Summary
该协议描述了通过在定制的灌注生物反应器中通过皮瓣脉管系统灌注十二烷基硫酸钠洗涤剂来手术获取和随后的血管化猪皮瓣的脱细胞。
Abstract
大量软组织缺损会导致功能缺陷，并会极大地影响患者的生活质量。虽然手术重建可以使用自体游离皮瓣移植或血管化复合同种异体移植（VCA）进行，但这种方法也有缺点。供体部位发病率和组织可用性等问题限制了自体游离皮瓣移植，而免疫抑制是 VCA 的重要限制。使用去细胞化/再细胞化方法的重建手术中的工程组织代表了一种可能的解决方案。使用去除天然细胞物质同时保留底层细胞外基质（ECM）微结构的方法生成去细胞化组织。然后，这些无细胞支架随后可以用受体特异性细胞重新细胞化。
该协议详细介绍了用于在猪模型中实现无细胞支架的获取和脱细胞方法。此外，它还提供了灌注生物反应器设计和设置的描述。皮瓣包括猪网膜、阔筋膜张肌和桡骨前臂。通过低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤剂的 离体 灌注进行脱细胞，然后在定制的灌注生物反应器中进行DNase酶处理和过氧乙酸灭菌。
成功的组织脱细胞的特征是肉眼下皮瓣呈白色不透明外观。无细胞瓣显示组织学染色时没有细胞核，DNA 含量显着降低。该协议可以有效地用于生成具有保留ECM和血管微结构的脱细胞软组织支架。这种支架可用于随后的细胞再生研究，并具有在重建手术中的临床转化潜力。
Introduction
创伤性损伤和肿瘤切除可导致大而复杂的软组织缺损。这些缺陷会损害患者的生活质量，导致功能丧失，并导致永久性残疾。虽然自体组织皮瓣移植等技术已被普遍采用，但皮瓣可用性和供体部位发病率问题是主要限制1，2，3。血管化复合同种异体移植（VCA）是一种有前途的替代方案，可将复合组织（例如肌肉，皮肤，脉管系统）作为一个单元转移给受体。然而，VCA需要长期免疫抑制，这会导致药物毒性、机会性感染和恶性肿瘤4，5，6。
组织工程无细胞支架是这些限制的潜在解决方案7。无细胞组织支架可以使用去细胞化方法获得，该方法从天然组织中去除细胞物质，同时保留底层细胞外基质（ECM）微结构。与在组织工程中使用合成材料相比，使用生物衍生支架提供了一种仿生ECM底物，可实现生物相容性和临床翻译的潜力8。脱细胞后，随后用受体特异性细胞对支架进行再细胞化，然后可以产生几乎没有免疫原性的功能性血管化组织9，10，11。通过开发使用灌注脱细胞技术获得无细胞组织的有效方案，可以设计多种组织类型。反过来，基于该技术允许应用于更复杂的组织。迄今为止，已经使用简单的血管化组织（例如啮齿动物 12、猪 13 和人类模型14 的全层筋膜皮瓣）以及猪腹直肌骨骼肌15 研究了血管化软组织的灌注脱细胞化。此外，复杂的血管化组织也已灌注脱细胞，如猪和人耳16，17模型和人全脸移植模型18所示。
在这里，该协议描述了使用生物衍生的ECM支架的血管化游离瓣的去细胞化。我们介绍了三个临床相关皮瓣的去细胞化：1）网膜，2）阔筋膜张量和3）桡骨前臂，所有这些都代表了重建手术中常规使用的主力皮瓣，并且以前从未在组织脱细胞背景下的动物研究中进行过检查。这些生物工程皮瓣提供了一个多功能且易于获得的平台，具有临床应用的潜力，可用于大型软组织缺损修复和重建领域。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有涉及动物受试者的程序均已获得大学健康网络机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照大学健康网络动物资源中心的协议和程序以及加拿大动物护理指南委员会执行。所有实验均使用五头约克郡猪（35-50公斤;约12周龄）。
