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Tomografía por emisión de positrones cardíacos de alta resolución/tomografía computarizada para animales pequeños

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64066
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 1
1CNR Institute of Clinical Physiology, 2Sant’Anna School of Advanced Studies, 3Fondazione Regione Toscana/CNR “G. Monasterio”

Summary

Aquí, presentamos un protocolo experimental de imagen para la cuantificación de la función cardíaca y la morfología utilizando tomografía por emisión de positrones de alta resolución / tomografía computarizada para animales pequeños. Se consideran tanto ratones como ratas, discutiendo los diferentes requisitos de los agentes de contraste de tomografía computarizada para las dos especies.

Abstract

La tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada (TC) se encuentran entre las técnicas de diagnóstico por imágenes más empleadas, y ambas sirven para comprender la función cardíaca y el metabolismo. En la investigación preclínica, se emplean escáneres dedicados con alta sensibilidad y alta resolución espacio-temporal, diseñados para hacer frente a los exigentes requisitos tecnológicos planteados por el pequeño tamaño del corazón y las frecuencias cardíacas muy altas de ratones y ratas. En este artículo, se describe un protocolo bimodal de imágenes PET / CT cardíaco para modelos experimentales de ratón y / o rata de enfermedades cardíacas, desde la preparación animal y la adquisición y reconstrucción de imágenes hasta el procesamiento y visualización de imágenes.

En particular, la exploración PET de fluorodesoxiglucosa ([18 F]FDG) marcada con 18F permite la medición y visualización del metabolismo de la glucosa en los diferentes segmentos del ventrículo izquierdo (VI). Los mapas polares son herramientas convenientes para mostrar esta información. La parte de TC consiste en una reconstrucción 3D resuelta en el tiempo de todo el corazón (4D-CT) mediante gating retrospectivo sin electrocardiografía (ECG), lo que permite la evaluación morfofuncional del VI y la posterior cuantificación de los parámetros de función cardíaca más importantes, como la fracción de eyección (FE) y el volumen sistólico (SV). Utilizando un escáner PET/CT integrado, este protocolo se puede ejecutar dentro de la misma inducción de anestesia sin necesidad de reposicionar al animal entre diferentes escáneres. Por lo tanto, la PET/CT puede verse como una herramienta integral para la evaluación morfofuncional y metabólica del corazón en varios modelos animales pequeños de enfermedades cardíacas.

Introduction

Los modelos animales pequeños son extremadamente importantes para el avance de la comprensión de las enfermedades cardiovasculares 1,2. Las herramientas de diagnóstico por imágenes no invasivas han revolucionado la forma en que vemos la función cardíaca en las últimas décadas, tanto en entornos clínicos como preclínicos. En lo que respecta a los modelos animales pequeños de enfermedades cardíacas, se han desarrollado herramientas de imagen específicas con una resolución espaciotemporal muy alta. Por lo tanto, tales instrumentos pueden satisfacer la necesidad de cuantificación precisa de los parámetros metabólicos y cinéticos de miocardio relevantes en los corazones muy pequeños y de movimiento muy rápido de ratones y ratas en modelos de enfermedades específicas, como la insuficiencia cardíaca (IC)3 o el infarto de miocardio (IM)4. Hay varias modalidades disponibles para este propósito, cada una con sus propias fortalezas y debilidades. La imagen por ultrasonido (US) es la modalidad más utilizada debido a su gran flexibilidad, resolución temporal muy alta y costo relativamente bajo. La adopción de imágenes cardíacas estadounidenses en animales pequeños ha aumentado considerablemente desde el advenimiento de los sistemas que utilizan sondas con frecuencia ultra alta5,6, con resoluciones espaciales inferiores a 50 μm.

Entre las principales desventajas de la ecografía para imágenes cardíacas totalmente 3D está la necesidad de exploraciones lineales a lo largo del eje cardíaco montando la sonda en una etapa de traducción motorizada para crear una pila completa de imágenes dinámicas en modo B de todo el corazón7. Eventualmente, este procedimiento da lugar (después de un registro espacial y temporal preciso de las imágenes adquiridas en cada posición de la sonda) a una imagen 4D con diferentes resoluciones espaciales entre las direcciones dentro y fuera del plano. El mismo problema de resolución espacial no uniforme ocurre en la RM cardíaca (RMC)8 , que todavía representa el estándar de oro en la imagen funcional del corazón. En cambio, se pueden obtener imágenes 3D isotrópicas reales utilizando tanto la tomografía computarizada (TC) como la tomografía por emisión de positrones (PET)9. El PET proporciona una herramienta muy sensible en términos de señal de imagen por cantidad de sonda inyectada (en el rango nanomolar), a pesar de que sufre de una resolución espacial reducida en comparación con CT, MR o US. La principal ventaja del PET es su capacidad para mostrar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la fisiopatología del órgano. Por ejemplo, una exploración PET después de la inyección de [18F]FDG permite la reconstrucción de un mapa 3D del metabolismo de la glucosa en el cuerpo. Al combinar esto con la adquisición de datos dinámicos (es decir, resueltos en el tiempo), el modelado cinético del trazador se puede utilizar para calcular mapas paramétricos de las tasas metabólicas de captación de glucosa (MRGlu), que proporcionarán información importante sobre la viabilidad miocárdica10.

La TC requiere volúmenes significativos de agentes de contraste externos (AC) a altas concentraciones (hasta 400 mg de yodo por ml) para proporcionar una mejora medible de los componentes tisulares relevantes (por ejemplo, sangre frente a músculo), pero sobresale en resolución espacial y temporal, especialmente cuando se utilizan escáneres micro-CT de última generación diseñados para imágenes de animales pequeños. 11 Un modelo típico de enfermedad en el que se puede aplicar la PET/TC cardíaca es la evaluación experimental del infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca y la respuesta relacionada con la terapia. Una forma común de inducir IM en animales pequeños es mediante la ligadura quirúrgica de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD)12,13 y luego evaluando longitudinalmente la progresión de la enfermedad y la remodelación cardíaca en los días posteriores4. Sin embargo, la evaluación morfofuncional cuantitativa del corazón en animales pequeños es ampliamente aplicable también para otros modelos de enfermedad, como la evaluación del efecto del envejecimiento sobre la función cardíaca14 o la expresión alterada del receptor en modelos de obesidad15. El protocolo de imagen presentado no se limita a ningún modelo de enfermedad dado y, por lo tanto, podría ser del más amplio interés en varios contextos de investigación preclínica con roedores pequeños.

En este artículo, presentamos un protocolo experimental de principio a fin para imágenes cardíacas utilizando PET / CT integrado en animales pequeños. Aunque el protocolo presentado está diseñado para un escáner integrado bimodal específico, las partes PET y CT del procedimiento descrito podrían realizarse de forma independiente en escáneres separados de diferentes fabricantes. En el escáner PET/CT en uso, la secuencia de operaciones se organiza en un flujo de trabajo preprogramado. Las ramas principales de cada flujo de trabajo son uno o más protocolos de adquisición; Cada protocolo de adquisición puede tener una o más ramas para protocolos de preprocesamiento específicos y, a su vez, cada protocolo de preprocesamiento puede tener una o más ramas para protocolos de reconstrucción específicos. Se describen tanto la preparación del animal en el lecho de imagen como la preparación de los agentes externos que se inyectarán durante los procedimientos de imagen. Después de completar el procedimiento de adquisición de imágenes, se proporcionan procedimientos de ejemplo para el análisis cuantitativo de imágenes basado en herramientas de software comúnmente disponibles. El protocolo principal está diseñado específicamente para modelos de ratón; A pesar de que el ratón sigue siendo la especie más utilizada en este campo, también mostramos una adaptación del protocolo para imágenes de ratas al final del protocolo principal. Se muestran resultados representativos tanto para ratones como para ratas, lo que demuestra el tipo de resultado que podría esperarse con los procedimientos descritos. Se realiza una discusión exhaustiva al final de este documento para enfatizar los pros y los contras de la técnica, los puntos críticos, así como la forma en que se podrían usar diferentes radiotrazadores PET casi sin modificación en los pasos preparatorios y de adquisición / reconstrucción.

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Protocol

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de las Directrices internacionales sobre el manejo de animales de laboratorio, exigidas por la Directiva Europea (Directiva 86/609 / CEE de 1986 y Directiva 2010/63 / UE) y las leyes italianas (D.Lgs. 26/2014).

