Summary
Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 is een zeer veelzijdige en efficiënte genbewerkingstool die op grote schaal wordt gebruikt om verschillende genetische mutaties te corrigeren. De haalbaarheid van genmanipulatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) in vitro maakt HSCC's een ideale doelcel voor gentherapie. HSPC's verliezen echter matig hun engraftment- en multilineage herbevolkingspotentieel in ex vivo cultuur. In de huidige studie worden ideale kweekomstandigheden beschreven die de HSPC-engraftment verbeteren en in vivo een verhoogd aantal gen-gemodificeerde cellen genereren. Het huidige rapport toont geoptimaliseerde in vitro kweekomstandigheden, waaronder het type kweekmedia, unieke cocktailsuppletie met kleine moleculen, cytokineconcentratie, celkweekplaten en kweekdichtheid. Daarnaast wordt een geoptimaliseerde HSPC-genbewerkingsprocedure, samen met de validatie van de genbewerkingsgebeurtenissen, verstrekt. Voor in vivo validatie worden de gen-bewerkte HSPC-infusie en post-engraftmentanalyse bij muisontvangers weergegeven. De resultaten toonden aan dat het kweeksysteem de frequentie van functionele HSC's in vitro verhoogde, wat resulteerde in robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.
Introduction
De ontoegankelijkheid van menselijke leukocytenantigeen (HLA)-gematchte donoren in allogene transplantatie-instellingen en de snelle ontwikkeling van zeer veelzijdige en veilige genetische manipulatietools maken autologe hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) een curatieve behandelingsstrategie voor de erfelijke bloedaandoeningen 1,2. Autologe hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) gentherapie omvat het verzamelen van HSPC's van patiënten, genetische manipulatie, correctie van ziekteveroorzakende mutaties en transplantatie van gengecorrigeerde HSPC's in de patiënt 3,4. Het succesvolle resultaat van de gentherapie is echter afhankelijk van de kwaliteit van het transplanteerbare gen-gemodificeerde transplantaat. De genmanipulatiestappen en ex vivo kweek van HSPC's beïnvloeden de kwaliteit van het transplantaat door de frequentie van langdurige hematopoietische stamcellen (LT-HSC's) te verlagen, waardoor de infusie van grote doses gengemanipuleerde HSPC's 2,5,6 noodzakelijk wordt.
Verschillende kleine moleculen, waaronder SR1 en UM171, worden momenteel gebruikt om navelstrengbloed HSPC's robuust uit te breiden 7,8. Voor volwassen HSPC's is, vanwege de hogere celopbrengst verkregen bij mobilisatie, robuuste expansie niet vereist. Het behoud van de stamheid van geïsoleerde HSPC's in ex vivo cultuur is echter cruciaal voor de gentherapietoepassingen. Daarom wordt een aanpak ontwikkeld die zich richt op de kweekverrijking van hematopoëtische stamcellen (HSC's) met behulp van een combinatie van kleine moleculen: Resveratrol, UM729 en SR1 (RUS)7. De geoptimaliseerde HSPC-kweekomstandigheden bevorderen de verrijking van HSC's, wat resulteert in een verhoogde frequentie van gengemodificeerde HSC's in vivo, en verminderen de behoefte aan genmanipulatie van grote doses HSCS, waardoor kosteneffectieve gentherapiebenaderingenworden vergemakkelijkt 8.
Hier wordt een uitgebreid protocol voor HSPC-cultuur beschreven, samen met de infusie en analyse van gen-bewerkte cellen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo experimenten op immunodeficiënte muizen werden goedgekeurd door en uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, India. Granulocyt koloniestimulerende factor (G-CSF) -gemobiliseerde perifere bloedmonsters werden verzameld van gezonde menselijke donoren met geïnformeerde toestemming na het verkrijgen van goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB).
1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNC's) en zuivering van CD34 + cellen
- Voer PBMNC-isolatie uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Voor in vitro HSPC-cultuur en genbewerking is het ideaal om te beginnen met ten minste 1 x 106 HSPC's / groep. Voor in vivo engraftmentanalyse is een startcelnummer van ten minste 5 x 106 HSPC's/groep ideaal als een groep acht muizen bevat en elke muis is doordrenkt met ten minste 6 x 105 cellen. Om een voldoende aantal PBMNC's (~ 1 x 109) voor de procedure te verkrijgen, wordt aanbevolen om te beginnen met 20 ml gemobiliseerd perifeer bloed (mPB).- Verdun na het verzamelen van mPB 20 ml mPB met steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1:1.
OPMERKING: De efficiëntie van G-CSF-mobilisatie kan variëren tussen de individuen9, en daarom varieert het aantal HSPC's verkregen uit 20 ml gemobiliseerd bloed tussen donoren. - Voeg 10 ml dichtheidsgradiëntmedium (Lymphoprep, zie Materiaaltabel) toe aan een buis van 50 ml en laag het verdunde bloed door de zijkanten van de buis in een verhouding van 1:2.
OPMERKING: Het kantelen van de buis van 50 ml onder een hoek van 20 ° terwijl het verdunde bloed wordt toegevoegd, voorkomt dat het zich mengt met Lymphoprep, wat leidt tot een duidelijke scheiding van bloedcomponenten na centrifugatie. - Centrifugeer bij 600 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met een acceleratiesnelheid van 1 m/s² en een vertragingssnelheid van 1 m/s². Gooi de bovenste laag (plasma) weg met behulp van een serologische pipet en oogst de buffy laag die aanwezig is in de interfase (PBMNC's) boven de mediumlaag met dichtheidsgradiënt.
OPMERKING: Aspirateer de buffy laag met behulp van een serologische pipet door deze voorzichtig aan de zijkanten van de buis te draaien. Vermijd het verzamelen van een hoger volume interfase tijdens het aspirateren van de buffy-laag om granulocyten- en RBC-besmetting te voorkomen. - Breng de PBMNC's over in een verse conische buis van 50 ml en verdun de celsuspensie met 1x PBS in een verhouding van 1:2.