1. 灌注生物反应器制造
- 有关灌注生物反应器中使用的所有组件，请参见 图1 。对于组织室的制造，请使用市售的聚丙烯卡扣式容器，该容器带有带有硅胶密封衬里的防水和气密盖。确保容器与高压灭菌器兼容。
- 沿着容器侧面钻两个 1/4 孔，并穿一小段 L/S-16 铂涂层硅胶管。一个管子将携带流入的灌注液，另一个用于流出。
- 对于流入管，在内部连接一个公鲁尔连接器，用于连接组织套管。在流入管的外端安装一个母鲁尔连接器，用于连接三通旋塞阀。
- 在腔室盖上钻一个 1/4 英寸的孔，然后穿上另一小段 L/S-16 铂涂层硅胶管。该管道将用作通风口。
- 通过测量大约 50 cm 的 L/S-16 铂涂层硅胶管来制作流入和流出管。将一端连接到黄色三截止泵管，另一端连接到无菌 2 mL 血清移液管，以将灌注液从洗涤剂储液槽输送到生物反应器室中。
- 将所有组件（腔室和管道）高压灭菌在单独包装的无菌包装中。
图1：灌注生物反应器的制造。 灌注生物反应器由（A）塑料聚丙烯组织室（B）组成，侧孔钻孔以容纳带有气密和水密盖的灌注管。（C）旋塞阀连接到管子上，以允许连接灌注管，该灌注管以单程方式将脱细胞剂从洗涤剂储液槽中输送到废物中。（D） 兼容的泵盒用于将三停止管连接到蠕动泵。 请点击此处查看此图的大图。
2. 脱细胞溶液的制备
- 通过在 100 mL 生理盐水中稀释 1.5 mL 的 1000 I.U./mL 肝素储备溶液来制备肝素化生理盐水溶液 （15 IU/mL）。
- 通过将 9 g SDS 粉末缓慢加入 18 L 高压灭菌的蒸馏去离子水中制备 0.05% w/v 十二烷基硫酸钠 （SDS） 溶液。使用大容量聚丙烯 （PP） 大瓶来容纳 SDS 溶液。溶液完全溶解后即可使用。在室温下储存。
- 制备脱氧核糖核酸酶I工作溶液。首先，在无菌dH2O中用5mM CaCl2将冻干的DNase I复溶至10mg / mL的储备浓度。在使用当天，将 DNase I 库存与 Mg++（1.29 mM） 和 Ca++（1.98 mM） 在无菌 dH 2O 中以 1：100 稀释至终浓度 0.1 mg/mL。
注意：除非冷冻储存，否则脱氧核糖核酸酶活性会降低。只有新鲜工作的DNA酶溶液才应用于在室温下对DNA进行酶消化。 - 制备 1x PBS 溶液，将 10x PBS 储备液与无菌高压灭菌水以 1：10 稀释，最终体积为 5 L PP 大瓶。在室温下储存。
- 在PBS中制备1%的抗生素/抗真菌剂（A / A）。用无菌1x PBS溶液以1：100稀释100x抗生素/抗真菌剂至最终体积为1L.在室温下储存。
- 通过加入 3.13 mL PAA + 40 mL 100% 乙醇 + 956 mL 无菌 dH2O 制备 0.1% （v/v） 过氧乙酸 （PAA）/4% （v/v） 乙醇 （EtOH）。
3. 猪瓣采购
注意：这是一个终端过程。一头猪被用来采购所有三个皮瓣。在采购所有皮瓣后对动物实施人道安乐死。
- 术前护理
- 手术前至少12小时快速猪。用氯胺酮（20mg / kg肌内注射，IM），阿托品（0.04mg / kg IM）和咪达唑仑（0.3mg / kg IM）镇静动物。