1. Configuración de los protocolos de imágenes PET/CT y flujo de trabajo

NOTA: El protocolo presentado aquí está diseñado específicamente para imágenes cardíacas de modelos de ratón. Trabajar con ratas puede implicar algunas modificaciones al protocolo real, principalmente debido al mayor tamaño del animal (aproximadamente 10 veces más pesado). Las modificaciones para las imágenes de ratas se mencionan específicamente en los pasos; Si no se mencionan modificaciones, entonces los mismos pasos para las imágenes de ratón se pueden utilizar para ratas.

  1. Abra la interfaz gráfica de usuario (GUI) del escáner PET/CT (consulte Tabla de materiales) y crear un conjunto de nuevos protocolos (incluidos los parámetros para la adquisición de datos, el preprocesamiento y la reconstrucción de imágenes): i) a exploración PET dinámica, ii) a tomografía computarizada de baja dosis para la corrección de atenuación (CTAC) sin agente de contraste, y iii) a Cine-TC con contraste mejorado.
    NOTA: La creación de nuevos protocolos (es decir, instrucciones de software específicas para el tomógrafo) para las fases de adquisición, preprocesamiento y reconstrucción es un proceso sencillo; en caso de problemas, el usuario puede encontrar información más detallada en el manual del usuario de la GUI.
    1. Para la exploración PET, abra la ficha Protocolo del escáner (GUI) y cree tres nuevos protocolos (para adquisición, preprocesamiento y reconstrucción) con los siguientes parámetros:
      1. Para el protocolo de adquisición : ajuste el tiempo total de escaneo de 3.600 s y la posición de la cama individual. Guarde este protocolo con un nombre adecuado para su posterior importación en el flujo de trabajo. Haga lo mismo también para todos los siguientes protocolos en los siguientes puntos.
      2. Para el protocolo de preprocesamiento para ratón: seleccione una ventana de energía (EW) de 250-750 keV y habilite las siguientes correcciones: desintegración radiactiva, coincidencias aleatorias y tiempo muerto. Establezca el protocolo de encuadre (es decir, división dinámica de los datos sin procesar) de la siguiente manera: 8 x 5 s, 8 x 10 s, 3 x 40 s, 2 x 60 s, 2 x 120 s, 10 x 300 s (= 3.600 s). Para rata, seleccione una ventana de energía (EW) de 350-750 keV, utilizando el mismo encuadre que para el protocolo del ratón.
      3. Para el protocolo de reconstrucción: seleccione el algoritmo de maximización de expectativas de subconjuntos ordenados 3D (3D-OSEM-MC) basado en Monte Carlo de alta calidad, con 8 subconjuntos y 8 iteraciones, con normalización, corrección cuantitativa y corrección de atenuación CT habilitadas.
    2. Para la tomografía computarizada de dosis baja para la corrección de atenuación (CTAC), use los siguientes parámetros:
      1. Para el protocolo de adquisición : bastidor individual, posición de cama individual, escaneo completo; ajustes del tubo: 80 kV, baja corriente (dosis baja); 576 vistas a más de 360°, con 34 ms de tiempo de exposición por vista (tiempo de escaneo de 20 s); Tipo de rotación: Continuo, Modo de sensibilidad: Alta sensibilidad.
      2. Para el protocolo de preprocesamiento: tamaño de vóxel de 240 μm, FOV transversal: Rata, VFO axial: 100%.
      3. Para el protocolo de reconstrucción : ventana de filtro: suave, tamaño de vóxel: estándar , habilitar el endurecimiento del haz y la precorrección del anillo, deshabilitar la corrección posterior del artefacto del anillo.
    3. Para la tomografía computarizada cerrada con contraste mejorado, cree tres nuevos protocolos (para adquisición, preprocesamiento y reconstrucción) con la siguiente configuración:
      1. Para el protocolo de adquisición para ratón: ajuste de marco único, posición de cama individual, escaneo completo; ajustes de tubo: 65 kV, corriente completa (bajo ruido); 8.000 vistas a más de 360°, con 15 ms de tiempo de exposición por vista (tiempo de escaneo de 120 s); tipo de rotación: continuo, modo de sensibilidad: alta sensibilidad. Para rata, establezca los parámetros del protocolo de adquisición de la siguiente manera: voltaje del tubo de 80 kV, 16,000 vistas sobre 360 °, con un tiempo de exposición de 12 ms por vista (tiempo de escaneo de 192 s).
      2. Para el protocolo de preprocesamiento para ratón: seleccione un tamaño de vóxel de 120 μm; campo de visión transversal (FOV): ratón; VFO axial: 50%. Para rata, seleccione un tamaño de vóxel de 240 μm; campo de visión transversal (FOV): rata; VFO axial: 50%.
      3. Para el protocolo de reconstrucción : ventanas de filtro: liso, tamaño de vóxel: estándar; Habilite el endurecimiento del haz y la precorrección del anillo, deshabilite la corrección posterior del artefacto del anillo.
    4. Abra la pestaña Flujo de trabajo en la GUI y cree un nuevo flujo de trabajo , agregando los protocolos recién creados: pasos 1.1.1.1-1.1.1.3 para PET, pasos 1.1.2.1. -1.1.2.3. para CTAC, y pasos 1.1.3.1. -1.1.3.3. para CT cerrada, en el orden dado. En ambos casos, asegúrese de que los protocolos estén anidados con el siguiente orden: Adquisición | Preprocesamiento | Reconstrucción.
      NOTA: Los fotogramas PET dinámicos con duraciones <5 s para capturar mejor el pico de la función de entrada arterial al comienzo de la exploración PET son posibles, pero no se recomiendan, ya que esto puede conducir a imágenes ruidosas con una precisión cuantitativa reducida. En el paso 1.1.2.2, hemos utilizado el tamaño "Rata" para el VOV transversal. Esto se usa comúnmente tanto para ratas como para ratones en CTAC.

2. Preparación animal para imágenes PET/CT

NOTA: Para el presente protocolo, todos los animales fueron ayunados durante la noche.

  1. Anestesiar al ratón con isoflurano al 3% -4% (v / v) en una cámara de inducción inicialmente, y luego mantener con isoflurano al 1% -2% (v / v).
  2. Pesar el ratón y medir la glucemia basal para controlar la condición del animal. Para tomar la muestra de sangre requerida, use tijeras afiladas y haga un pequeño corte en la punta de la cola, luego masajee suavemente la cola para recolectar una gota de sangre (~ 1 μL) directamente en la tira reactiva.
  3. Proceder con la inserción de un acceso venoso a nivel de la vena caudal utilizando una mariposa 29 G para ratón y 24 G para rata.
    1. Para realizar la técnica de canulación se utiliza calentamiento simultáneo (normalmente, bajo una lámpara de calentamiento) y la desinfección del punto donde se inserta la aguja para la vasodilatación de la vena. Después de la canulación fije la mariposa con una cinta de seda a la cola para mantenerla en su lugar durante el procedimiento.
      NOTA: Se requiere ayuno para los estudios de [18F]FDG. Diferentes trazadores pueden implicar diferentes preparaciones animales, pero un debate exhaustivo sobre este tema queda fuera del alcance del presente protocolo. En lo que respecta a [18F]FDG, evitar el ayuno conduce a una biodistribución de trazadores muy diferente16.
  4. Encienda el sistema de anestesia (isoflurano 1%-2%, 0.8 L/minO2 para ratón y 1-1.2 L/min para rata) conectado al escáner PET-CT y transfiera el ratón a la cama.
  5. Coloque el ratón en posición supina, con la cabeza primero, en la cama del escáner del tomógrafo PET-CT, poniendo su nariz en la máscara nasal para la anestesia y bloqueando suavemente la cabeza del ratón a la máscara con cinta adhesiva.
  6. Fije las extremidades superiores e inferiores del ratón en la cama del escáner para evitar cualquier movimiento involuntario durante los procedimientos de imagen, lo que puede provocar artefactos de movimiento.
  7. Controle la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria utilizando una sonda rectal y una almohada de respiración, respectivamente.