OPMERKING: Verdun de celsuspensie met 1x PBS in een verhouding van 1:4 als een teveel aan interfase werd verzameld tijdens het aspirateren van de buffy-vacht. - Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een versnellingssnelheid van 9 m/s² en een vertragingssnelheid van 7 m/s² en gooi het supernatant weg met een serologische pipet. Voeg 30 ml ijskoude RBC-lysisbuffer (zie tabel 7) toe aan de pellet en incubeer gedurende 10 minuten in ijs. Meng door de buis om de 2 minuten om te keren.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een versnellingssnelheid van 9 m/s² en een vertragingssnelheid van 7 m/s² en gooi het supernatant weg. Herhaal stap 1.1.5.-1.1.6. totdat de roodheid van de pellet verdwijnt. Resuspendeer de pellet met basale media (IMDM, zie Tabel van materialen) en voer een celtelling uit met trypanblauw in een Neubauer-kamer10.
OPMERKING: De geïsoleerde PBMC's kunnen onmiddellijk worden gebruikt om CD34+ HSPC's te zuiveren. Als alternatief kunnen de PBMNC's worden gecryopreserveerd en nieuw leven worden ingeblazen wanneer dat nodig is voor CD34+ verrijking. Voor cryopreservatie, centrifugeer 5 x 108 cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten en voeg 4 ml cryomedia toe die IMDM bevatten: FBS: DMSO (zie materiaaltabel) in de verhouding van 7:2:1. - Breng de injectieflacons over in een cryocooler van 1 °C en bewaar ze maximaal 12 uur bij −80 °C. Breng de cryovialen over en bewaar ze in een container met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Verdun na het verzamelen van mPB 20 ml mPB met steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1:1.
- Laat de gecryopreserveerde PBMC's herleven.
- Ontdooi de cryovialen half in een waterbad van 37 °C door <1 min zachtjes te draaien. Breng de celsuspensie van het cryoviaal over in een buis van 50 ml met IMDM in een verhouding van 1:10.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een versnellingssnelheid van 9 m/s² en een vertragingssnelheid van 7 m/s² en gooi het supernatant weg met een serologische pipet.
- Zuiver de CD34+ cellen van PBMNC's volgens de onderstaande stappen.
- Bereid de zuiveringsbuffer voor met steriel 1x PBS met 2% gefilterd foetaal runderserum (FBS). Resuspendeer de PBMNC-celpellet in de buffer volgens tabel 1.
OPMERKING: De buffer moet ca++ en mg++ vrij zijn. - Breng de celsuspensie met 1 x 108-5 x 108 cellen verse of gecryopreserveerde PBMNC's over naar de 5 ml polystyreen buis met ronde bodem (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Voeg DNase (zie materiaaltabel) met een eindconcentratie van 100 μg/ml toe aan de celsuspensie om samenklontering van de cel te voorkomen. We gebruikten een in de handel verkrijgbare kit voor CD34-zuivering met Human CD34 Positive Selection Cocktail en Dextran Rapid Spheres (zie Materiaaltabel). - Voeg in de handel verkrijgbare Human CD34 Positive Selection Cocktail (zie Materiaaltabel) toe in de concentratie van 100 μL/ml cellen en resuspenseer voorzichtig.
- Incubeer bij RT gedurende 30 minuten en resuspenseer de celsuspensie voorzichtig om de 5 minuten. Voeg 50 μL/ml in de handel verkrijgbare Dextran Rapid Spheres toe (zie Materiaaltabel) en resuspenseer voorzichtig.
OPMERKING: Vortex de dextran bollen op hoge snelheid gedurende 5 s om ervoor te zorgen dat de deeltjes gelijkmatig verspreid lijken en voeg ze vervolgens toe aan de cellen. - Incubeer bij RT gedurende 15 minuten en resuspenseer de celsuspensie voorzichtig om de 5 minuten. Maak de celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml met zuiveringsbuffer en resuspenseer deze voorzichtig.
- Plaats de buis in een in de handel verkrijgbare immunomagnetische kolomvrije magneet (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Na incubatie keert u de magneet om en gooit u het supernatant in één continue beweging weg.
OPMERKING: De Cd34+ -cellen met Dextran Rapid Spheres-label blijven door het magnetisch veld aangetrokken tot de zijkanten van de buis. De buis moet gedurende 2-3 s in de omgekeerde positie worden gehouden. Vermijd trillen of afvegen van de druppels die aan de mond van de buis blijven hangen. - Verwijder de buis van de magneet en voeg 2,5 ml zuiveringsbuffer toe. Herhaal stap 1.3.6-1.3.7 vijf keer.
OPMERKING: Tijdens de toevoeging van de zuiveringsbuffer plaatst u de buis in een acute hoek en voegt u buffer toe door de buis te draaien, omdat de cellen zich aan de oppervlaktewanden kunnen hechten terwijl de magneet wordt omgekeerd. - Na het voltooien van vijf wasbeurten, verwijdert u de buis van de magneet, voegt u 4 ml 1x steriele PBS toe en resuspendeert u de celsuspensie. Breng de celsuspensie over naar de centrifugebuis van 15 ml en maak deze tot 10 ml met 1x PBS. Voer een celtelling uit met trypan blue in een Neubauer-kamer10.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT (versnelling ~9 m/s², vertraging ~7 m/s²) en gooi het supernatant weg met een pipet. Om de HSPC's te kweken, resuspendeert u de cellen in HSPC-kweekmedia, zoals vermeld in stap 2.1.
OPMERKING: De excessen van gezuiverde HSPC's werden gecryopreserveerd in een in de handel verkrijgbaar cryopreservatiemedium (zie Materiaaltabel) met een dichtheid van 9 x 106 cellen / ml na het kweken van de HSPCs gedurende 12 uur in HSPC-kweekmedia.