- 通过面罩以 22-44 mL/kg/min 的流速吸入 5% 异氟醚诱导麻醉，用于外周管插入和插管。用0.5%-2%异氟醚以22-44mL/kg/min维持麻醉。通过检查血流动力学稳定性来确保足够的麻醉深度，并注意无眼睑/足部撤回反射或下颌肌张力，以表示给予的麻醉剂水平适当。在镇痛手术期间静脉给予瑞芬太尼（10-20μg/kg/h）连续速率输注。
- 用适当的气管插管（7-8 mm）插管猪，并将管子连接到通气量为8 mL / kg，PEEP为5 cm H20，FiO2 为0.5和呼吸频率为14的呼吸机上。
- 将 22 G 血管导管插入耳静脉。一旦获得静脉 （IV） 通路，在整个手术过程中以 5-10 mL/kg/h 的速度输注温热的 0.9% 生理盐水，以将平均动脉压维持在 60 mmHg 和 90 mmHg 之间。
- 持续监测心率、脉搏血氧饱和度和潮气末 CO2。每5分钟评估一次血压和体温。
- 在麻醉下涂抹眼膏以防止眼部干燥。用聚维酮碘准备整个手术区域。用无菌毛巾覆盖手术区域。
- 网膜瓣
- 将猪置于仰卧位并进行木脐剖腹手术。
- 进入腹部后，活动胃头以观察大网膜。小心地将网膜放入手术区域，并确定沿着胃较大曲率运行的胃表皮血管（图2A）。
- 从大曲率的左侧开始，左胃-表观动脉与脾动脉相连。使用直史蒂文斯肌腱切开剪刀，骨骼化左胃表皮动脉和静脉。然后结扎，然后使用手术扎带或夹子将两者分开。
- 沿着胃的较大曲率从左到右继续。结扎并分裂由网膜产生的短血管分支，提供更大的胃曲率。在此步骤中注意不要损伤网膜的主要胃表皮蒂。
- 继续动员大网膜，直到遇到右胃 - 表皮血管和胃十二指肠动脉的交界处。用夹子或系带结扎，然后分别分开右胃表皮动脉和静脉以释放网膜瓣。
- 一旦释放，网膜可以沿着中间分成两半，每半伴随着各自的胃表皮动脉和静脉。这允许从一个动物操作中获得两个无网膜瓣。用 20-22 G 套管单独插管胃表皮血管，然后用 3-0 丝带固定。
- 将肝素化盐水 （15 I.U./mL） 冲洗至胃表皮动脉插管中，直到观察到清晰的静脉流出。
- 张筋膜阔瓣
注意：该协议基于Haughey等人先前对猪张量筋膜瓣的描述19。进行修改以仅隔离张量筋膜张肌皮瓣的筋膜部分。- 将猪置于侧卧位，双侧剃掉整个上后肢。使用通常的无菌程序准备和悬垂。
- 用一条从髂前上棘 （ASIS） 向髌骨外侧延伸的线标记皮瓣的前边界。椎弓根的位置沿这条线距离ASIS约6-8厘米。
- 沿股骨轴线从前切口开始约 8 cm 至 10 cm 处标记一条平行的后线，以包括股骨瓣的宽度。在髌骨外侧标记皮瓣的远端边缘。
- 使用手术刀在髌骨远端边缘开始解剖，并用尖锐的皮肤切口。通过皮下组织加深用烧灼的皮肤切口，直到遇到覆盖股直肌的筋膜。
- 沿着上述标记的前边界和后边界继续向ASIS切开皮肤切口。要单独隔离筋膜瓣，请从下面的筋膜层中去除覆盖的皮肤成分。将任何小的穿支血管结扎或烧灼到皮肤上。
- 回到皮瓣远端缘，切开深筋膜，以便活动下面的股外侧肌。将筋膜向 ASIS 移动。
- 在活动过程中，识别从股外侧肌和股直肌之间出现的血管蒂（图2B）。注意避免过度牵引，以免伤害椎弓根血管。
- 解剖ASIS的近端，同时保护血管蒂。解剖直至皮瓣在其蒂上充分活动。
- 将椎弓根追踪至股骨深部血管。骨骼化股骨外侧回旋动脉和供应筋膜瓣的静脉。然后结扎将两根血管在它们连接深股血管的近端分开。