3. Preparación de la dosis del trazador de PET

  1. Para ratones, extraer 10 MBq de [18F]FDG en un volumen de 100-150 μL con una jeringa de insulina (1 ml). Para ratas, extraiga una dosis más alta de 15 MBq en 0.20-0.25 ml.
    NOTA: Evite una mayor actividad ya que el escáner PET discutido en este protocolo tiene una sensibilidad muy alta y solo requiere una cantidad modesta de actividad para obtener imágenes de alta calidad.
  2. Si la concentración original del marcador en el vial es demasiado alta, utilice solución fisiológica (0,9% p/v NaCl) para diluir la dosis del marcador a una concentración de 50-100 MBq/ml.
  3. Utilice el calibrador de dosis de PET para medir la actividad real en la jeringa. Anote la actividad previa a la inyección y el tiempo de medición, ya que estos valores se utilizarán más adelante utilizando módulos de entrada específicos de la GUI del escáner PET.

4. Preparación del agente de contraste por TC

  1. Extraiga 0,2 ml por 20 g de peso de ratón de agente de contraste de emulsión lipídica yodada en una jeringa de 1 ml. Limite el volumen de inyección a 0,5 ml de CA para ratones más pesados. Si usa iomeprol, ajuste la velocidad de inyección para ratones a 10 ml / h (~ 0.17 ml / min) y limite el volumen de inyección a 0.5 ml.
    1. Para ratas, extraiga 2.3-3 ml de iomeprol, diluido a una concentración de 200 mg / ml, en una jeringa de 5 ml.
      NOTA: Si la emulsión lipídica de animales pequeños CA no está disponible, se puede usar iomeprol con inyección continua por medio de una bomba de jeringa, como se explica a continuación.
    2. Conecte la jeringa a la bomba de la jeringa y ajuste la bomba para el tamaño y diámetro reales de la jeringa.
    3. Conecte la jeringa al tubo de CA y la aguja, y rellene previamente el tubo con el CA.
    4. Ajuste la velocidad de inyección a 24 ml/h (= 0,4 ml/min), limitando la inyección a un volumen máximo de 2 ml.
      NOTA: El uso de CA de grupo sanguíneo basado en emulsión lipídica yodada también es posible en ratas, a pesar del costo relativamente alto de este procedimiento debido al mayor volumen de una sola inyección. Si se prefiere esta opción (por ejemplo, para simplificar el protocolo evitando la bomba de jeringa), se puede emplear el siguiente procedimiento:
  2. Extraiga 7,5 ml por kg de peso corporal de agente de contraste de emulsión lipídica yodada en una jeringa de 5 ml. Limite el volumen de inyección a 2 ml de AC también para ratas más pesadas.

5. Alineación del animal y operaciones preliminares antes de la obtención de imágenes

  1. Tras la inmovilización del animal en el lecho de imágenes, cree un nuevo estudio sobre la GUI del tomógrafo. Agregue un identificador de nombre de estudio en el módulo Nombre de estudio y seleccione el flujo de trabajo de imágenes guardado previamente en el menú desplegable.
  2. Seleccione la parte anatómica adecuada con información de animales/especímenes | Parte anatómica | Información sobre el posicionamiento cardíaco y animal por animal/espécimen | Posicionamiento | Supino/Cabeza primero. Anote el peso del animal en gramos para el módulo correspondiente: Información sobre animales/especímenes | Peso del animal.
    NOTA: El resto de la información de esta sección es opcional, pero es útil proporcionar la mayor cantidad posible de la información solicitada para encontrarla en la cabecera DICOM de las imágenes de reconstrucción, facilitando así la consulta posterior de datos.
  3. Seleccione el radionúclido en la información de la TEP | F18 para [18 estudios F]FDG y otros 18compuestos marcados con F; modificar si se utilizan otros trazadores (por ejemplo, [13N]NH3). Escriba también el nombre del trazador en la información de la TEP | Módulo de nombre de trazador como este nombre se informará en el encabezado DICOM al finalizar la reconstrucción de la imagen.
    NOTA: La información sobre el tiempo, la actividad y el volumen de inyección del trazador es obligatoria, pero podría proporcionarse más adelante durante la adquisición del PET.
  4. En la información de la tomografía computarizada, escriba toda la información disponible sobre el agente de contraste.
    NOTA: Toda esta información es opcional, pero podría facilitar la consulta posterior de datos si se proporciona.
  5. Presione Realizar escaneo y espere a que se abra otra pestaña de la GUI, lo que permite el posicionamiento del animal y la especificación de otras opciones de escaneo.
  6. Seleccione el tipo de calibración por TC en la calibración por TC | Utilice la calibración CT predeterminada.
  7. En la sección Preparación del estudio , seleccione cada protocolo de escaneo en el menú desplegable y marque la casilla de verificación Esperar la confirmación del usuario antes de este escaneo .
    NOTA: Este paso es muy importante, ya que pondrá el escáner en modo de espera esperando la entrada del usuario antes de comenzar la fase de adquisición correspondiente. Para la exploración PET, esto permitirá la sincronización de la inyección del trazador y el inicio real de la exploración PET; para la exploración CTAC, permitirá al usuario cerrar la tapa (blindaje) antes de la emisión de rayos X durante la tomografía computarizada (el estudio se abortará automáticamente si la tapa está abierta antes de que comience la tomografía computarizada); para la exploración Cine-CT, esta pausa permitirá al usuario iniciar el protocolo de infusión de CA y la exploración de datos de TC con el retraso requerido.
  8. Para el posicionamiento de animales, encienda el módulo de control del motor utilizando el interruptor en el panel izquierdo de la GUI.
    NOTA: Esto encenderá los láseres de centrado en la cama del animal y habilitará los botones de alineación manual de la cama colocados en el costado del escáner.
  9. Utilice los botones manuales de alineación de la cama para mover el pecho del animal sobre las marcas láser. Revise cuidadosamente la alineación longitudinal y vertical del animal.
  10. Una vez que el animal se coloca en la posición correcta de acuerdo con el láser de centrado, presione Apagar el láser para guardar la posición actual marcada con láser, que se moverá al centro de los escáneres PET y CT durante las fases de adquisición correspondientes. Después, apague el módulo de control del motor.

6. Escaneo PET

  1. Presione Iniciar adquisición para mover el animal al FOV del escáner PET. La cola y la cánula permanecerán fuera del campo de visión para permitir la inyección del marcador. El escáner permanecerá inactivo hasta que el usuario pulse el botón Continuar .
  2. Prepare la jeringa con la dosis calibrada del trazador de PET.
  3. Inicie la adquisición presionando el botón Continuar y comience a inyectar el trazador en la cánula dentro de los 5 s posteriores al inicio del escaneo (Figura 1).
    NOTA: La duración de la inyección será ~20-25 s.
  4. Coloque la jeringa en el calibrador de dosis de PET para medir la actividad residual en la jeringa. Anote la actividad real y el tiempo de medición.
  5. En la ficha Monitor de hardware de la GUI del escáner, utilice el botón Actualizar información del trazador de PET para insertar el tiempo, la actividad y el volumen reales de inyección.
  6. Durante la exploración, verifique los parámetros fisiológicos del animal periódicamente.
  7. Durante la exploración, mida la glucemia como se explica en el paso 2.2 en los siguientes puntos temporales: 5 min, 20 min, 40 min y 60 min después del comienzo de la TEP.
  8. Después de la medición de la glucemia, coloque la tira reactiva en el contador gamma y realice la medición de actividad durante 60 s. Registrar el momento real en que se ha llevado a cabo la medición de la actividad y corregir la desintegración radiactiva, tomando como referencia el tiempo de inyección del marcador. Convierta los valores de actividad registrados en concentración de actividad (Bq/ml) considerando un volumen sanguíneo promedio de 1 μL en la tira reactiva de glucosa (es decir, utilizando la ecuación [1]):
    C sangre(t) = Asangre(t)/0,001 ml [Bq/ml] (1)
    donde A sangre(t) es la actividad medida corregida de caries de la muestra desangre en la tira reactiva, expresada en Bq.
    NOTA: El mismo operador puede realizar el inicio de la exploración PET y la inyección del trazador utilizando el dispositivo de control móvil del tomógrafo colocado en la mesa lateral del escáner cerca del sitio del operador durante la inyección. Se permiten retrasos más largos entre el inicio de la exploración y el comienzo de la inyección, pero algunos fotogramas reconstruidos al comienzo de la secuencia dinámica permanecerán en blanco. Se recomienda evitar retrasos superiores a 10 s (es decir, que den lugar a dos marcos en blanco con el protocolo actual).