- Bereid de zuiveringsbuffer voor met steriel 1x PBS met 2% gefilterd foetaal runderserum (FBS). Resuspendeer de PBMNC-celpellet in de buffer volgens tabel 1.
- Laat de gecryopreserveerde HSPCs herleven.
- Ontdooi de cryovialen gedurende <1 min in een waterbad van 37 °C door zachtjes te draaien. Breng de celsuspensie in het cryoviaal over in een buis van 50 ml.
- Voeg druppelsgewijs 1% BSA resuspended in 1x PBS toe met constante agitatie en maak het tot 20 ml. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een versnellingssnelheid van 9 m/s² en een vertragingssnelheid van 7 m/s² en gooi het supernatant weg met een serologische pipet.
- Herhaal stap 1.4.2. 1x. Resuspensie van de cellen in HSPC-kweekmedia en -cultuur zoals beschreven in stap 2.1.
2. In vitro kweek van gezuiverde HSPC's
- Bereid de kweekmedia voor met SFEM-II met SCF (240 ng/ml), FLT3 (240 ng/ml), TPO (80 ng/ml), IL6 (40 ng/ml) en 1x antibiotisch antimycotisch (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Vers bereide kweekmedia worden ten zeerste aanbevolen. De media kunnen echter tot 24 uur na bereiding bij 4 °C worden bewaard. - Resuspendeer de CD34+ pellet met de kweekmedia, voeg 3 μL RUS cocktail/ml media toe (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; zie Materiaaltabel), en kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: UM171 (10 nm) kan worden gebruikt om UM729 (500 nM) te vervangen, omdat beide vergelijkbare effecten hebben op HSPC-stamonderhoud7. De injectieflacons kunnen niet meer dan twee keer worden bevroren. - Zaai de gezuiverde cellen in eerste instantie op een samenvloeiing van 5 x 105/ml in in de handel verkrijgbare delta-oppervlaktebehandelde 6-well platen (zie materiaaltabel) om de aanhangcellen te verwijderen.
- De cellen in de suspensie opnieuw ingezaaid bij een samenvloeiing van 2 x 105 cellen/ml in een nieuwe 6-well plaat na 6 uur zuivering.
- Karakteriseer de stam van de HSPC's met behulp van flowcytometrie vóór genbewerking.
- Neem voor flowcytometrieanalyse 1 x 105 cellen in 100 μL 1x PBS en voeg 3 μL (75 ng) CD34 PE, 4 μL (100 ng) CD133 FITC en 4 μL (100 ng) CD90 APC toe (zie Materiaaltabel).
- Incubeer de buis bij RT gedurende 20 minuten in het donker. Was de cellen met 2 ml 1x PBS 2x en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg met een pipet, resuspenseer de celpellet met 150 μL 1x PBS en verkrijg het in flowcytometrie.
OPMERKING: Als het percentage CD34+ cellen <90% is, verhoogt u het aantal wasbeurten tot zes keer in stap 1.3.7. Zaai de gezuiverde HSPC's in kweekmedia en verzamel na 6 uur alleen de cellen in de suspensie. De meeste CD34-cellen hechten zich aan de kweekplaat.
3. Genbewerking van HSPC's
- Voer gids-RNA-reconstitutie uit.
OPMERKING: Synthetisch sgRNA met fosforothioaatmodificaties gericht op de CCR5-locus werd verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel).- Stel voor reconstitutie de thermomenger in op 37 °C en verwarm de 1x TE-buffer (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten voor op 37 °C. Centrifugeer de synthetische chemisch gemodificeerde sgRNA-injectieflacon bij 11.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
- Voeg aan de sgRNA-injectieflacon met 1,5 nM gelyofiliseerd sgRNA 15 μL 1x TE-buffer toe, wat een eindconcentratie van 100 pM/μL oplevert. Resuspendeer zachtjes tot 5x en draai de punt om de hoeken.
- Incubeer in de thermomenger bij 37 °C gedurende 30-40 s met minimaal schudden. Verzamel na een korte spin 15 μL sgRNA en bewaar als 1 μl aliquots (100 pM/μL) bij −80 °C voor toekomstig gebruik gedurende maximaal 1 jaar.
OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk vriezen-ontdooien. Een maximum van één vries-dooicyclus van aliquoted gRNA wordt aanbevolen.
- Voer nucleofection uit volgens de onderstaande stappen.
- Tel op dag 3 van de kweek de cellen met neubauer's verbeterde celtelkamer10.
- Neem voor RNP-bereiding (voor het nucleofecteren van 2 x 105 cellen) 1 μL sgRNA gericht op het CCR5-gen (100 pM) in een buis van 0,5 ml en voeg 2,65 μL Cas9 (50 pM) toe door voorzichtig rond de onderkant van de injectieflacon te draaien. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
OPMERKING: gRNA-sequentie: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG. - Voeg voor bufferbereiding 16,4 μL primaire P3-celoplossing en 3,6 μL supplement toe, geleverd met de commerciële nucleofectionkit (zie Materiaaltabel) en incubeer bij RT gedurende 10 minuten. Bereid kweekmedia voor (stap 2.1.) en pre-incubeert het bij 37 °C in de kweekplaat vóór nucleofection.
- Pellet 2 x 105 cellen door centrifugeren op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet met 20 μL van de buffer bereid in stap 3.2.3. en resuspen het voorzichtig.
- Meng de celsuspensie voorzichtig met het voorbereide RNP-complex (stap 3.2.2.) zonder luchtbellen. Breng de suspensie over naar de commerciële nucleofectionstrip (zie Materiaaltabel) en selecteer de pulscode DZ100 om de cellen te elektropoteren met behulp van de 4D-nucleofector (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de celsuspensie, inclusief de buffer- en RNP-componenten, mag niet hoger zijn dan 27 μL/elektroporatie. - Voor de experimentele controle, pellet 2 x 105 onbewerkte HSPC's door centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT, en resuspenderen van de pellet met 20 μL van de buffer bereid in stap 3.2.3. zonder RNP-complex.
