعدلة جينيا في الجسم الحي ، وتقلل من الحاجة إلى التلاعب الجيني بجرعات كبيرة من HSPCs ، مما يسهل مناهج العلاج الجيني الفعالة من حيث التكلفة8.

هنا ، يتم وصف بروتوكول شامل لثقافة HSPCs ، جنبا إلى جنب مع ضخ وتحليل الخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب في الجسم الحي على الفئران التي تعاني من نقص المناعة وأجريت وفقا للإرشادات الصادرة عن لجنة أخلاقيات الحيوان بالمعهد (IAEC) ، كلية الطب المسيحية ، فيلور ، الهند. تم جمع عينات الدم المحيطي المعبأ بعامل تحفيز مستعمرة المحببات (G-CSF) من متبرعين بشريين أصحاء بموافقة مستنيرة بعد الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB).

1. عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMNCs) وتنقية خلايا CD34 +

  1. قم بإجراء عزل PBMNC باتباع الخطوات أدناه.
    ملاحظة: بالنسبة لثقافة HSPC في المختبر وتحرير الجينات ، فإن البدء بما لا يقل عن 1 × 106 HSPCs / المجموعة مثالي. بالنسبة لتحليل engraftment في الجسم الحي ، يكون رقم خلية البداية الذي لا يقل عن 5 × 10 6 HSPCs / المجموعة مثاليا إذا كانت المجموعة تحتوي على ثمانية فئران ويتم غرس كل فأر بما لا يقل عن6 × 105 خلايا. للحصول على عدد كاف من PBMNCs (~ 1 × 109) للإجراء ، يوصى بالبدء ب 20 مل من الدم المحيطي المعبأ (mPB).
    1. بعد جمع mPB ، قم بتخفيف 20 مل من mPB باستخدام محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1: 1.
      ملاحظة: قد تختلف كفاءة تعبئة G-CSF بين الأفراد9 ، وبالتالي ، يختلف عدد HSPCs التي تم الحصول عليها من 20 مل من الدم المعبأ بين المتبرعين.
    2. أضف 10 مل من وسط تدرج الكثافة (Lymphoprep ، انظر جدول المواد) إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بطبقة الدم المخفف عبر جوانب الأنبوب بنسبة 1: 2.
      ملاحظة: إمالة أنبوب 50 مل بزاوية 20 درجة أثناء إضافة الدم المخفف يمنعه من الاختلاط مع Lymphoprep ، مما يؤدي إلى فصل واضح لمكونات الدم بعد الطرد المركزي.
    3. جهاز طرد مركزي بسرعة 600 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) بمعدل تسارع 1 م / ث² ومعدل تباطؤ 1 م / ث². تخلص من الطبقة العليا (البلازما) باستخدام ماصة مصلية واحصد الطبقة الملتفة الموجودة في الطور البيني (PBMNCs) فوق الطبقة المتوسطة المتدرجة الكثافة.
      ملاحظة: قم بشفط الطبقة المنتفخة باستخدام ماصة مصلية عن طريق تحريكها برفق على جانبي الأنبوب. تجنب جمع كمية أكبر من الطور البيني أثناء استنشاق الطبقة الملتوية لمنع تلوث المحببات وكرات الدم الحمراء.
    4. انقل PBMNCs إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وقم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام 1x PBS بنسبة 1: 2.
      ملاحظة: قم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام 1x PBS بنسبة 1: 4 إذا تم جمع فائض من الطور البيني أثناء استنشاق معطف بافي.
    5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بمعدل تسارع 9 م / ث² ومعدل تباطؤ 7 م / ث² وتخلص من الطاف باستخدام ماصة مصلية. أضف 30 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء المثلج (انظر الجدول 7) إلى الحبيبات واحتضانها في الثلج لمدة 10 دقائق. تخلط عن طريق قلب الأنبوب كل 2 دقيقة.
    6. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بمعدل تسارع 9 م / ث² ومعدل تباطؤ 7 م / ث² ، وتخلص من المادة الطافية. كرر الخطوات 1.1.5.-1.1.6. حتى يختفي احمرار الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات بوسائط قاعدية (IMDM ، انظر جدول المواد) وقم بإجراء عدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق في غرفة نيوباور10.
      ملاحظة: يمكن استخدام PBMNCs المعزولة على الفور لتنقية CD34 + HSPCs. بدلا من ذلك ، يمكن حفظ PBMNCs بالتبريد وإحيائها عند الحاجة لتخصيب CD34 +. للحفظ بالتبريد ، أجهزة الطرد المركزي 5 × 108 خلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وإضافة 4 مل من وسائط التبريد التي تحتوي على IMDM: FBS: DMSO (انظر جدول المواد) بنسبة 7: 2: 1.
    7. انقل القوارير إلى مبرد تبريد 1 درجة مئوية وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 ساعة. نقل وتخزين cryovials في حاوية النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  2. إحياء PBMNCs المحفوظة بالتبريد.
    1. قم بإذابة نصف المبردات في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية عن طريق الدوران اللطيف لمدة <1 دقيقة. انقل معلق الخلية للكريوفيال إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على IMDM بنسبة 1:10.
    2. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بمعدل تسارع 9 م / ث² ومعدل تباطؤ 7 م / ث² ، وتخلص من الطافي باستخدام ماصة مصلية.
  3. تنقية خلايا CD34 + من PBMNCs باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتنقية باستخدام 1x PBS معقم يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني مصفى (FBS). أعد تعليق حبيبات خلية PBMNC في المخزن المؤقت وفقا للجدول 1.
      ملاحظة: يجب أن يكون المخزن المؤقت Ca+ + و Mg++ مجانا.
    2. انقل معلق الخلية الذي يحتوي على 1 × 108-5 × 108 خلايا من PBMNCs الطازجة أو المحفوظة بالتبريد إلى أنبوب البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: أضف DNase (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل إلى معلق الخلية لمنع تكتل الخلايا. استخدمنا مجموعة متاحة تجاريا لتنقية CD34 تحتوي على كوكتيل الاختيار الإيجابي البشري CD34 وكرات ديكستران السريعة (انظر جدول المواد).
    3. أضف كوكتيل الاختيار الإيجابي البشري CD34 المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) بتركيز 100 ميكرولتر / مل من الخلايا وأعد تعليقه برفق.
    4. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة وأعد تعليق الخلية برفق كل 5 دقائق. أضف 50 ميكرولتر / مل من كرات ديكستران السريعة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وأعد تعليقها برفق.
      ملاحظة: دوامة كرات ديكستران بسرعة عالية لمدة 5 ثوان لضمان ظهور الجسيمات مشتتة بالتساوي ثم إضافتها إلى الخلايا.
    5. احتضن في RT لمدة 15 دقيقة وأعد تعليق الخلية برفق كل 5 دقائق. اجعل تعليق الخلية يصل حجمه الإجمالي إلى 2.5 مل باستخدام المخزن المؤقت للتنقية وأعد تعليقه برفق.
    6. ضع الأنبوب في مغناطيس خال من الأعمدة المغناطيسية المناعية متاح تجاريا (انظر جدول المواد) واحتضانه لمدة 5 دقائق في RT. بعد الحضانة ، اقلب المغناطيس وتخلص من المادة الطافية في حركة واحدة مستمرة.
      ملاحظة: تظل خلايا CD34 + الموسومة بكرات ديكستران السريعة منجذبة إلى جوانب الأنبوب بواسطة المجال المغناطيسي. يجب تثبيت الأنبوب في الوضع المقلوب لمدة 2-3 ثوان. تجنب الارتعاش أو النشاف من القطرات التي تبقى معلقة من فم الأنبوب.
    7. أخرج الأنبوب من المغناطيس وأضف 2.5 مل من المخزن المؤقت للتنقية. كرر الخطوات 1.3.6-1.3.7 خمس مرات.
      ملاحظة: أثناء إضافة المخزن المؤقت للتنقية ، ضع الأنبوب بزاوية حادة وأضف المخزن المؤقت عن طريق تدوير الأنبوب ، حيث قد تلتصق الخلايا بجدران السطح أثناء قلب المغناطيس.
    8. بعد الانتهاء من خمس غسلات ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، وأضف 4 مل من 1x PBS المعقم ، وأعد تعليق تعليق الخلية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل واجعله يصل إلى 10 مل باستخدام 1x PBS. قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق في غرفة نيوباور10.
    9. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT (تسارع ~ 9 م / ث² ، تباطؤ ~ 7 م / ث²) وتجاهل الطافي باستخدام ماصة. لثقافة HSPCs إعادة تعليق الخلايا في وسائط ثقافة HSPC كما هو مذكور في الخطوة 2.1.
      ملاحظة: تم حفظ تجاوزات HSPCs المنقاة بالتبريد في وسط حفظ بالتبريد متاح تجاريا (انظر جدول المواد) بكثافة 9 × 106 خلايا / مل بعد زراعة HSPCs لمدة 12 ساعة في وسائط زراعة HSPC.
  4. إحياء HSPCs المحفوظة بالتبريد.
    1. قم بإذابة الكريوفيال لمدة <1 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية عن طريق الدوران اللطيف. انقل معلق الخلية في المبرد إلى أنبوب سعة 50 مل.
    2. أضف 1٪ BSA المعاد تعليقه في 1x PBS قطرة قطرة مع التحريض المستمر وجعلها تصل إلى 20 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بمعدل تسارع 9 م / ث² ومعدل تباطؤ 7 م / ث² وتخلص من الطافي باستخدام ماصة مصلية.
    3. كرر الخطوة 1.4.2. 1x. أعد تعليق الخلايا في وسائط ثقافة HSPC والثقافة كما هو موضح في الخطوة 2.1.