Figure 1
Figura 1: Inyección del marcador PET. Esta operación se realiza inmediatamente después del inicio de la exploración PET. El animal está dentro del campo de visión del PET (cabeza primero, con su cola visible en el lado del operador). Abreviatura: PET = tomografía por emisión de positrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Tomografías computarizadas

  1. Antes de inyectar el agente de contraste CT, inicie la exploración CTAC justo después de cerrar la tapa del escáner y presionar el botón Continue (Continuar) en la GUI. Al final de esta adquisición muy corta, emplee los siguientes procedimientos para garantizar la mejora adecuada de la reserva de sangre inyectando el CA antes de la adquisición utilizando el mismo acceso vascular empleado para la inyección del marcador PET.
    1. Emulsión lipídica yodada CA:
      1. Después de completar la exploración CTAC, inyecte la emulsión lipídica yodada CA utilizando la cánula ya conectada a la vena de la cola del ratón. La duración típica de la inyección es del orden de 30-60 s.
      2. Comience la toma de imágenes inmediatamente después de completar la inyección. Pulse Continue (Continuar) en la GUI del escáner para iniciar la adquisición de Cine-CT.
    2. Bomba de iomeprol/jeringa:
      1. Si se utiliza una CA de rayos X normal, como iomeprol, use una bomba de jeringa que permita una inyección lenta a una velocidad constante.
      2. Para ratones, establezca la velocidad de inyección del CA a 10 ml / h (~ 0.17 ml / min) limitando el volumen de inyección a 0.5 ml. Con este ajuste, detenga la inyección después de ~3 min. Para ratas, ajuste la bomba a una velocidad de 24 ml / h (= 0.4 ml / min) y limite el volumen de inyección a 2 ml. Con este ajuste, detenga la inyección después de 5 minutos.
      3. Conecte la aguja conectada al tubo de CA a la cánula de la vena de la cola, asegurándose de que tanto el tubo como la aguja estén precargados con CA.
      4. Inicie la inyección. Cierre la tapa del escáner y prepárese para la exploración Cine-CT.
      5. Presione el botón Continuar en la GUI del tomógrafo después de 60 s desde el comienzo de la inyección para ratones y después de 90 s desde el comienzo de la inyección para ratas, de modo que se inicie la adquisición de Cine-CT. La inyección de AC se detendrá aproximadamente al mismo tiempo que la finalización de la exploración Cine-CT para ratones y al finalizar para ratas.
  2. Al finalizar la exploración Cine-CT, desconecte al animal del sistema de monitoreo fisiológico y retire la cánula de la vena de la cola. Dependiendo del protocolo real, los animales son recuperados o sacrificados después del procedimiento de imagen descrito. En el primer caso, los animales se despiertan en sus jaulas en un ambiente cálido bajo una lámpara infrarroja. Se monitorean hasta el despertar completo, tomando 15/30 min después de la anestesia gaseosa. En el caso de protocolos que requieran, por ejemplo, la recolección de tejidos al final del procedimiento de imagen, los animales son sacrificados usando una sobredosis anestésica en una cámara de inducción (isoflurano al 5%), según el Anexo VI del D.Lgs. 26/2014.
    NOTA: En el caso de los radionucleidos basados en 18F, como se analiza en este protocolo, 24 h después de la inyección del trazador son suficientes para alcanzar un nivel de radiactividad residual en el cuerpo del animal que sea seguro para todos los fines prácticos.

8. Reconstrucción de las imágenes 4DCT cardíacas mediante gating cardiorrespiratorio intrínseco

NOTA: Al finalizar el estudio por imágenes, la reconstrucción estándar de PET y CT se realiza automáticamente. Sin embargo, la reconstrucción de la secuencia de TC cardio 4D (Cine) debe realizarse manualmente y requiere cierta interacción del usuario. Este tipo especial de reconstrucción, obligatorio para el posterior análisis de TC cardíaca morfofuncional, se discute en esta sección.

  1. Abra el módulo de activación cardíaca de la GUI del tomogragh y seleccione el estudio de imagen a analizar.
  2. Seleccione una región de interés (ROI) en las radiografías del animal mostrado (Figura 2) para construir una curva de movimiento cardíaco dependiente del tiempo, que represente la señal de acceso: el quimograma. Mueva verticalmente el ROI rectangular predibujado de tal manera que se seleccionen tanto el ápice cardíaco como el diafragma. A continuación, seleccione Análisis de señal de acceso. La interfaz de usuario ahora mostrará la señal de acceso tanto en el dominio del tiempo como en el dominio de la frecuencia.
  3. En el primer gráfico del dominio de frecuencia, seleccione la banda de frecuencia respiratoria resaltando el primer grupo de picos del espectro de frecuencias (consulte la figura 3 para ver un ejemplo de espectro).
  4. En el segundo gráfico de dominio de frecuencia, seleccione la banda de frecuencia de movimiento cardíaco, destacando el segundo pico más agudo.
  5. En la siguiente fase, observe la señal de activación en el dominio del tiempo con marcadores de color (puntos) superpuestos, mostrando los picos de respiración identificados y los picos de contracción cardíaca. Si las posiciones de los marcadores encajan bien con los picos respiratorios y cardíacos de la señal de activación original, pase a la siguiente fase. De otra manera:
    1. Si la forma de la señal de activación es demasiado diferente de la que se muestra en la Figura 3, vuelva al paso 8.2 y seleccione otro ROI.
    2. Si la forma de la señal de activación es razonablemente similar a la que se muestra en la Figura 3, vuelva a los pasos 8.3 y 8.4 y seleccione diferentes bandas de frecuencia en el espectro de la señal de compuerta.
  6. En la siguiente fase, seleccione un mínimo de cuatro puertas cardíacas.
    NOTA: La reconstrucción típica de Cine-TC consiste en 8-12 puertas cardíacas.
  7. Seleccione la ventana respiratoria adecuada utilizando el menú desplegable: Ventana respiratoria | 20%-80%.
    NOTA: Esto retendrá el 60% de los datos adquiridos en la reconstrucción, excluyendo la fase de inspiración máxima y, por lo tanto, mejorando la nitidez de las paredes miocárdicas reconstruidas en cada fase cardíaca.
  8. Realice la reconstrucción para convertir las imágenes Cine-CT cerradas retrospectivamente en formato DICOM, listas para ser importadas al software para su posterior análisis funcional.

Figure 2
Figura 2: Herramienta de selección de ROI para gating intrínseco. Esta imagen se muestra en la GUI del tomógrafo durante la fase de reconstrucción Cine-CT. El usuario debe seleccionar la posición del ROI (rectángulo amarillo) en el que se obtiene la señal de compuerta intrínseca (kymogram) de las proyecciones de TC sin procesar. El objeto de forma circular superpuesto al pecho del animal es la almohada respiratoria utilizada solo para el monitoreo fisiológico durante el estudio. Abreviaturas: ROI = región de interés; TC = tomografía computarizada; GUI = interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ejemplo de señal de acceso (fotograma superior) y espectro de frecuencia correspondiente (centro e inferior). Imágenes obtenidas con el módulo de compuerta cardíaca del software Atrium. El usuario debe seleccionar las bandas de frecuencia adecuadas para el movimiento respiratorio (marco central) y cardíaco (marco inferior). Esto permitirá la identificación de los marcadores respiratorios y cardíacos en la señal de acceso, que deben ser verificados por el usuario antes de proceder con la reconstrucción 4D. La mala identificación de los picos o la asignación incorrecta (por ejemplo, respiratoria a cardíaca, o viceversa) conducirá a una reconstrucción incorrecta. Los datos mostrados se obtuvieron del análisis de una exploración 4D Cine-CT de una rata Wistar macho adulta sana (507 g) inyectada con 2 ml de iomeprol, 200 mg / ml, a una velocidad de 0,4 ml / min durante 5 min (el gráfico en la parte superior se amplía en los primeros 22 s de adquisición para permitir una mejor visualización del movimiento cardíaco y respiratorio identificado). Abreviatura: CT = tomografía computarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Análisis cardíaco PET

NOTA: Esta sección muestra cómo realizar un análisis cinético de los datos dinámicos de [18F]FDG del ventrículo izquierdo de animales pequeños. El análisis se basa en el software Carimas. Las instrucciones a continuación no pretenden reemplazar el manual de usuario del software17. El procedimiento que se presenta a continuación se basa en el análisis gráfico Patlak de datos dinámicos de PET18. Consulte la sección Discusión para obtener detalles sobre este análisis.