- Voeg 100 μL voorgeïncubeerde kweekmedia (stap 3.2.3.) toe aan de geëlektroopeerde cellen en laat de cellen gedurende 10 minuten ongestoord in de nucleofectiestrook bij RT. Breng na 10 minuten incubatie de inhoud over naar de kweekplaat volgens de experimentele vereisten.
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op niet-homologe end joining (NHEJ)-gemedieerde gerichte verstoring van elke genomische locus met behulp van doelspecifiek gRNA. Hetzelfde protocol kan worden toegepast voor het introduceren van grote deleties door dubbel gRNA op te nemen in stap 3.2.2. 11. Bovendien kan hetzelfde protocol na 10 minuten RNP-incubatie worden gebruikt voor homologiegerichte reparatie (HDR) -gebaseerde genbewerking wanneer het wordt geleverd met een donorsjabloon12. Het protocol is gevalideerd door de gerichte verstoring van AAVS1, pseudo-β-globine, β-globine en de CCR5 locus 7,8.
4. Validatie van genbewerkingsgebeurtenissen in HSPC's
- Voer DNA-extractie uit.
- Voer na 72 uur na nucleofection een celtelling uit met trypanblauw in een Neubauer-kamer. Verzamel 1 x 105 gen-bewerkte HSPC's voor DNA-extractie.
- Centrifugeer de cellen op 11.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg met een pipet. Resuspendeer de pellet met 1 ml 1x PBS en herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg. Voeg aan de pellet 20 μL snelextractoplossing toe (zie materiaaltabel) voor 1 x 105 cellen en resuspendeer de pellet.
- Incubeer het mengsel in een thermocycler bij 68 °C gedurende 30 min. Incubeer het mengsel na een korte spin in een thermocycler bij 98 °C gedurende 10 minuten. Meet de concentratie dna in het ruwe lysaat met behulp van een spectrofotometer13.
- Voer de amplificatie van de gen-bewerkte locus uit door PCR.
- Ontwerp met primer3 (zie materiaaltabel) de locusspecifieke primers over de dubbelstrengsbreuk (DSB) met amplicongroottes variërend tussen 400-700 bp (tabel 2).
OPMERKING: Primer3 is een webgebaseerde open-source tool voor het ontwerpen van PCR-primers. - Bereid het reactiemengsel zoals aangegeven in tabel 3 en laat de thermocycler draaien met de in tabel 4 vermelde cyclusomstandigheden. Om de versterking van de gewenste locus te bevestigen, mengt u 5 μL PCR-product met 6x ladende kleurstof en laadt u op de 2% agarose gel-elektroforese gemaakt met tae-buffer.
OPMERKING: De TAE-buffercomponenten zijn opgenomen in tabel 7. - Voer 30-40 minuten uit bij 100 V en detecteer de amplicon met behulp van een gelbeeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel). Volgens het PCR-zuiveringsprotocol (zie materiaaltabel), reinigt u het versterkte PCR-product.
- Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product met behulp van een nanodruppelspectrofotometer (zie Materiaal tabel).
- Ontwerp met primer3 (zie materiaaltabel) de locusspecifieke primers over de dubbelstrengsbreuk (DSB) met amplicongroottes variërend tussen 400-700 bp (tabel 2).
- Voer Sanger-sequencing en verwijdering van de vrije kleurstofafsluiting uit volgens de onderstaande stappen.
- Bereid het reactiemengsel zoals aangegeven in tabel 5. Laat de thermocycler draaien met de fietsomstandigheden zoals vermeld in tabel 6.
- Voeg 10 μL HighPrep DTR-reagens (zie Materiaaltabel) en 40 μL 85% ethanol toe aan 10 μL PCR-monster in een buis van 1,5 ml en meng dit door ongeveer 8x-10x krachtig te pipetteren.
- Incubeer het mengsel op RT gedurende 5 minuten en plaats de buis van 1,5 ml gedurende 5 minuten op de magnetische scheidingsstandaard. Verwijder het supernatant met een pipet en voeg 100 μL 85% ethanol toe.
- Gooi het supernatant weg en herhaal stap 4.3.3. 1x. Haal de buizen van 1,5 ml uit de magneetstandaard en incubeer ze bij 37 °C gedurende 10 minuten in een thermomenger om de ethanol te drogen.
- Resuspenseer de kralen krachtig met 40 μL nucleasevrij water en incubeer bij RT gedurende 5 minuten. Plaats de buis gedurende 5 minuten op de magnetische scheidingsstandaard en voer Sanger-sequencing uit volgens gepubliceerde rapporten14,15.
- Voer een indelfrequentiebeoordeling uit met ICE-analyse16.
- Gebruik Synthego (zie Materiaaltabel) voor de ICE-analyse.
- Upload ab1-bestanden van bewerkte en onbewerkte monsters en gRNA-sequenties en klik op analyseren om de frequentie van de Indels te krijgen.
5. Transplantatie van gen-bewerkte HSPC's
- Voorwaarde voor de in de handel verkrijgbare NOD scid gamma mouse (NSG)17 en NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 muizen (zie Materiaaltabel) voor beenmergtransplantatie.
- Kies voor het conditioneren van NSG-muizen 6-8 weken oude vrouwelijke muizen en scheid ze in controle- en bewerkte groepen door geblindeerde randomisatie.
- Plaats de NSG-muizen in de taartkooien en bestraal bij 3,5 Gy met behulp van een in de handel verkrijgbare bestralingsinstallatie (zie Materiaaltabel) 6-8 uur vóór HSPC-transplantatie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de muizen vóór bestraling te wegen en muizen met een gewicht van > 20 g worden onderworpen aan bestraling. - Voor het conditioneren van 6-8 weken oude mannelijke en vrouwelijke NBSGW-muizen, injecteert u busulfan (zie materiaaltabel) door intraperitoneale (IP) injectie in een dosis van 12,5 mg / kg lichaamsgewicht 48 uur vóór HSPC-transplantatie.