- 用 20 G 至 24 G 血管导管单独插管椎弓根血管，用 3-0 丝带固定。将肝素化盐水 （15 I.U./mL） 冲洗至皮瓣动脉插管中，直到观察到清晰的静脉流出。
- 桡骨前臂皮瓣
注意：以下协议基于Khachatryan等人发表的猪径向前臂皮瓣模型的描述20。- 将猪放在手术台上的侧卧位。将依赖前肢定位在手术区域内。
- 在桡骨前臂上标记一个大约 3 cm x 3 cm 的皮瓣方块。在近端皮瓣边缘的中点和肘前窝之间画一条线，以表示桡动脉蒂的大致病程。通过触诊确认动脉病程。
注意：在猪模型中，径向血管的位置比人类相对较深。它们的位置位于桡侧腕屈肌和桡臂之间。 - 使用手术刀在远端切开皮肤，深度可达臂前筋膜。用肌腱切开剪刀进行钝性解剖，直到遇到桡动脉远端及其两个静脉导管。用手术带单独结扎动脉和静脉并分开。
- 继续在标记的皮肤方块的桡骨和尺骨边缘进行皮肤切口。用手术刀片从桡骨方向向尺骨方向移动皮瓣，同时将皮瓣向肘前窝近端抬起。
注意：保持筋膜下夹层平面，以确保桡动脉蒂与上覆的皮肤层保持相关。 - 在近端边缘，用自留牵开器缩回臂臂和桡腕屈肌之间的空间，以暴露近端桡动脉及其静脉连接（图 2C）。
- 使用肌腱切开剪刀，将桡动脉和静脉在肘前窝近端进行骨骼化，它们分别连接肱动脉和静脉。从周围的纤维脂肪组织中解剖血管，以达到约5-6厘米的足够蒂长。分别结扎和分割动脉和静脉，以释放桡骨前臂皮瓣。
- 用 20 G 至 24 G 血管导管将椎弓根血管插管，用 3-0 丝带固定。将肝素化盐水 （15 IU/mL） 冲洗至皮瓣动脉插管中，直到观察到清晰的静脉流出。
- 皮瓣采购后，将皮瓣保持在4°C的冷盐水中，直到准备好脱细胞。在深度异氟醚麻醉下，用静脉注射氯化钾（100mg / kg IV）对动物实施安乐死。通过无生命体征确认死亡。
图2：三个猪血管化皮瓣的采购 。 （A） 网膜。右侧 （i） 和左侧 （ii） 胃表皮动脉在网膜瓣 （iii） 中插管。（B）阔筋膜张量。皮瓣 （iv） 是股骨外侧回旋动脉 （v） 的升支。（C）桡向前臂皮瓣。桡骨前臂皮瓣（vi）的获取基于桡动脉和静脉（vii）作为血管椎弓根（注意：为了演示目的，省略了窗帘）。比例尺：3厘米。 请点击此处查看此图的大图。
4. 建立脱细胞系统
- 在无菌条件下将组织室与瓣膜组装在层流生物安全柜中。
- 将三通旋塞阀连接到生物反应器的流入和流出端口。将0.2μm过滤器连接到组织室盖上的排气口。用无菌肝素化盐水灌注流入管以消除气泡。
- 将襟翼放入腔室中。使用无菌止血器，使用公鲁尔连接器将翻盖连接到流入管。将每个皮瓣的相应动脉套管拧到公鲁尔上，并确保密封牢固。
- 通过旋塞阀冲洗肝素化盐水，以检查 Luer 连接处是否无泄漏，以及皮瓣是否可以注入静脉流出的证据。关闭组织室盖。
- 使用黄色三截止泵管将流入管连接到组织室的流入旋塞阀。此外，将在线压力传感器传感器连接到流入的三通旋塞阀上，以便进行灌注压力监测。
- 打开流入蠕动泵。在初始屏幕上，使用箭头键进入第三个选项卡，将管材 ID 设置为 1.85 mm。接下来，进入第二个选项卡以设置灌注速率。输入速率作为输送方式，并设置为 2 mL/min。确保屏幕上显示的流动方向正确。使用兼容的盒式磁带将三截止泵管装入蠕动泵。
- 对流出蠕动泵重复与上述类似的过程。将流出泵设置设置为4 mL/min。用黄色三止泵管将流出管连接到组织室的流出旋塞阀。使用兼容的盒式磁带将三截止泵管装入蠕动泵。通过按下 电源 按钮启动两个泵的流量。