  1. Abra las imágenes DICOM del escaneo PET dinámico.
  2. Seleccione el módulo HeartPlugin .
  3. Haga zoom en la imagen en el corazón del ratón / rata, y seleccione el último marco de tiempo (o equivalentemente, la suma de los últimos tres a cinco marcos de tiempo) para el cual la mayor parte de la actividad de la acumulación de sangre ya se ha eliminado.
  4. Siga las instrucciones en pantalla para reorientar la imagen a lo largo del eje principal del corazón del animal (eje corto, eje largo vertical y horizontal). Haga esto de forma interactiva moviendo los marcadores mostrados para la base y el ápice del corazón (Figura 4).
  5. Seleccione la herramienta Segmentación .
    NOTA: De forma predeterminada, la segmentación automática está habilitada, lo que produce resultados confiables en la mayoría de los casos.
  6. Si el resultado de la segmentación automática no es aceptable, refine la forma del miocardio segmentado y/o la cavidad del VI activando el modo manual (ROI Search Disabled).
  7. En la Herramienta de modelado , seleccione el modelo cinético adecuado que se utilizará para el análisis dinámico de PET. En este caso, seleccione Gráfico | Patlak para permitir el análisis de la gráfica de Patlak para el cálculo de la tasa metabólica de captación de glucosa (MRGlu) para cada sector cardíaco.
  8. En la herramienta polarmap , seleccione el número correcto de segmentos cardíacos mostrados. En este caso, seleccione 17 segmentos.
  9. Ahora, presione el botón Ajustar para realizar el procedimiento de ajuste del análisis Patlak.
  10. Al final del procedimiento de ajuste, observe el mapa polar mostrado de los valores Ki (es decir, la pendiente de la regresión lineal expresada en ml / [ml × min]).
  11. Usando los valores Ki para cada sector mostrado en una tabla, calcule el MRGlu usando la ecuación (2):
    MRGlu = (Ki × PGlu)/LC (2)
    donde PGlu es un valor derivado de la muestra de sangre de la concentración plasmática de glucosa (mmol/L), y la constante agrupada (LC) es un coeficiente empírico utilizado para compensar la diferencia de absorción entre la glucosa normal y la FDG. Véase, por ejemplo, Ng et al.22 para los valores típicos de la constante agrupada en diversas condiciones experimentales.
    NOTA: Antes de comenzar el análisis de PET, es una buena práctica inspeccionar visualmente la secuencia dinámica de volúmenes de PET dentro de la herramienta de software de análisis de PET. Esto es necesario para excluir el movimiento macroscópico de los animales entre marcos de tiempo durante el estudio. Si hay movimiento, se debe realizar un registro adecuado de la imagen (fuera del alcance de este protocolo) antes del análisis, si es posible.

Figure 4
Figura 4: Herramienta de reorientación del software de análisis PET. La proyección de dos segmentos de línea simples en el espacio 3D se muestra en cada uno de los tres planos estándar (transaxial, coronal y sagital). El primer segmento permite al usuario seleccionar la base del corazón y el ápice, mientras que el segundo permite seleccionar los lados izquierdo y derecho del corazón. Este paso da como resultado una nueva imagen PET (interpolada) (fila inferior), con el corazón reorientado a lo largo de la representación estándar de AHA. Las imágenes se obtuvieron con Carimas de un ratón CD-1 macho adulto sano que pesaba 51 g y se inyectó 10 MBq de [18F]FDG. Abreviaturas: PET = tomografía por emisión de positrones; AHA = Asociación Americana del Corazón; FDG = fluorodesoxiglucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

10. Análisis cardíaco Cine-CT

NOTA: Esta sección muestra cómo realizar un análisis cuantitativo de la imagen cardíaca Cine-CT para recopilar datos cuantitativos globales de la función cardíaca. El análisis se basa en el software Osirix MD. Las instrucciones a continuación no pretenden ser un reemplazo para el manual de usuario de Osirix24.

  1. Cargue las imágenes DICOM de la exploración Cine-CT en el software.
  2. Abra el conjunto de datos dinámico con el visor 4D integrado.
  3. Con la herramienta de Reforma Multiplanar 3D (MPR), reoriente los datos de imagen a lo largo del eje corto (Figura 5).
  4. Exporte los datos reorientados a DICOM, asegurando que se exporten todos los datos 4D, con un grosor de corte preservado (igual que el original) y una profundidad de bits de imagen (16 bits por vóxel)
  5. Abra las imágenes 4D MPR exportadas utilizando el visor 4D.
  6. Seleccione un marco de tiempo correspondiente a la diástole final. Navegue por todos los marcos de tiempo con el control deslizante de tiempo en la barra de herramientas principal para asegurarse de que se selecciona la fase cardíaca correcta.
  7. En este período de tiempo, elija la herramienta de anotación de polígonos cerrados y delinee manualmente la pared endocárdica del VI.
  8. Haga lo mismo para 10-20 cortes desde la base hasta el ápice, asegurándose de que todos los ROI tengan el mismo nombre (por ejemplo, LVENDO).
  9. En el menú ROI, seleccione ROI Volume | Genere ROI faltantes para generar los ROI en todos los segmentos de eje corto mediante interpolación de los ROI dibujados manualmente.
  10. En el menú ROI, seleccione ROI Volume | Calcular volumen para calcular el volumen del grupo de ROI con el mismo nombre de ROI.
  11. Navegue a través de los marcos de tiempo y seleccione una fase correspondiente a la sístole final (volumen de VI más pequeño) y repita los pasos 10.7-10.10 anteriores.
  12. Calcule el volumen sistólico (SV) y la fracción de eyección utilizando las ecuaciones (3) y (4):
    SV = EDV - ESV[mL] (3)
    FE = 100 × SV/EDV [%] (4)
    donde EDV es el volumen diastólico final y ESV es el volumen sistólico final.

Figure 5
Figura 5: Interfaz gráfica de la herramienta de reforma multiplanar. Esta herramienta se utiliza para la reorientación de los datos de Cine-CT para su posterior análisis funcional. El usuario girará y trasladará los ejes de referencia del lado izquierdo de la pantalla de tal manera que la vista de eje corto del corazón se muestre a la derecha. Al final de este procedimiento, el usuario puede exportar las imágenes reorientadas como un conjunto de archivos DICOM. Las imágenes se obtuvieron con Osirix MD y se refieren a una rata Wistar macho adulta sana (507 g) inyectada con 2 mL de iomeprol, 200 mg/mL, a una velocidad de 0,4 mL/min durante 5 min, reconstruida con Filtered BackProjection con un tamaño de vóxel de 0,24 mm3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

En esta sección, se muestran los resultados típicos para el análisis de PET y CT siguiendo los procedimientos descritos hasta ahora. La figura 6 muestra los resultados de la segmentación automática del miocardio y de la cavidad del VI de la TEP [18F]FDG de un ratón control (sano) CD-1. Aunque el ventrículo derecho no siempre es visible en las imágenes reconstruidas, los ejes de orientación basados en el encabezado DICOM pueden ser utilizados para discriminar correctamente el tabique interventricular de las otras paredes del VI, como se requiere para la identificación confiable de los sectores estándar siguiendo las recomendaciones de la American Heart Association (AHA)25 . En el caso de la isquemia miocárdica, una disminución regional de la captación del marcador aparece como un signo típico de pérdida de vitalidad miocárdica. Esto no se correlaciona necesariamente con la perfusión reducida, que necesitaría un trazador diferente (por ejemplo, [13N]NH3 o [15O]H2O) para ser visualizado en imágenes PET. Incluso en sujetos sanos, los valores reconstruidos más bajos alrededor del ápice se observan comúnmente en la PET (ver Figura 6). Esto podría surgir de un artefacto de volumen parcial más pronunciado debido a un grosor miocárdico (generalmente) más delgado en el ápice en comparación con, por ejemplo, la pared izquierda o el tabique.