OPMERKING: Busulfan-conditionering verhoogt de engraftment van menselijke HSPC's in het beenmerg van de muis en vermindert de noodzaak om grote doses gen-bewerkte HSPC's19 te infunderen. Het ideale bereik van busulfan dosis voor conditionering ligt tussen 10 mg / kg tot 15 mg / kg lichaamsgewicht. Verhoogde doseringen van busulfan zullen resulteren in ernstige sterfteproblemen.
- Bereid de celsuspensie voor op beenmergtransplantatie.
- Breng na 10 minuten incubatie van de gen-bewerkte HSPC's in de nucleofectionstrip (zie stap 3.2.7.) de celsuspensie over naar 10 ml 1x PBS. Tel de cellen met behulp van Neubauer's verbeterde celtelkamer10.
- Voor de infusie van één muis pelleteert u 6 x 105 cellen in een buis van 1,5 ml door centrifugeren op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooit u het supernatant voorzichtig weg met een pipet zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de celpellet met 100 μL 1x PBS.
- Infundeer de HSPC's door staartaderinjectie volgens de onderstaande stappen.
- Plaats de geconditioneerde NSG- of NBSGW-muis in de muisverstuiver (zie Materiaaltabel).
- Houd de muisstaart vast en druk voorzichtig op de plug om de muis in bedwang te houden. Veeg de muizenstaart voorzichtig af met 70% ethanol. Aspirateer 100 μL van de celsuspensie in een insulinespuit van 31 G.
OPMERKING: Vermijd bubbels in het infusieproduct strikt door zachtjes op de spuit te tikken of de zuiger voorzichtig te bewegen. - Richt het licht van de infraroodlamp op de staart gedurende 30-40 s en bedek het lichaamsgedeelte van de muis met vouwen van tissuepapier. Steek het schuine deel van de naald voorzichtig in de linker- of rechter caudale staartader onder een hoek van 20°.
- Til de staart op met de linker wijsvinger om deze met de spuit in de vlakke as te houden. Duw op de zuiger om de celsuspensie in de ader te brengen. Oefen zachte druk uit in de buurt van het doorboorde gebied met tissuepapier en trek de naald eruit.
- Na 30 s zachte druk uitoefenen, verwijdert u de muis uit de fixator en brengt u deze over naar de kooi.
6. Beoordeling van het potentieel voor transplantatie op korte termijn
- Na 4 weken menselijke HSPC-transplantatie, beoordeelt u de kortdurende engraftment door bloed te verzamelen via de orbitale veneuze sinus in een heparinized buis met behulp van een Pasteur-pipet.
- Anesthetiseer het dier met ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneale (IP) injectie voorafgaand aan de monstername.
OPMERKING: Oefen voorzichtig druk uit op de achterpoten van de verdoofde muis om het verlies van gevoel te bevestigen. - Na het verdoven, positioneer het dier in ventrale lighouding en krab de muis voorzichtig om het oog te openen, waardoor de bol van het oog enigszins kan uitsteken.
- Steek de Pasteur pipet voorzichtig in de mediale canthus van het oog onder het nicterende membraan in een hoek van 30°-45°. Nadat u de Pasteur-pipet op de juiste positie hebt geplaatst, oefent u lichte druk uit op de buis en begint u de buis voorzichtig te draaien.
OPMERKING: Bloed zal de buis binnendringen door capillaire actie zodra de retro-orbitale plexus wordt doorboord.
- Anesthetiseer het dier met ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneale (IP) injectie voorafgaand aan de monstername.
- Na het verzamelen van 50-80 μL perifeer bloed, trekt u de pipet voorzichtig terug uit de mediale canthus van het oog.
- Om het bloeden rond de baan van het oog te stoppen, sluit u de oogleden en oefent u zachte druk uit met een stuk gaas.
- Kleur de cellen met respectievelijke antilichamen (tabel 8) en incubeer de cellen in het donker gedurende 25-30 minuten bij RT.
- Voeg voor RBC-lysis aan de celsuspensie 3 ml 1x RBC-lysisbuffer toe (tabel 7) en incubeer gedurende 10 minuten in ijs.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal stap 6.4. totdat de roodheid van de pellet verdwijnt.
- Voeg 2 ml 1x PBS toe en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT om het celafval geassocieerd met RBC-lyse te verwijderen.
- Voeg 150 μL 1x PBS toe aan de pellet en ga vervolgens verder met immunofenotypering voor flowcytometrie om het percentage getransplanteerde menselijke cellen te evalueren7.
7. Beoordeling van het transplantatiepotentieel op lange termijn
- Euthanaseer de muizen.
- Offer de getransplanteerde muizen in week 16 op voor engraftmentanalyse door 100% CO 2-verstikking20 in de muizenkooi te introduceren gedurende 1-2 minuten.
- Bevestig euthanasie door hart- en ademhalingsstilstand en de afwezigheid van spierbewegingen vast te stellen met zacht knijpen van de achterpoten. Als aan beide voorwaarden is voldaan, verwijder dan de muizen uit de kooi.
- Om menselijk celchimerisme te evalueren, verzamelt u de cellen uit het beenmerg.
- Isoleer cellen uit het beenmerg volgens de onderstaande stappen.
- Maak na euthanasie een verticale incisie 1 cm boven de urethra en verleng tot 1 cm onder het diafragma. Snijd horizontaal op de hoeken van het ingesneden gebied om het abdominale gebied wijd te openen.
- Ontleed het dijbeen en het scheenbeen en verwijder de zachte weefsels die met een schaar aan het dijbeen en scheenbeen zijn bevestigd. Schrob voorzichtig met tissuepapier en maak een klein gaatje met een diameter van niet hoger dan 0,2 cm aan de onderkant van een microcentrifugebuis van 0,5 ml met behulp van een scalpel.