注意：较高的流出泵速率是防止组织室溢出的关键安全措施，确保腔室流出在脱细胞过程中始终超过流入量。整个组装的去细胞化装置如图 3所示。
图3：组装的灌注脱细胞系统 。 （A）灌注脱细胞系统示意图。流入管通过压力传感器监控，以单程方式将灌注液从洗涤剂储液罐输送到组织室中。流出管将灌注液从组织室主动去除到废物容器中。黑色箭头表示灌注流的方向。蠕动泵与左侧泵一起使用以控制流入。使用第二个蠕动泵通过相应的管道主动排出流出。用 BioRender.com 创建的图。（B）在台面上组装的灌注脱细胞系统的照片，流入蠕动泵（i）连接到组织室（ii），然后流出蠕动泵（iii）。在进入组织室之前，使用在线压力传感器（iv）监测流入灌注液压力。在这里，三个瓣平行脱细胞。洗涤剂和废物储液罐都在台面下方，没有拍照。 请点击此处查看此图的大图。
5. 猪瓣脱细胞
- 在室温下进行灌注脱细胞化的所有以下步骤。有关灌注速率和持续时间的摘要，请参见 表1。使用蠕动泵以 2 mL/min 的速度开始肝素化盐水灌注，并在组织室中用肝素化盐水灌注皮瓣 15 分钟以去除任何残留的血栓。
- 肝素化盐水灌注完成后，在组织室中吸出残留的盐水。用大约 500 mL 的 SDS 脱细胞溶液填充组织室，以充分浸没皮瓣。
- 将流入管转移到 SDS 脱细胞溶液中，并以 2 mL/min 的速度灌注组织。灌注的持续时间因皮瓣而异;网膜灌注 SDS 2 天，张筋膜张肌 3 天，桡骨前臂筋膜-皮肤皮瓣灌注 5 天。
- SDS脱细胞完成后，吸出组织腔内现有的SDS灌注物。将流入管转移到 1x PBS 溶液中，并以 2 mL/min 的速度灌注瓣 1 天。
- 取出先前的PBS溶液，并将流入管转移到DNase工作溶液中。以 2 mL/min 的速度灌注 2 小时。从组织室中取出 DNase 溶液，并将流入管放入 1x PBS 溶液中。将组织浸入 1x PBS 溶液中，并以 2 mL/min 的速度灌注 1x PBS 溶液 1 天。
- 用PAA/EtOH溶液对皮瓣进行消毒。将流入管转移到dH2O溶液中的PAA / EtOH中，并将组织浸没在同一溶液中。以 2 mL/min 的速度灌注 PAA/EtOH 3 小时。PAA/EtOH 灭菌完成后，断开管道与三通旋塞阀的连接。
- 使用无菌技术取下皮瓣，并将无菌器械放入含有 1% 抗生素/抗真菌剂 （A/A） 的 PBS 中。在两次单独的洗涤中用PBS + 1% A A / A浸泡瓣15分钟，以完全中和残留的酸。将皮瓣保持在PBS + 1%A / A中，温度为4°C，直到准备好进行细胞再生。
- 通过在琼脂平板上进行拭子培养来验证支架的无菌性，并检查微生物生长。用取自每个皮瓣表面的拭子接种琼脂平板。琼脂平板在37°C下培养长达2周。无菌表现为没有微生物菌落生长。
表1：灌注-脱细胞方案参数摘要。请按此下载此表格。
6. 去细胞化的评估
- 使用穿刺活检，从皮瓣中获取厚度为 3 mm 至 10 mm 的样本。
- 对于组织学，在室温下将组织学盒中的活检固定在正常缓冲福尔马林中24小时。
- 用水或PBS洗涤活检盒15分钟，然后将它们放入70%乙醇中，直到准备好进行组织处理。根据标准方案在组织处理器中处理盒式磁带。