2. في الثقافة المختبرية من HSPCs المنقى

  1. تحضير وسائط الاستزراع باستخدام SFEM-II مع SCF (240 نانوغرام / مل) ، FLT3 (240 نانوغرام / مل) ، TPO (80 نانوغرام / مل) ، IL6 (40 نانوغرام / مل) ، و 1x مضاد حيوي مضاد حيوي (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام وسائط الاستزراع الطازجة. ومع ذلك ، يمكن تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد التحضير.
  2. أعد تعليق حبيبات CD34 + مع وسائط الاستزراع ، أضف 3 ميكرولتر من كوكتيل RUS / مل من الوسائط (ريسفيراترول ، 10 ميكرومتر ؛ UM729 ، 500 نانومتر ؛ ستيمريجينين -1 ، 750 نانومتر ؛ انظر جدول المواد) ، وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: يمكن استخدام UM171 (10 نانومتر) لاستبدال UM729 (500 نانومتر) لأن كلاهما له تأثيرات مماثلة على صيانة جذع HSPC7. لا يمكن إذابة القوارير بالتجميد أكثر من مرتين.
  3. في البداية ، قم بزرع الخلايا النقية عند التقاء 5 × 105 / مل في ألواح دلتا المعالجة سطحيا ذات 6 آبار (انظر جدول المواد) لإزالة الخلايا الملتصقة.
  4. أعد زرع الخلايا في المعلق عند التقاء 2 × 105 خلايا / مل في لوحة جديدة من 6 آبار بعد 6 ساعات من التنقية.
  5. توصيف جذعية HSPCs باستخدام قياس التدفق الخلوي قبل تحرير الجينات.
    1. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، خذ 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS وأضف 3 ميكرولتر (75 نانوغرام) من CD34 PE ، و 4 ميكرولتر (100 نانوغرام) من CD133 FITC ، و 4 ميكرولتر (100 نانوغرام) من CD90 APC (انظر جدول المواد).
    2. احتضان الأنبوب في RT لمدة 20 دقيقة في الظلام. اغسل الخلايا ب 2 مل من 1x PBS 2x وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 150 ميكرولتر من 1x PBS ، واحصل عليها في قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: إذا كانت النسبة المئوية لخلايا CD34 + <90٪ ، فقم بزيادة عدد عمليات الغسيل حتى ست مرات في الخطوة 1.3.7. بذر HSPCs المنقى في وسائط الثقافة ، وبعد 6 ساعات ، اجمع الخلايا الموجودة في التعليق فقط. تلتصق معظم خلايا CD34 بلوحة الثقافة.