- Verwijder de proximale uiteinden van de botten met behulp van een scalpel en plaats de botten met de gesneden kant naar het gat van de microcentrifugatiebuis van 0,5 ml. Plaats de buis van 0,5 ml met de botten in de buis van 1,5 ml met 100 μL steriele 1x PBS.
- Sluit het deksel, draai de buisjes gedurende 3 minuten op 1000 x g onder steriele omstandigheden bij RT en gooi de buisjes van 0,5 ml met botten met een lege mergholte weg. Voeg 1 ml 1x PBS toe aan de reactiebuis van 1,5 ml met beenmerg en resuspenseer de cellen voorzichtig ongeveer niet minder dan 10x met behulp van een pipet van 1 ml.
- Breng 1 ml van de celsuspensie over naar een buis van 15 ml met 9 ml RBC-lysisbuffer. Incubeer de cellen in ijs gedurende 7 minuten met een zachte inversie van de buizen om de 2 minuten.
- Na 7 min, centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij RT met een versnelling van 9 m/s² en een vertraging van 7 m/s². Herhaal stap 7.2.5. totdat een heldere bleekwitte pellet wordt waargenomen.
- Resuspendeer de cellen met 10 ml steriele 1x DPBS en filter de beenmergsuspensie met behulp van een 40 μm celzeef op een buis van 15 ml. Spoel de celzeef af met 2 ml 1x PBS 2x om het verlies van cellen te voorkomen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g, RT, en gooi het supernatant weg met een pipet. Resuspendeer de cellen met 10 ml IMDM met DNase-I in een werkconcentratie van 100 μg/ml.
- Neem 1 x 106 mononucleaire cellen in een FACS-buis voor engraftmentanalyse door flowcytometrie. Om de genbewerkingsfrequentie in getransplanteerde mononucleaire beenmergcellen te beoordelen, pelleteert u 1 x 106 mononucleaire cellen bij 11.000 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooit u het supernatant weg met een pipet.
8. Immunofenotypering
- Incubeer de beenmergcellen met 1,5 μL van een gezuiverd recombinant humaan Fc-eiwit (zie Materiaaltabel) gedurende 15 minuten bij 4 °C voordat u kleurt met antilichamen.
OPMERKING: Het menselijke Fc-eiwit dat hier wordt gebruikt, is geformuleerd om niet-specifieke antilichaamkleuring veroorzaakt door receptoren voor IgG te blokkeren; daardoor verhoogt het de specificiteit van antilichaamlabeling 7,21,22. Voorafgaand aan antilichaamkleuring van de doelcellen, voert u antilichaamtitratie uit. Het wordt ten zeerste aanbevolen om FMO-besturingselementen en isotyperegelaars op te nemen tijdens het werken aan meerkleurige flowcytometrische analyse. - Om het percentage menselijke celtransplantatie door flowcytometer te bepalen, neemt u 1 x 106 mononucleaire cellen in een FACS-buis en kleurt u de cellen zoals vermeld in tabel 8.
- Incubeer de cellen in het donker gedurende 25-30 minuten bij RT. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg met een pipet.
- Verkrijg de cellen door een flowcytometer, gate de celpopulatie (P1) met behulp van voorwaartse (FSC) en zijverstrooiingen (SSC) van mononucleaire cellen en pas de spanning aan volgens de celpopulatie. Verwerven van 50.000 celgebeurtenissen in de P1-populatie.
- Om menselijke leukocytenpopulaties in het beenmerg van muizen te analyseren, gate de menselijke CD45+ cellen en muis CD45.1 van de P1-celpopulatie met behulp van een flowcytometriegegevensanalysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Bereken de engraftment van menselijke cellen met behulp van de volgende formule8:
% van de engraftment = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
OPMERKING: De drempel voor menselijke engraftment werd beschouwd als 0,1% positief voor CD45. - Analyseer verder het percentage hCD34+ cellen van menselijke CD45+ cellen om de repopulatiecellen op lange termijn te evalueren. Om de multilineaire reconstitutie van de getransplanteerde menselijke cellen te beoordelen, kleurt u 100 μL celsuspensie volgens tabel 9.
OPMERKING: De antilichamen moeten vóór experimenten worden getitreerd. - Met behulp van de flowcytometriesoftware wordt de hCD45 afgesloten van de P1-celpopulatie en, vanuit hCD45, het percentage hCD19, hCD3 en hCD13 (lymfoïde en myeloïde subsets) gekwantificeerd.
9. Beoordeling van de genbewerkingsfrequentie in geënte mononucleaire beenmergcellen
- Voeg aan de mononucleaire celpellet van het beenmerg 50 μL snelle extractoplossing toe (zie materiaaltabel) voor 5 x 105 cellen en resuspendeer de pellet.
- Incubeer het mengsel in een thermocycler bij 68 °C gedurende 30 min. Incubeer het mengsel na een korte spin in een thermocycler bij 98 °C gedurende 10 minuten.