- 将活检嵌入石蜡中，使蜡在冷板上凝固10-15分钟。切片机上的石蜡块厚度为5μm。根据标准方案用苏木精和伊红（H&E）对载玻片进行染色。用光学显微镜对组织载玻片进行成像。
- 对于DNA含量定量，在60°C的烤箱中过夜组织干燥后获得组织活检的干重。 将样品在65°C的木瓜蛋白酶提取缓冲液中消化过夜。以10，000× g 离心消化的样品，并将上清液转移到新鲜的微量离心管中。按照制造商的说明，使用商业DNA提取试剂盒测定DNA含量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这种使血管化猪瓣脱细胞的方案依赖于离子基洗涤剂SDS通过定制灌注生物反应器中的皮瓣脉管系统的灌注。在脱细胞之前，根据猪模型的主要供应血管采购和插管三个血管化皮瓣。采购后立即冲洗瓣，以保持专利，可灌注脉管系统，以便成功脱细胞。使用密封的卡扣盖容器，设计了一种定制的生物反应器，以允许在封闭环境中进行瓣灌注。使用连接到组织室的两个蠕动泵以单程方式实现生物反应器内的瓣膜灌注。使用在线压力传感器监测灌注压力。
在脱细胞过程中，SDS暴露的持续时间取决于正在处理的组织类型。使用所述的灌注脱细胞技术，网膜、张筋膜和桡骨前臂皮瓣分别用0.05%SDS脱细胞2天，3天和5天。脱细胞后的成功灭菌证明，在擦拭皮瓣并在琼脂平板上培养拭子14天后没有微生物菌落生长。以2 mL/min的流速监测灌注压力，在所有脱细胞阶段，所有三个瓣膜的灌注压力范围在20-60 mmHg之间。脱细胞后，在手动控制下冲洗皮瓣，并显示出从静脉插管流出以自由引流的证据（补充视频1，补充视频2，补充视频3）。
总共对15个皮瓣进行去细胞化，三种组织类型中每种组织都有5个重复。经检查，天然组织的大体形态呈粉红色（图4A，E，I），而脱细胞组织在外观上具有特征性的白色/不透明（图4C，G，K）。用H&E对天然组织的组织学检查显示存在蓝色细胞核（图4B，F，J）。在去细胞化皮瓣中，H&E染色显示细胞物质损失，没有蓝色核染色（图4D，H，L），表明无细胞组织支架。通过学生对每个皮瓣的t检验，在五个重复中对DNA含量的额外定量显示，与天然组织相比，无细胞支架中的DNA在统计学上显着降低（图5）。在网膜中，DNA从天然皮瓣中的460 ng / mg±124 ng / mg干组织减少到脱细胞皮瓣中的25.8 ng / mg±5.90 ng / mg干组织（n = 5，p < 0.05）。在阔筋膜张量中，天然皮瓣和脱细胞皮瓣之间的DNA分别从297 ng / mg ±68.2 ng / mg降低到58.3 ng / mg ±13.5 ng / mg（n = 5，p < 0.05）。桡向前臂皮瓣显示DNA从天然皮瓣的1180 ng/mg ± 241 ng/mg降低到去细胞皮瓣中的162 ng/mg ±34.9 ng/mg（n = 5，p < 0.05）。
图4：三个猪瓣的去细胞化。 对 （A） 原生网膜、（E） 阔筋膜张肌和 （I） 桡骨前臂皮瓣进行大体检查后立即显示皮瓣呈粉红色。天然组织的组织学染色显示细胞核用H&E（B，F，J）对细胞核进行了清晰的苏木精染色。脱细胞后，（C）网膜，（G）张筋膜和（K）桡骨前臂呈现严重白色和不透明。在组织学上，三个脱细胞瓣显示没有H&E（D，H，L）的核染色。比例尺：200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：无细胞支架中DNA含量的定量。 