Figure 6
Figura 6: Resultados de la segmentación automática del software de análisis PET. Las imágenes fueron obtenidas con el plugin Heart del software Carimas. La segmentación se realizó después de la reorientación estándar de acuerdo con las pautas de la AHA. Las imágenes mostradas se refieren a un ratón CD-1 macho adulto sano (igual que la Figura 4) que pesa 51 g e inyectado con 10 MBq de [18 F]FDG, sin activación cardíaca, y suma los últimos 15minutos de una exploración PET de 60 minutos. Las imágenes se reconstruyeron con un algoritmo 3D-OSEM iterativo con un tamaño de vóxel de 0,85 mm3. Abreviaturas: PET = tomografía por emisión de positrones; AHA = Asociación Americana del Corazón; FDG = fluorodesoxiglucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 7, se muestra un ejemplo de la Ki regional obtenida a través del análisis gráfico de Patlak18 (arriba a la izquierda). En el marco de la parte inferior, se muestra el diagrama de dispersión de Patlak y los resultados correspondientes del análisis de regresión lineal. Cada punto en el diagrama de dispersión representa la relación entre la concentración de actividad tisular y la concentración de actividad plasmática en un momento dado t (después de la corrección de la desintegración radiactiva), CT(t)/CP(t), trazada contra la integral de tiempo de la concentración de actividad plasmática desde el tiempo de inyección t0 = 0 hasta el tiempo t. La tabla del marco superior derecho de la figura 7 muestra los valores de la pendiente (Ki) y la intersección (Ic) del ajuste lineal realizado en cada segmento, junto con el coeficiente de determinación correspondiente (R2).

En lo que respecta a la PET cardíaca, los signos de mala ejecución del protocolo podrían incluir, entre otros, los siguientes: (i) captación baja o ausente del marcador del miocardio, que suele ser una señal de que se produjo un problema durante la inyección del marcador, como una inyección extravasada; ii) problemas similares a los del punto anterior si la temperatura del animal es demasiado baja durante la TEP (por ejemplo, por debajo de 35 °C) y, por lo tanto, se produce una absorción alterada del trazador; (iii) desenfoque evidente de la imagen, que podría deberse a un nivel de anestesia demasiado bajo o movimiento involuntario.

Figure 7
Figura 7: Resultados del análisis gráfico de Patlak. Las imágenes fueron obtenidas con el plugin Heart del software Carimas. Arriba a la izquierda: mapa polar paramétrico del Ki regional del VI resultante del análisis de Patlak. Arriba a la derecha: valores medios de Ki e IC en cada segmento miocárdico, junto con los coeficientes de determinación de cada ajuste lineal (R2). Abajo: diagrama de dispersión de y(t) versus x(t) (ver texto para más detalles) para el segmento miocárdico seleccionado (segmento 1 en este ejemplo). Este resultado se refiere a las imágenes de PET miocárdicas que se muestran en la Figura 4 y la Figura 6 (ratón CD-1 macho adulto sano que pesa 51 g e inyecta 10 MBq de [18F]FDG). Abreviaturas: PET = tomografía por emisión de positrones; FDG = fluorodesoxiglucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Ejemplo de segmentación manual del VI de una rata. La imagen se refiere al mismo animal que se muestra en la Figura 5 y se obtuvo con Osirix MD. El análisis volumétrico resultante del VI en la diástole final y la sístole final se muestra en la parte inferior. A partir de estos resultados, EF y SV se calculan de acuerdo con las ecuaciones 3 y 4. Abreviaturas: EF = fracción de eyección; SV = volumen sistólico; ROIs = regiones de interés; VI = ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Renderizado de volumen de las imágenes Cine-CT. Las imágenes se refieren a la misma rata que se muestra en la Figura 5 y la Figura 8 (rata Wistar macho adulta sana que pesa 507 g e inyectada con 2 ml de iomeprol, 200 mg / ml, a razón de 24 ml / h durante 5 min, reconstruida con FBP con un tamaño de vóxel de 0,24 mm3). Abreviaturas: RA = aurícula derecha; LA = aurícula izquierda; VI = ventrículo izquierdo; VD = ventrículo derecho; TC = tomografía computarizada; FBP = Retroproyección filtrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 8 y la Figura 9 tratan de los resultados representativos del análisis cardíaco Cine-CT para una rata sana. En particular, en la Figura 8, se muestran las diferentes formas y tamaños del VI para las fases diastólica final y sistólica final, junto con la reconstrucción 3D del volumen segmentado del VI en ambas fases. En este ejemplo, el cálculo de los volúmenes según las ecuaciones 3 y 4 resultó en EDV = 0,361 mL y ESV = 0,038 mL, correspondientes a un volumen sistólico de SV = 0,323 mL y una fracción de eyección EF = 89,4%. Esto está de acuerdo con los resultados reportados sobre protocolos similares en la literatura, mostrando FE normal de ratas en el rango de 70%-90%26. Los corazones infartados pueden conducir a una FE reducida, en el rango de 50% -70% o menos, dependiendo de la gravedad de la lesión y la extensión del miocardio acinético.

Los siguientes signos de mala ejecución del experimento podrían ocurrir para las imágenes de Cine-CT: (i) contraste de imagen reducido o ausente entre las cámaras/vasos cardíacos y el miocardio; En este caso, es probable que se haya producido un problema en la inyección del agente de contraste; (ii) contornos borrosos de las paredes del miocardio; en este caso, se ha producido un problema en la reconstrucción, probablemente debido a la identificación incorrecta de los picos cardíacos y respiratorios de la señal de activación intrínseca, que, a su vez, podría depender de una mala selección de las bandas de frecuencia (Figura 3) y / o una mala selección del ROI de la señal de activación (Figura 2); (iii) artefactos de movimiento evidentes, que podrían deberse a un nivel de anestesia demasiado bajo o movimiento involuntario.

En la Figura 9, se muestra una representación de volumen del mismo corazón de rata tanto para la diástole final como para la sístole final. Este tipo de visualización solo permite representar las cámaras y recipientes mejorados con yodo, por lo que su valor es más cualitativo que cuantitativo. Sin embargo, la motilidad reducida de las paredes miocárdicas, como la encontrada en ratas infartadas, producirá imágenes volumétricas con diferencias menos evidentes entre las fases diastólica final y sistólica final.

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Discussion

El protocolo presentado en este documento se centra en un procedimiento experimental típico para la investigación cardiovascular traslacional en modelos animales pequeños de lesión cardíaca mediante el uso de imágenes PET / CT de alta resolución. Los resultados presentados son indicativos del alto valor cuantitativo y cualitativo de las imágenes PET y Cine-CT, proporcionando información funcional y estructural de todo el corazón con respecto a su metabolismo de la glucosa, la forma y la dinámica de su contracción. Además, todas las imágenes obtenidas son 3D, resueltas en el tiempo y presentan un espaciado de píxeles isotrópicos; Esto es beneficioso desde el punto de vista del procesamiento de imágenes, ya que no requiere tareas dependientes del operador de exploración previa para seleccionar orientaciones específicas de corte a lo largo de los ejes estándar del corazón.

Este artículo incluye un protocolo basado en el análisis gráfico Patlak de datos dinámicos de PET18. Este tipo de análisis es útil para describir la captación irreversible del trazador del tejido, lo cual es una buena aproximación en el caso de [18F]FDG, donde el efecto de la desfosforilación o los metabolitos es generalmente insignificante en el miocardio19. Dentro de esta aproximación, la relación entre la concentración de actividad tisular corregida por caries CT(t) y la concentración de actividad plasmática corregida por caries CP(t) puede aproximarse mediante la siguiente ecuación (5):

Equation 1 (5)

que se mantiene para los tiempos t, después de un cierto tiempo de inicio, t*, que debe determinarse empíricamente. En la ecuación anterior, la constante Ki representa la tasa de entrada neta de sangre a tejido, mientras que IC es una constante que involucra la fracción de volumen sanguíneo y el volumen de distribución del marcador en el compartimiento reversible (es decir, el plasma). Una derivación matemática más detallada de esta fórmula se puede encontrar en otra parte20. Si las curvas de actividad temporal (TAC) tanto del plasma como del tejido están disponibles (por ejemplo, a partir de una exploración PET dinámica y/o muestreo de plasma), se puede crear un gráfico de dispersión 2D trazando Equation 2 y para cada tiempo de fotograma, t, de modo que Ki e IC puedan determinarse fácilmente como la pendiente y Equation 3 la intersección del diagrama de dispersión mediante regresión lineal simple, restringido a aquellos puntos de tiempo t > t* después de los cuales se observa la linealidad. Debe subrayarse que la anestesia prolongada puede impactar en la tasa metabólica del miocardio21. Por esta razón, es muy importante estandarizar el protocolo para que las variaciones entre sujetos de todos los parámetros fisiológicos relevantes se mantengan al mínimo. El procedimiento descrito en el protocolo, implementado en Carimas, permite el análisis gráfico regional de Patlak del miocardio; hemos utilizado la concentración de actividad de la sangre total en la cavidad del VI como una aproximación de la función de entrada plasmática CP(t).