- Meet de concentratie van DNA in het ruwe lysaat met behulp van een spectrofotometer. Volg de stappen 4.2.-4.4. om de genbewerkingsfrequentie te valideren met behulp van ICE-analyse 8,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De huidige studie identificeert ideale HSPC-kweekomstandigheden die het behoud van CD34 +CD133 + CD90 + HSC's in ex vivo cultuur vergemakkelijken. Om de kweekverrijking van HSC's samen met de verbeterde generatie van gengemodificeerde HSC's aan te tonen, worden de geoptimaliseerde procedures voor PBMNC-isolatie, CD34 + celzuivering, cultuur, genbewerking, transplantatie, karakterisering van engraftment en gen-gemodificeerde cellen in vivo verstrekt (figuur 1). Na de zuivering werd flowcytometrie-evaluatie uitgevoerd om de HSPC-markers te controleren en HSPC's werden gedurende 72 uur gekweekt. Na 72 uur cultuur werden de HSPC's nucleofecteerd met Cas9 RNP en nog eens 2 dagen gekweekt. De geoptimaliseerde kweekomstandigheden met de RUS-cocktail vertoonden een verhoogde levensvatbaarheid en hogere frequentie van CD34+CD133+CD90+ HSC's en een verhoogde genbewerkingsfrequentie (figuur 2). Om verder aan te tonen dat de geoptimaliseerde kweekomstandigheden de frequentie van gengemodificeerde cellen in vivo verhogen, werden dag 3 HSPC's gericht op de CCR5-locus gen-bewerkt en geïnfundeerd in sub-letaal bestraalde NSG-muizen. De engraftment van menselijke cellen in het beenmerg van muizen (BM) werd 16 weken na infusie geanalyseerd (figuur 3A). Flowcytometrie-analyse van menselijke CD45+ (hCD45) cellen in NSG-muizen toonde verhoogde engraftment in de kweekomstandigheden (figuur 3B,C). Analyse van de genbewerkingsfrequentie in de BM-cellen van de muis toonde verhoogde engraftment van gen-bewerkte HSPC's in RUS-aangevulde kweekomstandigheden (figuur 3D).
Figuur 1: Samenvatting van het huidige onderzoek. Grafische samenvatting van de procedure die betrokken is bij het isoleren van PBMNC's, de magnetische verrijking van CD34 + -cellen van PBMNC's, kweken, de karakterisering van menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's), genbewerking en transplantatie wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De RUS-cocktail verrijkt de frequentie van HSC's. De mPB-HSPC's werden gekweekt in de stamcelkweekmedia die cytokines met vehikel (DMSO) en RUS-cocktail bevatten gedurende 3 dagen en gen-bewerkt met 25 pM Cas9-RNP. De gen-bewerkte cellen werden geanalyseerd door FACS voor de markers voor HSPC's 48 uur na nucleofection. (A) Stroomplots vertegenwoordigen de levende cellen (7AAD-) en CD34+ CD90+ populatie. (B) Het percentage en de frequentie van indelpatronen geanalyseerd 72 h na bewerking in de DMSO en RUS-behandelde groep. (C) Het absolute aantal CD34+ CD90+ cellen geanalyseerd 48 h na bewerking (n = 2) (donor = 1). (D) Het absolute aantal totale nucleated cellen (TNC) geanalyseerd 48 h na bewerking (n = 2) (donor = 1). Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM, *p ≤ 0,05 (ongepaarde t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geoptimaliseerde kweekomstandigheden verhogen de frequentie van gen-gemodificeerde cellen in vivo. (A) Schematische weergave van het experiment. (B) Representatieve FACS-plot met de hCD45+ cellen in de BM van de muis. De inzet verwijst naar menselijke cellen (links) en muiscellen (rechts). HSPC's werden gedurende 3 dagen gekweekt, gen-bewerkt met sgRNA op dag 3 en onmiddellijk na elektroporatie getransplanteerd. (C) De transplantatie van menselijke cellen in bm van muizen 16 weken na infusie (n = 4). (D) Het chimerisme van de menselijke gengemodificeerde cel (hCD45+ gen-bewerkte cellen) in bm van de muis 16 weken na infusie (n = 4) (donor = 1). Elke stip vertegenwoordigt een individuele muis en de gegevenspunten zijn afkomstig van een afzonderlijk experiment. Foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM, *p≤ 0,05 (ongepaarde t-test). De figuur is aangepast met toestemming van Christopher et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal cellen | Zuiveringsbuffer (ml) |
| < 1 x 107 cellen | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 cellen | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 cellen | 1 |
Tabel 1: Het volume van de zuiveringsbuffer om de cellulaire suspensie voor te bereiden op CD34+ celzuivering.
| Naam primer | Volgorde |
| CCR5 Vooruit | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5 Achteruit | AGAGACGCAAACACAGCCA |
| CCR5 sequencing Forward primer | AATGTAGACATCTATGTAGG |
Tabel 2: Primervolgorde voor het versterken van de CCR5-locus.
| Onderdelen | Reactie van 50 μL |
| Buffer (5x) | 10 μL |
| Voorwaartse primer (10 μM) | 1 μL |
| Omgekeerde primer (10 μM) | 1 μL |
| DNTP | 4 μL |
| Polymerase | 1 μL |
| Genomisch DNA | 200 ng |
| Nucleasevrij water | tot 50 μL |
Tabel 3: Het reactiemengsel voor het versterken van de CCR5-locus met behulp van PCR.
| Stappen | Duur | Temperatuur | Aantal cycli |
| Initiële denaturatie | 1 min | 95 °C | 1 |
| Denaturatie | 10 s | 98 °C | 35 |
| Annealing | 15 s | 56 °C | |
| Extensie | 30 s | 68 °C | |
| Definitieve verlenging | 1 min | 72 °C | 1 |
| Houden | ∞ | 15 °C |
Tabel 4: Thermocycler voorwaarden voor het versterken van de CCR5 locus.
| Onderdelen | Reactie van 10 μL |
| Buffer (5x) | 2 μL |
| primer (2 μM) | 1,6 μL |
| RR-mix | 0,75 μL |
| PCR-opruimproduct | 80 ng |
| Nucleasevrij water | tot 10 μL |
Tabel 5: Het reactiemengsel voor Sanger-sequencing PCR.
| Stappen | Duur | Temperatuur | Aantal cycli |
| Denaturatie | 15 s | 96 °C | 27 |
| Annealing | 20 s | 55 °C | |
| Extensie | 4 min. | 60 °C | |
| Houden | ∞ | 15 °C |
Tabel 6: Thermocycler condities voor Sanger sequencing PCR.