3. التحرير الجيني ل HSPCs

  1. أداء دليل إعادة تكوين الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: تم الحصول على sgRNA الاصطناعي مع تعديلات الفوسفوروثيوات التي تستهدف موضع CCR5 من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
    1. لإعادة التكوين ، اضبط الخلاط الحراري على 37 درجة مئوية وقم بتسخين المخزن المؤقت 1x TE (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي قارورة sgRNA الاصطناعية المعدلة كيميائيا عند 11000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. إلى قارورة sgRNA التي تحتوي على 1.5 نانومتر من sgRNA المجفف بالتجميد ، أضف 15 ميكرولتر من 1x TE buffer ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ 100 pM / μL. أعد التعليق برفق حتى 5x ، مع تحريك الطرف حول الزوايا.
    3. احتضن في الخلاط الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية مع الحد الأدنى من الاهتزاز. بعد دورة قصيرة ، اجمع 15 ميكرولتر من sgRNA وقم بتخزينها على شكل 1 ميكرولتر (100 pM / μL) عند -80 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي لمدة تصل إلى عام واحد.
      ملاحظة: تجنب التجميد المتكرر للذوبان. يوصى بحد أقصى دورة تجميد وذوبان واحدة من الحمض النووي الريبوزي الرسول المقتبس.
  2. قم بإجراء nucleofection باتباع الخطوات أدناه.
    1. في اليوم 3 من المزرعة ، عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلاياالمحسنة في Neubauer 10.
    2. لإعداد RNP (لنوكليوفيكت 2 × 10 5 خلايا) ، خذ 1 ميكرولتر من sgRNA الذي يستهدف جين CCR5 (100 pM) في أنبوب0.5 مل وأضف 2.65 ميكرولتر من Cas9 (50 pM) عن طريق الدوران اللطيف حول قاع القارورة. احتضان في RT لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: تسلسل الحمض النووي الريبوزي (GRNA): (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG.
    3. لتحضير المخزن المؤقت ، أضف 16.4 ميكرولتر من محلول الخلية الأولية P3 و 3.6 ميكرولتر من الملحق ، المزود بمجموعة النواة التجارية (انظر جدول المواد) ، واحتضانه في RT لمدة 10 دقائق. تحضير وسط الاستزراع (الخطوة 2.1) وحضنها مسبقا عند 37 درجة مئوية في صفيحة الاستزراع قبل النوكليوفيكت.
    4. بيليه 2 × 10 5 خلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة5 دقائق في RT وتخلص من الطافي برفق باستخدام ماصة دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعد في الخطوة 3.2.3. وأعد تعليقه برفق.
    5. امزج تعليق الخلية برفق مع مركب RNP المحضر (الخطوة 3.2.2.) بدون فقاعات هواء. انقل المعلق إلى شريط nucleofection التجاري (انظر جدول المواد) وحدد رمز النبض DZ100 لتزويد الخلايا بالكهرباء باستخدام 4D nucleofector (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم النهائي لتعليق الخلية ، بما في ذلك مكونات المخزن المؤقت و RNP ، أكثر من 27 ميكرولتر / التثقيب الكهربائي.
    6. بالنسبة للتحكم التجريبي ، حبيبات 2 × 10 5 HSPCs غير محررة عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة5 دقائق في RT ، وإعادة تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعد في الخطوة 3.2.3. بدون مجمع RNP.
    7. أضف 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع المحتضنة مسبقا (الخطوة 3.2.3.) إلى الخلايا المثقوبة بالكهرباء واترك الخلايا دون إزعاج لمدة 10 دقائق في شريط النواة عند RT. بعد 10 دقائق من الحضانة ، انقل المحتويات إلى لوحة الاستزراع وفقا للمتطلبات التجريبية.
      ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التعطيل المستهدف بوساطة الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) لأي موضع جينومي باستخدام gRNA الخاص بالهدف. يمكن تطبيق نفس البروتوكول لإدخال عمليات حذف كبيرة عن طريق تضمين gRNA المزدوج في الخطوة 3.2.2. 11. علاوة على ذلك ، بعد 10 دقائق من حضانة RNP ، يمكن استخدام نفس البروتوكول لتحرير الجينات القائم على الإصلاح الموجه للتماثل (HDR) عند تزويده بنموذج مانح12. تم التحقق من صحة البروتوكول من خلال التعطيل المستهدف ل AAVS1 و β-globin الزائف و β-globin و CCR5 locus 7,8.

4. التحقق من صحة أحداث تحرير الجينات في HSPCs

  1. إجراء استخراج الحمض النووي.
    1. بعد 72 ساعة بعد nucleofection ، قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق في غرفة Neubauer. اجمع 1 × 105 HSPCs محررة جينيا لاستخراج الحمض النووي.
    2. قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 11000 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من 1x PBS وكرر الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية. إلى الحبيبات, أضف 20 ميكرولتر من محلول الاستخراج السريع (انظر جدول المواد) لخلايا 1 × 105 وأعد تعليق الحبيبات.
    3. احتضان الخليط في دراجة حرارية عند 68 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد دورة قصيرة ، احتضن الخليط في دراجة حرارية عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قياس تركيز الحمض النووي في المحللة الخام باستخدام مقياس الطيفالضوئي 13.
  2. قم بإجراء تضخيم الموضع المحرر جينيا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    1. باستخدام Primer3 (انظر جدول المواد) ، قم بتصميم البادئات الخاصة بالموقع والتي تمتد على موقع الفاصل المزدوج (DSB) بأحجام amplicon تتراوح بين 400-700 نقطة أساس (الجدول 2).
      ملاحظة: Primer3 هي أداة مفتوحة المصدر قائمة على الويب لتصميم بادئات PCR.
    2. تحضير خليط التفاعل كما هو موضح في الجدول 3 وتشغيل العجلة الحرارية مع ظروف الدورة المذكورة في الجدول 4. لتأكيد تضخيم الموضع المطلوب ، امزج 5 ميكرولتر من منتج PCR مع صبغة تحميل 6x وقم بالتحميل على الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز بنسبة 2٪ المصنوع باستخدام المخزن المؤقت TAE.
      ملاحظة: يتم توفير مكونات المخزن المؤقت TAE في الجدول 7.
    3. اركض لمدة 30-40 دقيقة عند 100 فولت واكتشف amplicon باستخدام نظام تصوير هلام (انظر جدول المواد). وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتنقية PCR (انظر جدول المواد) ، قم بتنظيف منتج PCR المضخم.
    4. قم بقياس تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي نانو (انظر جدول المواد).
  3. قم بإجراء تسلسل سانجر وإزالة فاصل الصبغة الحرة باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحضير خليط التفاعل كما هو موضح في الجدول 5. قم بتشغيل العجلة الحرارية مع ظروف ركوب الدراجات كما هو مذكور في الجدول 6.
    2. أضف 10 ميكرولتر من كاشف HighPrep DTR (انظر جدول المواد) و 40 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 85٪ إلى 10 ميكرولتر من عينة PCR في أنبوب سعة 1.5 مل واخلطها عن طريق سحب قوي حوالي 8x-10x.
    3. احتضن الخليط في RT لمدة 5 دقائق وضع أنبوب 1.5 مل على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 85٪.
    4. تخلص من المادة الطافية وكرر الخطوة 4.3.3. 1x. أخرج الأنابيب سعة 1.5 مل من حامل المغناطيس واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في خلاط حراري لتجفيف الإيثانول.
    5. أعد تعليق الخرز بقوة مع 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز واحتضانه في RT لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 5 دقائق ، وقم بإجراء تسلسل سانجر بعد التقارير المنشورة14,15.
  4. قم بإجراء تقييم تردد indel بواسطة تحليل ICE16.
    1. استخدم Synthego (انظر جدول المواد) لتحليل ICE.
    2. قم بتحميل ملفات ab1 للعينات المحررة وغير المحررة وتسلسلات gRNA وانقر فوق تحليل للحصول على تردد Indels.