Algunos escáneres PET pueden tener una resolución espacial y/o sensibilidad más baja, lo que lleva al uso de mayores ROI y errores parciales consistentes de volumen/derrame en las curvas de actividad temporal (TAC) de las mediciones, especialmente la plasmática utilizada como función de entrada (IF). En este caso, el protocolo de análisis se puede modificar creando un FI híbrido basado en los valores de imagen en la fase temprana después de la inyección y en la concentración de actividad de la muestra de sangre (ver paso 6.8 del protocolo) en la fase tardía (>20 min). Los puntos corregidos del FI híbrido pueden calcularse por interpolación, como muestran Shoghi et al.23. Dentro de Carimas, es posible exportar los TAC brutos de cada segmento miocárdico, corregir el TAC arterial y cargarlos nuevamente para realizar el análisis de Patlak directamente en las curvas corregidas. Debido a la complejidad de la operación requerida, no hemos proporcionado operaciones de protocolo específicas para hacer eso, ya que los resultados obtenidos en el caso descrito en este protocolo tienen un buen nivel de reproducibilidad para la mayoría de las aplicaciones.

Una posible aplicación del protocolo presentado es en modelos animales pequeños de infarto de miocardio. Para evitar restricciones a un campo tan específico de investigación por imágenes, no agregamos una instrucción de protocolo específica para la inducción de IM u otros tipos de enfermedades cardiovasculares. Los procedimientos quirúrgicos detallados se pueden encontrar en otras partes de la literatura12,13, y han sido aplicados con éxito en nuestro grupo con el objetivo de representar información complementaria tanto para los defectos regionales de perfusión como para la angiogénesis inducida por isquemia4. Sin embargo, el protocolo de imagen PET/CT presentado en este trabajo puede ser útil en una variedad de diseños de estudio cuando el metabolismo cardíaco, la función y / o la morfología son motivo de preocupación, incluyendo, pero no limitado a, enfermedades metabólicas27, respuesta a la terapia y / o a diferentes dietas 28, y lesiones inducidas por radiación29. Además, este tipo de investigación puede ser útil para validar nuevas sondas moleculares para el monitoreo de la remodelación cardíaca y la neovascularización en correlación con la función cardíaca global y regional y la morfología 4.

Aquí, hemos discutido una adquisición y análisis típico de imágenes PET centrado en la cuantificación de la captación regional de glucosa miocárdica por medio de [18F]FDG; Para la imagen de infarto de miocardio, por ejemplo, esto es útil y ampliamente adoptado para medir la viabilidad miocárdica26 como información complementaria sobre la perfusión, que en cambio requiere diferentes trazadores. Además, [18F]FDG es el trazador más ampliamente disponible en imágenes PET y, por lo tanto, decidimos adaptar este protocolo a este trazador para aumentar su aplicabilidad. Con modificaciones menores en el flujo de trabajo de análisis, se puede utilizar el mismo procedimiento para cuantificar, por ejemplo, el flujo sanguíneo miocárdico regional (FMB), empleando [13N]NH3 o [15O]H2Ocomo trazadores del flujo sanguíneo30.

En estos casos, el protocolo de adquisición de PET requiere cambios menores, considerando los diferentes tiempos de desintegración de radionúclidos de 13 N (T 1/2 = 9,97 min) y 15O (T 1/2 = 2,04 min) con respecto a 18 F (T1/2 = 109,8min). Además, se deben utilizar modelos cinéticos apropiados en lugar del presentado en este documento, que está comúnmente disponible en la mayoría de los programas de procesamiento cuantitativo de imágenes para el análisis de PET; Además de estos puntos, el procedimiento experimental presentado en este protocolo es en su mayoría adecuado para otros tipos de investigación experimental centrada en los corazones de animales pequeños. Aunque el protocolo fue diseñado específicamente para imágenes cardíacas de modelos de ratón, trabajar con ratas podría implicar algunas modificaciones al protocolo real, principalmente debido al mayor tamaño del animal (~ 10 veces más pesado). Sin embargo, se ha agregado información adicional al protocolo para indicar las modificaciones requeridas para las imágenes de ratas en aras de la simplicidad.

Una ventaja del protocolo presentado es que no requiere el uso de sondas de ECG en el animal, ya que el estudio PET se puede realizar de manera confiable sin gating, y el estudio de TC utiliza un gating retrospectivo intrínseco (sin sensores). El algoritmo en la base del software de compuerta intrínseca se basa en el trabajo de Dinkel et al.31. Este método muestra una concordancia muy alta con la compuerta cardíaca basada en ECG (extrínseca) e incluso puede ser potencialmente mejor en el caso de arritmias debidas a la disociación de eventos mecánicos y eléctricos31. Aunque la compuerta intrínseca podría implementarse en flujos de trabajo totalmente automatizados32, este protocolo se basa en un método interactivo implementado en el escáner IRIS CT, lo que brinda más flexibilidad en la elección de los parámetros. Como se discutió, se requieren adaptaciones menores de los procedimientos cuando se usan ratas en lugar de ratones, principalmente con respecto a las dosis inyectadas, la necesidad de exploraciones de corrección de atenuación (CTAC) cuando se usan animales más grandes, así como algunas diferencias entre los tipos de agentes de contraste de TC. Con respecto a este último punto, el uso de emulsiones lipídicas de aceite en agua ricas en yodo en ratas también se informa en las notas técnicas de los vendedores de AC de animales pequeños. Debido a los volúmenes de inyección relativamente grandes involucrados, el costo relativamente más alto y la disponibilidad menos generalizada de estos agentes de contraste especializados, también hemos presentado una modificación del protocolo basada en agentes de contraste vascular comúnmente disponibles, como iomeprol, que es ampliamente aplicable en entornos clínicos. Debido a la eliminación muy rápida de tales agentes vasculares estándar, se requiere una bomba de inyección motorizada que permita una inyección continua lenta en este caso.

Limitaciones del método
La aplicabilidad de los protocolos PET/CT presentados se basa en la disponibilidad de instrumentación que generalmente está menos extendida y es más costosa que otras técnicas (principalmente ecocardiografía estadounidense), aunque la información contextual sobre estructura, función y metabolismo no se puede lograr con ninguna otra técnica con la misma sensibilidad y flexibilidad en la elección de la sonda molecular. Sin embargo, la finalización exitosa de todo el flujo de trabajo de preparación / adquisición / análisis con esta metodología requiere una fuerte colaboración entre varias figuras profesionales, incluidos biólogos, médicos veterinarios, químicos, físicos y bioingenieros. Esto es aún más cierto cuando se utilizan trazadores PET no estándar, lo que implica esfuerzos tanto en la radiosíntesis como en el modelado matemático, así como en la adaptación del software de análisis para una cuantificación correcta y confiable33,34,35.

En la sección 9 del protocolo, hemos descrito un procedimiento de cuantificación muy simple mediante el uso de una función de entrada derivada de imágenes (IDIF), señalando que un enfoque mixto que utiliza IDIF y IF derivado de muestras de sangre para fotogramas tardíos puede dar mejores resultados. Debe tenerse en cuenta que el uso de la actividad medida a partir de sangre entera (venosa) tomada de la cola se considera una aproximación confiable en [18F]FDG, pero requiere correcciones adicionales para la actividad de los metabolitos en el caso de diferentes trazadores36,37. Uno de los puntos más críticos de todo el protocolo es la canulación intravenosa, que da acceso venoso para inyectar tanto el marcador radiactivo para la exploración PET como el agente de contraste yodado para la tomografía computarizada. La realización sin éxito de este paso crítico da como resultado imágenes inútiles, ya que la cantidad efectiva de trazador de PET circulante o CT CA podría ser inferior a la requerida. Personal experto con capacitación específica para la inyección de venas de la cola debe participar en este procedimiento para proporcionar resultados confiables.

Un inconveniente de la TC para la imagen cardíaca dinámica es su resolución temporal relativamente más baja en comparación con la US y la RM, a pesar de que la imagen cardíaca 3D con ultrasonido requiere el uso de una etapa de traducción motorizada para la sonda y el posterior registro de imágenes para obtener resultados correctos. La necesidad de inyectar volúmenes consistentes de CA para la correcta discriminación de sangre y miocardio en imágenes reconstruidas es una de las principales preocupaciones debido a la baja sensibilidad intrínseca de la metodología. En este protocolo, hemos limitado el volumen de inyección de AC para estudios de TC a 0,5 mL en ratones y 2 mL en ratas, utilizando infusión continua durante 3 min a 10 mL/h en ratones y durante 5 min a 24 mL/h en ratas. Hemos observado que estas tasas y volúmenes de inyecciones son bien tolerados por los animales. Las cantidades descritas aquí están en línea o son más pequeñas que los protocolos equivalentes encontrados en la literatura.