值归一化为毫克干支架质量。将来自天然非脱细胞组织（n = 5）和脱细胞组织（n = 5）的新鲜组织样品干燥并称重，然后在木瓜蛋白酶中消化过夜，然后再定量。统计检验使用显著性 （**） 水平定义为 p 值 < 0.05 的学生 t 检验。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1。 使用0.05%十二烷基硫酸钠在5天内通过大体检查（比例尺= 3cm）和H&E组织学（比例尺= 200μm）对网膜灌注脱细胞的进展进行时程检查。 请点击此处下载此文件。
补充图2。 使用0.05%十二烷基硫酸钠在5天内通过大体检查（比例尺= 3cm）和H&E组织学（比例尺= 200μm）对张筋膜的灌注脱细胞化进程进行时程检查。 请点击此处下载此文件。
补充图3。 使用0.05%十二烷基硫酸钠在5天内通过大体检查（比例尺= 3cm）和H&E组织学（比例尺= 200μm）对桡骨前臂皮瓣灌注脱细胞的进展进行时程检查。 请点击此处下载此文件。
补充视频 1. 通过动脉套管（粉红色）对脱细胞网膜瓣进行代表性的手动灌注，显示从自由引流的静脉套管 （ 黄色）流出。 请点击此处下载此视频。
补充视频 2.代表性的手动灌注通过动脉套管（粉红色） 对 去细胞张量张筋膜瓣进行灌注，显示从自由引流的静脉套管（蓝色）流出。 请点击此处下载此视频。
补充视频 3.代表性的手动通过动脉套管（蓝色） 灌 注脱细胞的桡骨前臂皮瓣，显示从自由引流的静脉套管（黄色）流出。 请点击此处下载此视频。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
拟议的方案使用低浓度SDS的灌注来使一系列猪源性皮瓣脱细胞。通过此程序，可以使用有利于低浓度 SDS 的方案成功脱细胞，无细胞网膜、阔筋膜张肌和桡骨前臂皮瓣。初步优化实验已确定，当使用组织学技术分析时，2天至5天之间低浓度（0.05%）的SDS能够去除网膜，阔筋膜张肌和桡骨前臂瓣的细胞物质（补充图1，补充图2，补充图3）。这种方法提供了一种简单的方法，可以在短时间内以合理的成本实现去细胞化。根据我们的经验，猪皮瓣的去细胞化和灭菌需要 2-5 天，密度更大的组织需要更长的去细胞化时间（例如，5 天前臂皮肤与 2 天网膜皮肤）。此外，选择本协议中使用的低浓度SDS是基于0.05%的低浓度SDS低于SDS的临界胶束浓度（约0.2%21）的基本原理，因此允许表面活性剂有效地溶解细胞膜，同时保持重要的生物活性ECM组分完整。如先前作者13，22所报道的那样，在该协议中使用低浓度SDS与使用相对较高浓度的SDS（例如，1%）进行血管化筋膜皮肤皮瓣的灌注-脱细胞形成对比。高浓度的SDS虽然在去细胞化方面有效，但代价是对ECM支架产生不利影响，例如GAG和生长因子耗竭，以及胶原蛋白和vimentin23，24等蛋白质的变性。事实上，猪血管化皮瓣灌注-脱细胞的未来工作将受益于额外的表征研究，以检查脱细胞剂在结构和分子水平上对ECM的影响及其对下游再细胞化的影响25，26，27.ECM 成分（如胶原蛋白、弹性蛋白或 GAG 含量）的测定可用于定量评估脱细胞后 ECM 的变化。此外，机械强度测试是研究脱细胞后生物力学性能变化的有用方法。最后，使用血管造影或显微CT扫描等技术评估血管性也将有助于在全身水平上表征血管结构，这是产生可灌注血管化皮瓣的必要条件28。