5. زرع HSPCs المحررة جينيا

  1. اشترط مسبقا ماوس جاما NOD scid (NSG)17 و NOD المتاحين تجاريا. CG-KitW-41JTyr + PrkdcscidIL2rgtm1Wjl / ThomJ (NBSGW) 18 فئران (انظر جدول المواد) لزراعة نخاع العظام.
    1. بالنسبة للفئران التي تحتوي على تكييف مسبق ل NSG ، اختر إناث الفئران البالغة من العمر 6-8 أسابيع وافصلها إلى مجموعات تحكم ومحررة عن طريق التوزيع العشوائي الأعمى.
    2. ضع فئران NSG في أقفاص الفطيرة وقم بالإشعاع عند 3.5 جراي باستخدام جهاز تشعيع متاح تجاريا (انظر جدول المواد) قبل 6-8 ساعات من زرع HSPC.
      ملاحظة: يوصى بوزن الفئران قبل التشعيع ، وستتعرض الفئران التي تزن >20 جم للتشعيع.
    3. للتهيئة المسبقة للفئران الذكور والإناث من الذكور والإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، قم بحقن بوسلفان (انظر جدول المواد) من خلال الحقن داخل الصفاق (IP) بجرعة 12.5 مجم / كجم من وزن الجسم قبل 48 ساعة من زرع HSPC.
      ملاحظة: يزيد تكييف بوسلفان من تطعيم HSPCs البشرية في نخاع عظم الفأر ويقلل من الحاجة إلى ضخ جرعات كبيرة من HSPCs المعدلة جينيا19. يتراوح النطاق المثالي لجرعة بوسلفان للتكييف بين 10 ملغم / كغم إلى 15 ملغم / كغم من وزن الجسم. زيادة جرعات بوسلفان ستؤدي إلى مشاكل وفيات شديدة.
  2. تحضير معلق الخلية لزراعة نخاع العظم.
    1. بعد 10 دقائق من حضانة HSPCs المحررة جينيا في شريط النواة (انظر الخطوة 3.2.7.) ، انقل معلق الخلية إلى 10 مل من 1x PBS. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلاياالمحسنة 10 في نيوباور.
    2. لضخ فأر واحد ، حبيبات 6 × 10 5 خلايا في أنبوب 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة5 دقائق عند RT وتجاهل الطافي برفق باستخدام ماصة دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 100 ميكرولتر من 1x PBS.
  3. قم ببث HSPCs عن طريق حقن الوريد الخلفي باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع ماوس NSG أو NBSGW المشروط مسبقا في مثبت الماوس (انظر جدول المواد).
    2. امسك ذيل الماوس وادفع القابس برفق لكبح جماح الماوس. امسح ذيل الماوس برفق بنسبة 70٪ إيثانول. نضح 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة الأنسولين 31 غرام.
      ملاحظة: تجنب بدقة الفقاعات في منتج التسريب عن طريق النقر برفق على المحقنة أو تحريك المكبس برفق.
    3. قم بتوجيه الضوء من مصباح الأشعة تحت الحمراء إلى الذيل لمدة 30-40 ثانية ، ويغطي منطقة جسم الماوس بطيات من المناديل الورقية. أدخل الجزء المائل من الإبرة برفق في الوريد الذيلي الأيسر أو الأيمن بزاوية 20 درجة.
    4. ارفع الذيل بإصبع السبابة الأيسر للحفاظ عليه في المحور المستوي باستخدام المحقنة. ادفع المكبس لبث تعليق الخلية في الوريد. ضع ضغطا لطيفا بالقرب من المنطقة المثقوبة بالمناديل الورقية واسحب الإبرة.
    5. بعد 30 ثانية من تطبيق ضغط لطيف ، أخرج الماوس من المقيد وانقله إلى قفصه.

6. تقييم إمكانات النقش على المدى القصير

  1. بعد 4 أسابيع من زرع HSPC البشري ، قم بتقييم النقش قصير المدى عن طريق جمع الدم عبر الجيب الوريدي المداري في أنبوب هيبارين باستخدام ماصة باستور.
    1. تخدير الحيوان بتركيبة الكيتامين (90-120 ملغم / كغم) والزيلازين (8-12 ملغم / كغم) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) قبل جمع العينة.
      ملاحظة: اضغط برفق على الأطراف الخلفية للفأر المخدر لتأكيد فقدان الإحساس.
    2. بعد التخدير ، ضع الحيوان في الراقدة البطنية وقشر الماوس برفق لفتح العين ، مما يسمح لكرة العين بالبروز قليلا.
    3. أدخل ماصة باستور برفق في القنية الإنسية للعين تحت الغشاء اللاصق بزاوية 30 درجة -45 درجة. بعد وضع ماصة باستور في الموضع المناسب ، اضغط ضغطا طفيفا على الأنبوب وابدأ في تدوير الأنبوب برفق.
      ملاحظة: سيدخل الدم الأنبوب عن طريق عمل الشعيرات الدموية بمجرد ثقب الضفيرة المدارية الخلفية.
  2. بعد جمع 50-80 ميكرولتر من الدم المحيطي ، اسحب الماصة برفق من العلبة الإنسية للعين.
    1. لوقف النزيف حول مدار العين ، أغلق الجفون واضغط برفق باستخدام قطعة من الشاش.
  3. قم بتلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة المعنية (الجدول 8) واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 25-30 دقيقة في RT.
  4. لتحلل كرات الدم الحمراء ، إلى تعليق الخلية ، أضف 3 مل من 1x محلول تحلل كرات الدم الحمراء (الجدول 7) واحتضانه لمدة 10 دقائق في الجليد.
    1. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. كرر الخطوة 6.4. حتى يختفي احمرار الحبيبات.
    2. أضف 2 مل من 1x PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT لإزالة حطام الخلية المرتبط بتحلل كرات الدم الحمراء.
    3. أضف 150 ميكرولتر من 1x PBS إلى الحبيبات ثم تابع التنميط المناعي لقياس التدفق الخلوي لتقييم النسبة المئوية للخلايا البشرية المحفورة7.