| Buffer | Compositie |
| 10x RBC lysis buffer – 100 ml (pH – 7,3) | 8,26 g NH4Cl, 1,19 g NaHCO3, 200 μL EDTA (0,5 M, pH8) |
| 50x TAE buffer (pH – 8,3) | Los 50 mM EDTA natriumzout, 2 M Tris, 1 M ijsazijn op in 1 L water |
Tabel 7: Buffersamenstellingen
| Antilichamen | Volume |
| Anti-menselijke CD45 APC | 3 μL |
| Anti-muis CD45.1 PerCP-Cy5 | 4,5 μL |
| Anti-muis CD34 PE | 3 μL |
Tabel 8: Antilichamen die worden gebruikt voor de beoordeling van menselijke celtransplantatie.
| Antilichamen | Volume |
| Anti-menselijke CD45 APC | 3 μL |
| Anti-muis CD19 PerCP | 15 μL |
| Anti-muis CD13 PE | 15 μL |
| Anti-muis CD3 PE-Cy7 | 2 μL |
Tabel 9: Antilichamen die worden gebruikt voor het beoordelen van het aandeel multilineage cellen afgeleid van getransplanteerde HSPC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succesvolle resultaat van HSPC-gentherapie is voornamelijk afhankelijk van de kwaliteit en kwantiteit van enttable HSC's in het transplantaat. De functionele eigenschappen van HSC's worden echter sterk beïnvloed tijdens de voorbereidende fase van gentherapieproducten, onder meer door in vitro kweek en toxiciteit geassocieerd met de genmanipulatieprocedure. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we ideale HSPC-kweekomstandigheden geïdentificeerd die de stamheid van CD34 + CD133 + CD90 + HSC's in ex vivo cultuur behouden. Veel onderzoeksgroepen hebben SR1 of UM171 of andere moleculen gebruikt als op zichzelf staande moleculen om navelstrengbloed (UCB) HSPCs in vitro23,24 uit te breiden. Een eerdere studie gebruikte een combinatie van zowel SR1 als UM17125. De kleine moleculen en cytokines van het kweekmedium werden specifiek geoptimaliseerd voor gemobiliseerde volwassen HSPC's en hun toepassing in autologe gentherapie. Het screeningsexperiment toonde aan dat het combineren van drie kleine moleculen Resveratrol, UM729 en SR1 belangrijk is voor het genereren van een groot aantal CD34 + CD90 + -cellen en het remmen van de proliferatie van gedifferentieerde en toegewijde voorlopercellen. De UM729 in de RUS cocktail kan worden vervangen door UM171. De commerciële inkoop van UM171 is echter minder haalbaar. De cytokineconcentraties zijn overgenomen uit het protocol dat werd gebruikt in klinische studies26 om de variabiliteiten tijdens het opschalingsproces te verminderen. De cytokinecocktail bevat IL6 in plaats van IL3 om de proliferatie van voorlopercellen en HSC-uitputting in vitro27 te minimaliseren. Het bereiden van verse aliquots van de kweekmedia (basale media + RUS + cytokinecocktails) wordt aanbevolen om experimentele variatie te verminderen en een hoge reproduceerbaarheid te verkrijgen. Het protocol is van toepassing op zowel NHEJ- als HDR-gemedieerde genbewerking. Met name de HSPC-cultuur van 48-72 uur vóór elektroporatie en 24 uur na elektroporatie is cruciaal voor HDR-genbewerking. De geoptimaliseerde kweekomstandigheden zouden de HDR-genbewerking ten goede moeten komen door de stamcellen te behouden. Er werd ook waargenomen dat de kweekcondities lentivirale transductie in langdurige HSC's ondersteunen. Dit suggereert dat, als virale deeltjes zoals AAV6 of IDLV worden gebruikt als EEN HDR-donor, de HDR-bewerkingsefficiëntie naar verwachting zal verbeteren, omdat de geoptimaliseerde cultuuromstandigheden de donorlevering in HSC's bevorderen.
Om de uitkomsten van genbewerking te beoordelen, waaronder NHEJ en HDR, wordt NGS-analyse, sonde- of ddPCR-analyse of Sanger-sequencing 7,8,28 voorgesteld, gevolgd door deconvolutie met behulp van online tools (ICE / ICE Knock-In)16, vanwege het robuuste kwantitatieve karakter. Als alternatief kan een T7-endonucleasetest worden uitgevoerd op bewerkte DNA-monsters en kunnen de gefragmenteerde DNA-banden worden gekwantificeerd met ImageJ. De T7-endonuclease-assaybenadering is echter minder nauwkeurig dan deconvolutieanalyse en richt zich op next-generation sequencing.
Het transplantatieprotocol wordt ook geoptimaliseerd door de NBSGW-muizen te conditioneren met busulfan, waardoor lage celdoses HSPC-engraftment en herbevolking kunnen beoordelen. Over het algemeen moet deze procedure de doses HSPC's verminderen die nodig zijn voor genmanipulatie en de toegankelijkheid van HSPC-gentherapie in ontwikkelingslanden vergroten.
In deze studie werden de protocollen voor PBMNC-isolatie, CD34+ HSPC-zuivering, genbewerking en validatie en beoordeling van de getransplanteerde gen-bewerkte HSPC's in het beenmerg van muizen aangetoond. Het is ook bewezen dat de geoptimaliseerde HSPC-cultuur CD34 + CD133 + CD90 + HSPC's verrijkt en het chimerisme van gen-bewerkte cellen in vivo verhoogt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen bestaan.
Acknowledgments
De auteurs willen het personeel van de flowcytometriefaciliteit en dierfaciliteit van CSCR erkennen. A. C. wordt gefinancierd door een ICMR-SRF-fellowship, K. V. K. wordt gefinancierd door een DST-INSPIRE-fellowship en P. B. wordt gefinancierd door een CSIR-JRF-fellowship. Dit werk werd gefinancierd door het Department of Biotechnology, Government of India (subsidienummer BT / PR26901 / MED / 31/377/2017 en BT / PR31616 / MED / 31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