该协议应注意几个技术注意事项。首先，在皮瓣处理和生物反应器组装过程中应格外小心，以防止意外脱胎，因为在 离体 环境中的置管相对困难。其次，在皮瓣采购过程中，获得具有可灌注且完整的血管蒂的完整皮瓣对于成功脱细胞至关重要。采购时应小心确保脚手架中的远端泄漏点被夹住或手工绑扎。这将有助于减少渗漏，渗漏可能导致溶液通过瓣脉管系统不完全灌注。获取后用肝素化盐水灌注的初始阶段可防止血凝块潴留，并验证静脉灌注液流出证明的可灌注脉管系统。脱细胞组织也可以在脱细胞完成后再次冲洗，以检查是否有任何可能排除皮瓣充血性的潜在血管内梗阻（例如，来自细胞碎片/空气栓塞）。根据我们的经验，按照该方案，脱细胞皮瓣对注射器冲洗没有血管内阻力，而冲洗后可以从脱细胞皮瓣再次观察到静脉流出（补充视频1，补充视频2，补充视频3）。这表明动脉到静脉血管环的未闭，其连接毛细血管可以灌注。
另一个考虑因素是关于脱细胞过程中的灌注参数。在该协议中，选择目标流速为2mL / min的恒定流速灌注，这在先前发表的猪瓣组织脱细胞研究中使用的操作流速范围内13，29。此外，我们的脱细胞系统结合了实时在线压力监测功能，以监测灌注过程中血管内阻力的潜在波动;这种方法可以帮助避免可能损害微血管ECM的血管内闭塞引起的高灌注压。
最后，对所得支架进行灭菌是另一个重要的技术考虑因素。我们将灭菌阶段作为去细胞化方案的最后一步，以解决脱细胞过程中可能发生的偶然环境污染。皮瓣无菌尤为重要，以便将来可以使用皮瓣进行细胞再生。0.1%过氧乙酸/ 4%EtOH作为灭菌剂的灌注先前已被组报道用于灭菌无细胞支架30，31 ，并且还发现对该协议有效。通过检查琼脂平板上的皮瓣拭子培养物并注意到孵育14天后没有生长来验证无菌性。
为实验设计的定制灌注生物反应器相对具有成本效益，并且组装简单快捷。此外，该灌注生物反应器的所有组件都是可高压灭菌的，并适用于细胞再生工作，同时保持瓣的无菌性。定制的生物反应器电路可以很容易地修改，以允许开路灌注，可以在细胞接种实验后通过细胞接种实验后的细胞培养基通过细胞再生支架循环细胞培养基。尽管如此，生物反应器系统的一些局限性值得一提。首先，使用两个商用泵虽然对于防止系统意外溢出是必要的，特别是在使用大量灌注液时，但会降低灌注设置的低成本。此外，当前灌注生物反应器系统的低通量在需要并行运行大量实验重复时可能会带来后勤挑战;为猪肾脱细胞32 开发的相对高通量的系统有朝一日可能会适用于猪皮瓣脱细胞，以减轻这些物流挑战。最后，虽然开发的生物反应器设置简单，但仍需要定期和频繁地进行人工监督和手动操作，以确保系统不会发生故障。为了在未来推进灌注脱细胞生物反应器技术，可以对生物反应器进行修改，这些功能可以监控和重新调整生物反应器的性能，而无需人工干预33，34。
脱细胞皮瓣的主要应用是允许这些无细胞支架随后用可以再生脉管系统的细胞群进行再细胞化。虽然需要大量的未来研究来确定适当的细胞数量，群体，接种策略和生物反应器条件，以再生功能性和可存活的血管化组织，但该协议代表了实现这一目标的初步基础工作。未来的细胞再生方法将有助于建立具有完整可灌注血管网络的软组织瓣设计策略，并有助于潜在再生更复杂的复合组织，例如四肢和面部同种异体移植物。这些支架有朝一日可以绕过接受大规模软组织重建的患者的供体部位发病率和免疫抑制，从而改善他们的临床结果和生活质量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