7. تقييم إمكانات النقش على المدى الطويل

  1. القتل الرحيم الفئران.
    1. التضحية بالفئران المزروعة في الأسبوع 16 لتحليل engraftment عن طريق إدخال 100٪ CO 2 الاختناق20 داخل قفص الفئران لمدة1-2 دقيقة.
    2. تأكيد القتل الرحيم عن طريق التأكد من توقف القلب والجهاز التنفسي وغياب الحركات العضلية مع القرص اللطيف للأطراف الخلفية. إذا تم استيفاء كلا الشرطين ، فقم بإزالة الفئران من القفص.
    3. لتقييم خيمرية الخلايا البشرية ، اجمع الخلايا من نخاع العظام.
  2. عزل الخلايا من نخاع العظم باتباع الخطوات أدناه.
    1. بعد القتل الرحيم ، قم بعمل شق عمودي 1 سم فوق مجرى البول ويمتد حتى 1 سم تحت الحجاب الحاجز. قطع أفقيا في زوايا المنطقة المحفورة لفتح منطقة البطن على نطاق واسع.
    2. تشريح عظم الفخذ والساق وإزالة الأنسجة الرخوة المرتبطة بعظم الفخذ والساق باستخدام المقص. افرك بلطف بالمناديل الورقية وقم بعمل ثقب صغير لا يزيد قطره عن 0.2 سم في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل باستخدام مشرط.
    3. قم بإزالة الأطراف القريبة من العظام باستخدام مشرط وضع العظام بحيث يكون الجانب المقطوع متجها نحو فتحة أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل. ضع أنبوب 0.5 مل مع العظام في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من 1x PBS المعقم.
    4. أغلق الغطاء ، وقم بتدوير الأنابيب لمدة 3 دقائق عند 1000 × جم في ظل ظروف معقمة في RT ، وتخلص من الأنابيب سعة 0.5 مل التي تحتوي على عظام ذات تجويف نخاع فارغ. أضف 1 مل من 1x PBS إلى أنبوب التفاعل 1.5 مل الذي يحتوي على نخاع العظم وأعد تعليق الخلايا برفق بما لا يقل عن 10x تقريبا باستخدام ماصة 1 مل.
    5. انقل 1 مل من معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء. احتضان الخلايا في الجليد لمدة 7 دقائق مع انعكاس لطيف للأنابيب كل 2 دقيقة.
    6. بعد 7 دقائق ، جهاز طرد مركزي بسرعة 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT بتسارع 9 م / ث² وتسارع 7 م / ث². كرر الخطوة 7.2.5. حتى يتم ملاحظة بيليه أبيض شاحب واضح.
    7. أعد تعليق الخلايا ب 10 مل من 1x DPBS المعقم وقم بتصفية تعليق خلية نخاع العظم باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر على أنبوب 15 مل. شطف مصفاة الخلية مع 2 مل من 1x PBS 2x لتجنب فقدان الخلايا.
    8. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم ، RT ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 10 مل من IMDM مع DNase-I بتركيز عمل قدره 100 ميكروغرام / مل.
    9. خذ 1 × 106 خلايا أحادية النواة في أنبوب FACS لتحليل engraftment عن طريق قياس التدفق الخلوي. لتقييم تردد تحرير الجينات في الخلايا أحادية النواة في نخاع العظم المحفور ، حبيبات 1 × 106 خلايا أحادية النواة عند 11000 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.

8. التنميط المناعي

  1. احتضان خلايا نخاع العظم ب 1.5 ميكرولتر من بروتين Fc البشري المؤتلف المنقى (انظر جدول المواد) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل تلطيخها بالأجسام المضادة.
    ملاحظة: تمت صياغة بروتين Fc البشري المستخدم هنا لمنع تلطيخ الأجسام المضادة غير المحددة التي تسببها مستقبلات IgG. وبالتالي ، فإنه يزيد من خصوصية تسمية الأجسام المضادة7،21،22. قبل تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا المستهدفة ، قم بإجراء معايرة الأجسام المضادة. يوصى بشدة بتضمين عناصر تحكم FMO وعناصر تحكم isotype أثناء العمل على تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.
  2. لتحديد النسبة المئوية لتطعيم الخلايا البشرية بواسطة مقياس التدفق الخلوي ، خذ 1 × 106 خلايا أحادية النواة في أنبوب FACS وقم بتلطيخ الخلايا كما هو مذكور في الجدول 8.
  3. احتضان الخلايا في الظلام لمدة 25-30 دقيقة في RT. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  4. الحصول على الخلايا عن طريق مقياس التدفق الخلوي ، وبوابة عدد الخلايا (P1) باستخدام الأمام (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) للخلايا أحادية النواة ، وضبط الجهد وفقا لسكان الخلية. الحصول على 50000 حدث خلية في مجموعة P1.
  5. لتحليل مجموعات كريات الدم البيضاء البشرية في نخاع عظم الفأر ، قم ببوابة خلايا CD45 + البشرية والفئران CD45.1 من مجموعة خلايا P1 باستخدام برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).
  6. احسب نقش الخلايا البشرية باستخدام الصيغةالتالية 8:
    ٪ من engraftment = (٪ hCD45) / (٪ hCD45 + ٪ mCD45) × 100.
    ملاحظة: اعتبرت عتبة النقش البشري إيجابية بنسبة 0.1٪ ل CD45.
  7. علاوة على ذلك ، قم بتحليل النسبة المئوية لخلايا hCD34 + من خلايا CD45 + البشرية لتقييم خلايا إعادة التوطين على المدى الطويل. لتقييم إعادة تكوين الخلايا البشرية المحفورة متعددة السلالات ، قم بتلطيخ 100 ميكرولتر من معلق الخلية باتباع الجدول 9.
    ملاحظة: يجب معايرة الأجسام المضادة قبل التجارب.
  8. باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي ، قم ببوابة hCD45 من عدد خلايا P1 ، ومن hCD45 ، حدد النسبة المئوية ل hCD19 و hCD3 و hCD13 (مجموعات فرعية لمفاوية ونخاعية).