Nahrendorf et al. describieron un protocolo Cine-CT para la representación del infarto de miocardio murino, que implica una inyección en bolo basal (pre-exploración) de 0,2 ml de mezcla de sangre de emulsión lipídica de aceite en agua AC seguida de una inyección continua de iomeprol a 1 ml / h durante 1 h38. Badea et al. compararon un protocolo similar de Cine-TC cardíaco basado en una infusión de 1 h de Isovue 370 (iopamidol) con una inyección en bolo de 0,5 mL/25 g de peso corporal de Fenestra VC (emulsión lipídica de aceite en agua), encontrando mejores resultados en términos de contraste de imagen en el segundo caso39. El mismo fabricante del agente de contraste Fenestra VC informó un volumen recomendado de inyección de 0,4 ml / 20 g de peso corporal para imágenes vasculares con micro-CT40. Sin embargo, las nuevas CA con mayor densidad, como eXIA 160 XL, MVivo Au, Aurovist 15 nm o Exitron nano 12000, han ingresado recientemente al mercado preclínico y tienen el potencial de reducir los volúmenes de inyección en los protocolos de micro-TC cardíaca. Nebuloni et al. realizaron una extensa caracterización de tales ACs41. La dosis de radiación en la TC cerrada es otra preocupación común para los estudios longitudinales; en este caso, la dosis máxima para el protocolo Cine-CT descrito es inferior a 200 mGy tanto para ratones como para ratas, según lo estimado sobre la base de la caracterización dosimétrica previa de nuestro escáner CT42. Esto es aproximadamente 5 veces más bajo que la dosis reportada en la literatura para tomografías computarizadas cardíacas 4D38,39 y 30 veces más baja que la dosis letal promedio para la irradiación corporal total de animales pequeños, estimada en 6 Gy43.

Aplicabilidad del protocolo a diferentes instrumentación y software
Aunque las instrucciones específicas presentadas en este protocolo se adaptan inevitablemente para un tomógrafo PET/CT específico, las tareas de imagen presentadas aquí se pueden adaptar a diferentes sistemas de imágenes. En cuanto a la sección PET de este protocolo, todos los sistemas PET o PET/CT de última generación diseñados para la investigación con animales pequeños tienen requisitos de rendimiento (en términos de resolución espacial y temporal) adecuados para llevar a cabo el protocolo. En lo que respecta a la TC cardíaca, el protocolo puede cambiar dependiendo del sistema de activación cardiorrespiratorio específico empleado (por ejemplo, extrínseco o intrínseco). Los lectores pueden consultar artículos de revisión recientes y capítulos de libros para una discusión exhaustiva de las capacidades actuales de los sistemas PET, CT o PET / CT44,45,46. Cabe destacar que los protocolos CT y PET presentados en este trabajo se pueden realizar de forma independiente, en función de las capacidades y peculiaridades de la instrumentación tomográfica en uso. Por lo tanto, creemos que los procedimientos presentados pueden proporcionar una referencia útil para cualquier profesional interesado en realizar por primera vez, un estudio cardíaco de PET / CT en animales pequeños.

Cualquier usuario con suficientes habilidades en la configuración del protocolo general de su propio tomógrafo PET / CT debe ser capaz de implementar las adaptaciones requeridas en el método presentado para obtener resultados equivalentes en su laboratorio. Los mismos argumentos se pueden utilizar para la sección dedicada al análisis de imágenes. Una lista completa de todos los paquetes de software disponibles para la TEP cardíaca y el análisis de TC cardíaca está fuera del propósito de este documento. Sin embargo, muchos otros paquetes de software comparables utilizan una metodología similar para la generación de mapas polares y el análisis cinético de trazadores regionales. El lector puede consultar Wang et al.47 y referencias dentro de la tarea de cuantificación de PET y los artículos de investigación pertinentes 48,49,50 para la cuantificación de TC 4D. En este caso, hemos decidido centrar este protocolo en Carimas 51,52,53,54 y OsiriX55,56,57,58 para el análisis cuantitativo de imágenes de PET y TC cardíacas, respectivamente. Debido al uso generalizado de estas herramientas, creemos que esta elección podría ser útil para aumentar el interés de la comunidad de investigación en la implementación y aplicación de los métodos presentados, en comparación con una discusión centrada en herramientas de análisis cerradas, comerciales y específicas del escáner proporcionadas por algunos fabricantes de escáneres PET y CT.

Modificaciones al protocolo de análisis cuantitativo de imágenes
Los resultados de ejemplo que se muestran aquí son solo un resultado simple de una tarea de análisis cuantitativo directa, que podría considerarse suficiente para la mayoría de los propósitos prácticos en experimentos de investigación cardiovascular traslacional centrados en modelos animales pequeños de lesión cardíaca. Sin embargo, son posibles muchas más opciones de análisis, a partir de las imágenes DICOM resultantes del protocolo de adquisición/reconstrucción descrito en este documento. Por ejemplo, uno podría estar interesado en aplicar diferentes modelos compartimentales en lugar del análisis gráfico de Patlak a partir de datos dinámicos [18F]FDG-PET 59,60,61. Además, el análisis de la función cardíaca basado en imágenes 4D Cine-CT mostradas en este protocolo fue solo global para todo el VI, pero varios programas diferentes (principalmente comerciales) permiten a los usuarios realizar análisis de deformación y movimiento de la pared regional, engrosamiento de la pared y análisis de FE regional a partir de las mismas imágenes49. Sin embargo, creemos que los ejemplos que se muestran aquí representan un buen punto de partida para tareas cuantitativas y de posprocesamiento más profundas.

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Disclosures

Daniele Panetta recibió subvenciones para la investigación y el desarrollo de instrumentación micro-CT de Inviscan Sas.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada en parte por el proyecto JPI-HDHL-INTIMIC "GUTMOM": Obesidad materna y disfunción cognitiva en la descendencia: papel causa-efecto del GUT MicrobiOMe y prevención dietética temprana (proyecto no. INTIMIC-085, Ministerio de Educación de Italia, Universidad y Decreto de Investigación no. 946/2019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sterile saline Fresenius Kabi 0.9% sodium chloride for injection
1025L Physiological Monitoring Small Animal Instruments Physiological monitoring system for small animal imaging
5 mL syringes Artsana Syringes with needle for injection of PET tracer
Atomlab 500 Else Nuclear PET Dose calibrator
Atrium software Inviscan Version 1.5.5 PET/CT operating software
Butterfly catheters Delta Med 27.5 G needle
Carimas software Turku PET Center Version 2.10 Image analysis software
Fenestra VC Medilumine Lipid emulsion iodinated contrast agent for small animals
Heat lamp Heat lamp with clamp and switch
Insulin syringes Artsana Syringes with needle for injection of CT CA
Iomeron 400 mgI/mL Bracco Iomeprol, vascular contrast agent
IRIS PET/CT Inviscan PET/CT scanner for small animals
Isoflurane Zoetis Inhalation anesthetic, 250 mL
OneTouch Glucometer Johnson&Johnson Medical Glucose meter kit
Osirix MD software Pixmeo Version 11 Image analysis software
Oxygen Air liquide Compressed gas
Rectal probe for 1025L Small Animal Instruments Rectal probe with cable for SAII 1025L systems
Respiratory sensor for 1025L Small Animal Instruments Respiratory pillow with tubings for SAII 1025L systems
TJ-3A syringe pump Longer Motorized syringe pump for CT CA injection

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References

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Medicina Número 190
Tomografía por emisión de positrones cardíacos de alta resolución/tomografía computarizada para animales pequeños
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Panetta, D., Guzzardi, M. A., La… More

Panetta, D., Guzzardi, M. A., La Rosa, F., Granziera, F., Terlizzi, D., Kusmic, C., Iozzo, P. High-Resolution Cardiac Positron Emission Tomography/Computed Tomography for Small Animals. J. Vis. Exp. (190), e64066, doi:10.3791/64066 (2022).

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