9. تقييم تردد تحرير الجينات في الخلايا أحادية النواة في نخاع العظم المحفور

  1. إلى حبيبات الخلية أحادية النواة لنخاع العظم, أضف 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج السريع (انظر جدول المواد) لخلايا 5 × 105 وأعد تعليق الحبيبة.
  2. احتضان الخليط في دراجة حرارية عند 68 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد دورة قصيرة ، احتضن الخليط في دراجة حرارية عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. قياس تركيز الحمض النووي في المحللة الخام باستخدام مقياس الطيف الضوئي. اتبع الخطوات 4.2.-4.4. للتحقق من صحة تردد تحرير الجينات باستخدام تحليل ICE 8,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحدد الدراسة الحالية الظروف المثالية لاستزراع HSPC التي تسهل الاحتفاظ ب CD34 + CD133 + CD90 + HSCs في الثقافة خارج الجسم الحي. لإثبات إثراء ثقافة HSCs جنبا إلى جنب مع الجيل المعزز من HSCs المعدلة جينيا ، يتم توفير الإجراءات المثلى لعزل PBMNC ، وتنقية خلايا CD34 + ، والثقافة ، وتحرير الجينات ، والزرع ، وتوصيف engraftment ، والخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي (الشكل 1). بعد التنقية ، تم إجراء تقييم قياس التدفق الخلوي للتحقق من علامات HSPC ، وتم استزراع HSPCs لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة من الاستزراع ، تم وضع نواة HSPCs مع Cas9 RNP واستزراعها لمدة 2 أيام إضافية. أظهرت ظروف الاستزراع المحسنة التي تحتوي على كوكتيل RUS زيادة في الجدوى وتواترا أعلى ل CD34 + CD133 + CD90 + HSCs وزيادة تردد تحرير الجينات (الشكل 2). لإثبات أن ظروف الاستزراع المحسنة تزيد من تواتر الخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي ، تم تحرير اليوم 3 من HSPCs التي تستهدف موضع CCR5 جينيا وغرسها في فئران NSG شبه المشععة بشكل مميت. تم تحليل تطعيم الخلايا البشرية في نخاع عظم الفأر (BM) بعد 16 أسبوعا من التسريب (الشكل 3 أ). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا CD45 + البشرية (hCD45) في فئران NSG زيادة في النقش في ظروف المزرعة (الشكل 3B ، C). أظهر تحليل تردد تحرير الجينات في خلايا BM للفأر زيادة في تطعيم HSPCs المحررة جينيا في ظروف الثقافة المكملة ب RUS (الشكل 3D).

Figure 1
الشكل 1: موجز هذه الدراسة. يتم تمثيل ملخص رسومي للإجراء المتضمن في عزل PBMNCs ، والتخصيب المغناطيسي لخلايا CD34 + من PBMNCs ، والزراعة ، وتوصيف الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم البشرية (HSPCs) ، وتحرير الجينات ، والزرع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: كوكتيل RUS يثري تردد HSCs. تم استزراع mPB-HSPCs في وسائط زراعة الخلايا الجذعية التي تحتوي على السيتوكينات مع السيارة (DMSO) وكوكتيل RUS لمدة 3 أيام وتم تحريرها جينيا باستخدام 25 pM من Cas9-RNP. تم تحليل الخلايا المحررة جينيا بواسطة FACS لعلامات HSPCs بعد 48 ساعة من النواة. (أ) تمثل مخططات التدفق الخلايا الحية (7AAD-) ومجتمع CD34 + CD90 +. (ب) النسبة المئوية وتكرار أنماط indel التي تم تحليلها بعد 72 ساعة من التحرير في المجموعة المعالجة DMSO و RUS. (ج) العدد المطلق لخلايا CD34 + CD90 + التي تم تحليلها بعد 48 ساعة من التحرير (ن = 2) (المتبرع = 1). (د) العدد المطلق لإجمالي الخلايا النواة (TNC) التي تم تحليلها بعد 48 ساعة من التحرير (ن = 2) (المتبرع = 1). تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM ، * p ≤ 0.05 (اختبار t غير مقترن). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تزيد ظروف المزرعة المثلى من تكرار الخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي. أ: التمثيل التخطيطي للتجربة. (ب) مخطط FACS التمثيلي يوضح خلايا hCD45 + في الماوس BM. يشير الجزء الداخلي إلى الخلايا البشرية (يسار) وخلايا الماوس (يمين). تمت زراعة HSPCs لمدة 3 أيام ، وتم تحريرها جينيا باستخدام sgRNA في اليوم الثالث ، وزرعها مباشرة بعد التثقيب الكهربائي. (ج) تطعيم الخلايا البشرية في BM الفأر بعد 16 أسبوعا من التسريب (ن = 4). (د) الخلية البشرية المعدلة جينيا (hCD45+ الخلايا المحررة جينيا) الخيمرية في BM الفأر بعد 16 أسبوعا من التسريب (ن = 4) (المتبرع = 1). تمثل كل نقطة ماوس فردي، ونقاط البيانات من تجربة فردية. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM ، * p ≤ 0.05 (اختبار t غير المقترن). تم تكييف الشكل بإذن من كريستوفر وآخرون 7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عدد الخلايا العازلة تنقية (مل)
< 1 × 107 خلايا 0.1
1 × 107 - 1 × 108 خلايا 0.5
1 - 5 × 108 خلايا 1

الجدول 1: حجم العازلة تنقية لإعداد التعليق الخلوي لتنقية الخلايا CD34 + .

اسم التمهيدي تسلسل
CCR5 إلى الأمام CAGAGCCAAGCTCTCCATC
CCR5 عكس أجاجاككا
تسلسل CCR5 التمهيدي إلى الأمام AATGTAGACATCTATGTAGG

الجدول 2: تسلسل التمهيدي لتضخيم موضع CCR5.

مكونات تفاعل 50 ميكرولتر
المخزن المؤقت (5x) 10 ميكرولتر
التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) 1 ميكرولتر
التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) 1 ميكرولتر
دنتب 4 ميكرولتر
البلمرة 1 ميكرولتر
الحمض النووي الجينومي 200 نانوغرام
مياه خالية من النيوكلياز حتى 50 ميكرولتر

الجدول 3: خليط التفاعل لتضخيم موضع CCR5 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الخطوات مدة درجة الحرارة عدد الدورات
تمسخ أولي 1 دقيقة 95 درجة مئوية 1
تمسخ 10 ثانية 98 درجة مئوية 35
الصلب 15 ثانية 56 درجة مئوية
امتداد 30 ثانية 68 درجة مئوية
التمديد النهائي 1 دقيقة 72 درجة مئوية 1
مسك ∞ 15 درجة مئوية

الجدول 4: شروط العجلة الحرارية لتضخيم موضع CCR5.

مكونات تفاعل 10 ميكرولتر
المخزن المؤقت (5x) 2 ميكرولتر
التمهيدي (2 ميكرومتر) 1.6 ميكرولتر
مزيج RR 0.75 ميكرولتر
منتج تنظيف PCR 80 نانوغرام
مياه خالية من النيوكلياز حتى 10 ميكرولتر

الجدول 5: خليط التفاعل لتسلسل سانجر PCR.

الخطوات مدة درجة الحرارة عدد الدورات
تمسخ 15 ثانية 96 درجة مئوية 27
الصلب 20 ثانية 55 درجة مئوية
امتداد 4 دقائق 60 درجة مئوية
مسك ∞ 15 درجة مئوية

الجدول 6: شروط العجلة الحرارية لتسلسل سانجر PCR.

مخزن مؤقت تكوين
10x محلول تحلل كرات الدم الحمراء - 100 مل (درجة الحموضة - 7.3) 8.26 جم من NH4Cl ، 1.19 جم من NaHCO3 ، 200 ميكرولتر من EDTA (0.5 م ، pH8)
50x TAE عازلة (درجة الحموضة - 8.3) قم بإذابة 50 مللي مول من ملح الصوديوم EDTA ، 2 م تريس ، 1 م من حمض الخليك الجليدي في 1 لتر من الماء

الجدول 7: التراكيب العازلة

الاجسام المضاده حجم
مكافحة الإنسان CD45 APC 3 ميكرولتر
مكافحة الماوس CD45.1 PerCP-Cy5 4.5 ميكرولتر
مكافحة الماوس CD34 PE 3 ميكرولتر

الجدول 8: الأجسام المضادة المستخدمة لتقييم نقش الخلايا البشرية.

الاجسام المضاده حجم
مكافحة الإنسان CD45 APC 3 ميكرولتر
مكافحة الماوس CD19 PerCP 15 ميكرولتر
مكافحة الماوس CD13 PE 15 ميكرولتر
مكافحة الماوس CD3 PE-Cy7 2 ميكرولتر

الجدول 9: الأجسام المضادة المستخدمة لتقييم نسبة الخلايا متعددة السلالات المشتقة من HSPCs المنقوشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعتمد النتيجة الناجحة للعلاج الجيني HSPC في الغالب على جودة وكمية HSCs القابلة للنقش في الكسب غير المشروع. ومع ذلك ، تتأثر الخصائص الوظيفية ل HSCs بشكل كبير خلال المرحلة التحضيرية لمنتجات العلاج الجيني ، بما في ذلك عن طريق الثقافة في المختبر والسمية المرتبطة بإجراء التلاعب الجيني. للتغلب على هذه القيود ، حددنا ظروف استزراع HSPCs المثالية التي تحتفظ بجذع CD34 + CD133 + CD90 + HSCs في الثقافة خارج الجسم الحي. استخدمت العديد من المجموعات البحثية SR1 أو UM171 أو جزيئات أخرى كجزيئات قائمة بذاتها لتوسيع دم الحبل السري (UCB) HSPCs في المختبر23،24. استخدمت دراسة سابقة مزيجا من كل من SR1 و UM17125. تم تحسين الجزيئات الصغيرة والسيتوكينات في وسط الاستزراع خصيصا ل HSPCs البالغة المعبأة وتطبيقها في العلاج الجيني الذاتي. أظهرت تجربة الفحص أن الجمع بين ثلاثة جزيئات صغيرة ريسفيراترول و UM729 و SR1 ، مهم لتوليد عدد كبير من خلايا CD34 + CD90 + وتثبيط تكاثر الخلايا السلفية المتمايزة والملتزمة. يمكن استبدال UM729 في كوكتيل RUS ب UM171. ومع ذلك ، فإن الشراء التجاري ل UM171 أقل جدوى. يتم اعتماد تركيزات السيتوكين من البروتوكول الذي تم استخدامه في الدراسات السريرية26 لتقليل المتغيرات أثناء عملية التوسع. يحتوي كوكتيل السيتوكين على IL6 بدلا من IL3 لتقليل انتشار السلف واستنفاد HSC في المختبر27. يوصى بإعداد حصص جديدة من وسائط الاستزراع (الوسائط القاعدية + RUS + كوكتيلات السيتوكين) لتقليل التباين التجريبي والحصول على قابلية عالية للتكرار. البروتوكول قابل للتطبيق على كل من تحرير الجينات بوساطة NHEJ و HDR. على وجه الخصوص ، تعد ثقافة HSPC من 48-72 ساعة قبل التثقيب الكهربائي و 24 ساعة بعد التثقيب الكهربائي أمرا بالغ الأهمية لتحرير جين HDR. يجب أن تفيد ظروف الاستزراع المحسنة تحرير الجينات HDR من خلال الحفاظ على الخلايا الجذعية. ولوحظ أيضا أن ظروف الاستزراع تساعد على نقل الفيروسات العدسية في HSCs على المدى الطويل. يشير هذا إلى أنه إذا تم استخدام الجسيمات الفيروسية مثل AAV6 أو IDLV كمتبرع HDR ، فمن المتوقع أن تتحسن كفاءة تحرير HDR ، حيث تعزز ظروف الثقافة المثلى تسليم المانحين إلى HSCs.

لتقييم نتائج تحرير الجينات ، بما في ذلك NHEJ و HDR ، يقترح تحليل NGS أو تحليل المسبار أو ddPCR أو تسلسل Sanger7،8،28 ، متبوعا بإزالة الالتفاف باستخدام أدوات عبر الإنترنت (ICE / ICE Knock-In)16 ، نظرا لطبيعتها الكمية القوية. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء اختبار T7 endonuclease على عينات الحمض النووي المحررة ، ويمكن قياس نطاقات الحمض النووي المجزأة باستخدام ImageJ. ومع ذلك ، فإن نهج مقايسة النوكلياز الداخلي T7 أقل دقة من تحليل إزالة الالتفاف ويستهدف تسلسل الجيل التالي.

تم تحسين بروتوكول الزرع أيضا عن طريق تكييف الفئران NBSGW مع busulfan ، مما يتيح جرعات منخفضة من الخلايا لتقييم تطعيم HSPC وإعادة السكان. بشكل عام ، يجب أن يقلل هذا الإجراء من جرعات HSPCs المطلوبة لمعالجة الجينات وزيادة إمكانية الوصول إلى العلاج الجيني HSPC في البلدان النامية.

في هذه الدراسة ، تم عرض بروتوكولات عزل PBMNC ، وتنقية CD34 + HSPC ، وتحرير الجينات والتحقق من صحتها ، وتقييم HSPCs المحررة جينيا في نخاع عظم الفأر. وقد ثبت أيضا أن ثقافة HSPC المحسنة تثري CD34 + CD133 + CD90 + HSPCs وتزيد من كيمرية الخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يريد المؤلفون الاعتراف بموظفي مرفق قياس التدفق الخلوي ومرفق الحيوانات في CSCR. يتم تمويل A. C. من خلال زمالة ICMR-SRF ، ويتم تمويل K. V. K. من خلال زمالة DST-INSPIRE ، ويتم تمويل P. B. من خلال زمالة CSIR-JRF. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند (المنحة رقم BT / PR26901 / MED / 31/377/2017 و BT / PR31616 / MED / 31/408/2019)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4D-Nucleofector® X Unit LONZA BIOSCIENCE AAF-1003X
4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) LONZA BIOSCIENCE V4XP-3032
Antibiotic-Antimycotic (100X) THERMO SCIENTIFIC 15240096
Anti-human CD45 APC BD BIOSCIENCE  555485 
Anti-human CD13 PE BD BIOSCIENCE 555394
Anti-human CD19 PerCP BD BIOSCIENCE 340421
Anti-human CD3 PE-Cy7 BD BIOSCIENCE 557749
Anti-human CD90 APC BD BIOSCIENCE 561971
Anti-human CD133/1  Miltenyibiotec 130-113-673
Anti-human CD34 PE BD BIOSCIENCE 348057
Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 BD BIOSCIENCE 560580
Blood Irradator-2000  BRIT (Department of Biotechnology, India) BI 2000 
Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) NUNC (THERMO SCIENTIFIC) 140675
CrysoStor CS10 BioLife solutions #07952
Busulfan CELON LABS (60mg/10mL) - 
Guide-it Recombinant Cas9 TAKARA BIO 632640
Cas9-eGFP SIGMA C120040 
 Centrifuge tube-15ml CORNING 430790
 Centrifuge tube-50ml NUNC (THERMO SCIENTIFIC) 339652
DMSO MPBIO 219605590
DNAase STEMCELL TECHNOLOGIES 6469
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X HYCLONE SH30028.02
EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II STEMCELL TECHNOLOGIES 17856
EasySep magnet STEMCELL TECHNOLOGIES 18000
Electrophoresis unit ORANGE INDIA HDS0036
FBS THERMO SCIENTIFIC 10270106
Flow cytometer – ARIA III BD BIOSCIENCE - 
FlowJo  BD BIOSCIENCE  -
Flt3-L PEPROTECH 300-19-1000
Gel imaging system CELL BIOSCIENCES 11630453
HighPrep DTR reagent MAGBIOGENOMICS DT-70005
Human BD Fc Block BD BIOSCIENCE 553141
IL6 PEPROTECH 200-06-50
IMDM media THERMO SCIENTIFIC 12440053
Infrared lamp MURPHY -
Insulin syringe 6mm 31G BD BIOSCIENCE 324903
Ketamine KETMIN 50 -
Loading dye 6X TAKARA BIO 9156
Lymphoprep STEMCELL TECHNOLOGIES 7851
Mice Restrainer AVANTOR TV-150
Nano drop spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC ND-2000C
Neubauer cell counting chamber ROHEM INSTRUMENTS CC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:005557
NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6-well plate THERMO SCIENTIFIC 140675
Polystyrene round-bottom tube BD 352008
P3 primary cell Nucleofection solution LONZA BIOSCIENCE PBP3-02250
Pasteur pipette FISHER SCIENTIFIC 13-678-20A
PCR clean-up kit TAKARA BIO 740609.25
Mouse Pie Cage FISCHER SCIENTIFIC 50-195-5140
polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) STEMCELL TECHNOLOGIES 38007
Primer3 Whitehead Institute for Biomedical Research https://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA Extraction Solution Lucigen QE09050
Reserveratrol STEMCELL TECHNOLOGIES 72862
SCF PEPROTECH 300-07-1000
SFEM-II STEMCELL TECHNOLOGIES 9655
sgRNA SYNTHEGO - 
SPINWIN TARSON 1020
StemReginin 1 STEMCELL TECHNOLOGIES 72342
ICE analysis tool SYNTHEGO https://ice.synthego.com/
Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X SYNTHEGO Supplied with gRNA 
Thermocycler APPLIED BIOSYSTEMS 4375305
TPO PEPROTECH 300-18-1000
Trypan blue HIMEDIA LABS TCL046
UM171 STEMCELL TECHNOLOGIES 72914
UM729 STEMCELL TECHNOLOGIES 72332
Xylazine XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
  2. Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
  3. Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
  4. Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
  5. Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
  6. Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
  7. Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
  8. Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
  9. Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
  10. Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
  11. Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
  12. Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
  13. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  14. Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
  15. Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
  16. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  17. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  18. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
  19. Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
  20. Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
  21. Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
  22. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
  23. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  24. Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
  25. Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
  26. Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  27. Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
  28. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).

Tags

علم الأحياء، العدد 186،
كريسبر / كاس 9 التحرير الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية لتطبيقات العلاج الجيني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkatesan, V., Christopher, A. C.,… More

Venkatesan, V., Christopher, A. C., Karuppusamy, K. V., Babu, P., Alagiri, M. K. K., Thangavel, S. CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications. J. Vis. Exp. (186), e64064, doi:10.3791/64064 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter