Summary
Protokollen beskriver kirurgisk udtagning og efterfølgende decellularisering af vaskulariserede svineklapper ved perfusion af natriumdodecylsulfatvaskemiddel gennem klapvaskulaturen i en tilpasset perfusionsbioreaktor.
Abstract
Store volumen blødt vævsdefekter fører til funktionelle underskud og kan i høj grad påvirke patientens livskvalitet. Selvom kirurgisk rekonstruktion kan udføres ved hjælp af autolog fri klapoverførsel eller vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA), har sådanne metoder også ulemper. Spørgsmål som donorstedsmorbiditet og vævstilgængelighed begrænser autolog fri klapoverførsel, mens immunsuppression er en betydelig begrænsning af VCA. Konstruerede væv i rekonstruktiv kirurgi ved hjælp af decellularisering / recellulariseringsmetoder repræsenterer en mulig løsning. Decellulariseret væv genereres ved hjælp af metoder, der fjerner naturligt cellulært materiale, samtidig med at den underliggende ekstracellulære matrix (ECM) mikroarkitektur bevares. Disse acellulære stilladser kan derefter efterfølgende recellulariseres med modtagerspecifikke celler.
Denne protokol beskriver de indkøbs- og decellulariseringsmetoder, der anvendes til at opnå acellulære stilladser i en svinemodel. Derudover giver den også en beskrivelse af perfusionsbioreaktorens design og opsætning. Klapperne omfatter porcine omentum, tensor fascia lata og den radiale underarm. Decellularisering udføres via ex vivo perfusion af natriumdodecylsulfat (SDS) vaskemiddel med lav koncentration efterfulgt af DNase-enzymbehandling og pereddikesyresterilisering i en tilpasset perfusionsbioreaktor.
Vellykket vævsdecellularisering er kendetegnet ved et hvidt uigennemsigtigt udseende af klapper makroskopisk. Acellulære klapper viser fraværet af kerner ved histologisk farvning og en signifikant reduktion i DNA-indholdet. Denne protokol kan bruges effektivt til at generere decellulariserede bløddelsstilladser med bevaret ECM og vaskulær mikroarkitektur. Sådanne stilladser kan anvendes i efterfølgende recellulariseringsundersøgelser og har potentiale til klinisk oversættelse i rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skade og tumorfjernelse kan føre til store og komplekse bløddelsdefekter. Disse defekter kan forringe patientens livskvalitet, forårsage tab af funktion og resultere i permanent handicap. Mens teknikker som autolog vævsklapoverførsel er blevet almindeligt praktiseret, er problemer med klaptilgængelighed og donorstedsmorbiditet store begrænsninger 1,2,3. Vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA) er et lovende alternativ, der overfører sammensatte væv, fx muskler, hud, vaskulatur, som en enkelt enhed til modtagere. VCA kræver imidlertid langvarig immunsuppression, hvilket fører til lægemiddeltoksicitet, opportunistiske infektioner og maligniteter 4,5,6.
Vævskonstruerede acellulære stilladser er en potentiel løsning på disse begrænsninger7. Acellulære vævsstilladser kan opnås ved hjælp af decellulariseringsmetoder, som fjerner cellulært materiale fra indfødte væv, samtidig med at den underliggende ekstracellulære matrix (ECM) mikroarkitektur bevares. I modsætning til brugen af syntetiske materialer inden for vævsteknik tilbyder brugen af biologisk afledte stilladser et biomimetisk ECM-substrat, der muliggør biokompatibilitet og potentialet for klinisk oversættelse8. Efter decellularisering kan den efterfølgende recellularisering af stilladser med modtagerspecifikke celler derefter generere funktionelle, vaskulariserede væv med ringe eller ingen immunogenicitet 9,10,11. Ved at udvikle en effektiv protokol til opnåelse af acellulære væv ved hjælp af perfusionsdecellulariseringsteknikker kan en bred vifte af vævstyper konstrueres. Til gengæld giver bygningen på denne teknik applikationen mulighed for mere komplekse væv. Til dato er perfusionsdecellularisering af vaskulariseret blødt væv blevet undersøgt ved hjælp af enkle vaskulariserede væv såsom en fuld tykkelse fasciocutaneous flap i gnaver12, svin 13 og humane modeller14 samt porcine rectus abdominis skeletmuskel15. Derudover er komplekse vaskulariserede væv også blevet perfusion decellulariseret som demonstreret i svin og humant øre 16,17 modeller og human full-face graft modeller18.
Her beskriver protokollen decellulariseringen af vaskulariserede frie klapper ved hjælp af biologisk afledte ECM-stilladser. Vi præsenterer decellulariseringen af tre klinisk relevante klapper: 1) omentum, 2) tensor fascia lata og 3) den radiale underarm, som alle er repræsentative for arbejdshesteklapper, der rutinemæssigt anvendes i rekonstruktiv kirurgi og ikke tidligere er blevet undersøgt i dyreforsøg i forbindelse med vævsdecellularisering. Disse bioengineered klapper tilbyder en alsidig og let tilgængelig platform, der har potentiale til kliniske anvendelser til brug inden for reparation og rekonstruktion af store bløddelsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyreforsøgspersoner, er godkendt af University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og udføres i overensstemmelse med University Health Network Animal Resource Center protokol og procedurer og Canadian Council on Animal Care Guidelines. Fem Yorkshire grise (35-50 kg; alder ca. 12 uger gamle) blev brugt til alle forsøg.
1. Fremstilling af perfusionsbioreaktorer
- Se figur 1 for alle de komponenter, der anvendes i perfusionsbioreaktoren. Til fremstilling af vævskammeret skal du bruge kommercielt tilgængelige polypropylen snap-lock beholdere med vandtætte og lufttætte låg indeholdende en silikone tætningsforing. Sørg for, at containerne er autoklavekompatible.
- Bor to 1/4 i huller langs beholderens sider og træk et kort segment af L / S-16 platinbelagt silikonerør. Den ene slange vil bære tilstrømningen perfusat, og den anden er til udstrømningen.
- Til tilstrømningsslangen skal du fastgøre et han-Luer-stik ved den indre del, der skal bruges til at forbinde til vævskanylen. Fastgør et hun-Luer-stik i den ydre ende af indstrømningsslangen, der skal bruges til at forbinde til en trevejs stophane.
- Bor et enkelt 1/4 i hul på kammerlåget og træk et andet kort segment af L / S-16 platinbelagt silikonerør. Denne slange fungerer som luftudluftning.
- Trængnings- og udstrømningsslangen foretages ved at måle ca. 50 cm L/S-16 platinbelagte silikoneslanger. Tilslut den ene ende til en gul tre-stop pumpeslange og den anden ende til en steril 2 ml serologisk pipette for at føre perfusat fra vaskemiddelreservoirerne ind i bioreaktorkammeret.
- Autoklave alle komponenter (kammer og slanger) i individuelt indpakket steril emballage.
Figur 1: Fremstilling af perfusionsbioreaktoren. Perfusionsbioreaktoren består af (A) et plastpolypropylenvævskammer (B) med sidehuller boret til at rumme perfusionsrør med luft- og vandtæt låg. (C) Stophaner er fastgjort til slanger for at gøre det muligt at fastgøre perfusionsrøret, der bærer decellulariseringsmidler fra vaskemiddelbeholderen til affald på en enkeltpassage-måde. (D) Kompatible pumpekassetter bruges til at forbinde tre-stop-slangen til peristaltisk pumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Fremstilling af decellulariseringsopløsninger
- Der fremstilles hepariniseret normal saltopløsning (15 IE/ml) ved fortynding af 1,5 ml 1000 I.U./ml heparinstamopløsning i 100 ml normal saltvand.
- Der fremstilles 0,05% w/v natriumdodecylsulfatopløsning (SDS) ved langsomt at tilsætte 9 g SDS-pulver til 18 liter autoklaveret destilleret deioniseret vand. Brug en stor mængde polypropylen (PP) carboy til at rumme SDS-opløsningen. Opløsningen er klar til brug, når den er helt opløst. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered DNase I arbejdsløsning. Først rekonstitueres frysetørret DNase I til en stamkoncentration på 10 mg/ml med 5 mMCaCl2 i steril dH2O. Den rekonstituerede DNase I-opløsning opbevares som aliquoter i en -20 °C fryser, indtil den er klar til brug. På brugsdagen fortyndes DNase I-lager 1:100 med Mg++(1,29 mM) og Ca++(1,98 mM) i steril dH2O til en slutkoncentration på 0,1 mg/ml.
BEMÆRK: DNase-aktivitet forringes, medmindre den opbevares frosset. Kun frisk fungerende DNase-opløsning bør anvendes til enzymatisk fordøjelse af DNA ved stuetemperatur. - Der fremstilles 1x PBS-opløsning ved at fortynde 10x PBS-stammateriale 1:10 med sterilt autoklaveret vand i et 5 L slutvolumen i en PP-carboy. Opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 1% antibiotika / antimykotika (A / A) i PBS. Fortynd 100x antibiotika/antimykotika 1:100 med steril 1x PBS-opløsning til et slutvolumen på 1 L. Opbevares ved stuetemperatur.
- Der fremstilles 0,1 % (v/v) pereddikesyre (PAA)/4 % (v/v) ethanol (EtOH) ved tilsætning af 3,13 ml PAA + 40 ml 100 % ethanol + 956 ml steril dH2O. Det endelige volumen bringes op på 1.000 ml og opbevares ved stuetemperatur.
3. Indkøb af svineklapper
BEMÆRK: Dette er en terminalprocedure. En gris blev brugt til at skaffe alle tre klapper. Afliv dyret humant efter indkøb af alle klapper.
- Præoperativ pleje
- Hurtige grise mindst 12 timer før operationen. Bedøve dyrene med ketamin (20 mg/kg intramuskulært, IM), atropin (0,04 mg/kg IM) og midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Inducer anæstesi ved indånding af 5% isofluran gennem en maske ved en strømningshastighed på 22-44 ml / kg / min til perifer linjeindsættelse og intubation. Oprethold anæstesi med 0,5% -2% isofluran ved 22-44 ml / kg / min. Sørg for en tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at kontrollere hæmodynamisk stabilitet og bemærk fraværende palpebral / pedal tilbagetrækningsreflekser eller kæbemuskeltonus for at angive et passende niveau af anæstetika administreret. Intravenøs remifentanil (10-20 μg/kg/h) infusion med kontinuerlig hastighed under operation for analgesi.
- Grisen intuberes med et passende endotrachealrør (7-8 mm), og røret tilsluttes en ventilator, der er indstillet til et tidevandsvolumen på 8 ml/kg, PEEP på 5 cm H20, FiO2 på 0,5 og respirationsfrekvens på 14.
- Indsæt et 22 G angiocathkateter i ørevenen. Når intravenøs (IV) adgang er opnået, tilsættes varm 0,9% normal saltvand ved 5-10 ml / kg / h under hele proceduren for at opretholde det gennemsnitlige arterielle tryk mellem 60 mmHg og 90 mmHg.
- Overvåg kontinuerligt puls, pulsoximetri og endetids CO2. Vurder blodtryk og kropstemperatur hvert 5. minut.
- Påfør øjensalve for at forhindre okulær tørhed, mens du er under anæstesi. Forbered hele det kirurgiske felt med povidon-jod. Drape det kirurgiske felt med sterile håndklæder.
- Omental klap
- Placer grisen i liggende stilling og udfør en xypho-navlestreng laparotomi.
- Når du kommer ind i maven, mobiliserer maven cephalad for at visualisere det større omentum. Placer omhyggeligt omentum i det operative felt og identificer de gastro-epiploiske kar, der løber langs den større krumning af maven (figur 2A).
- Begynd ved venstre aspekt af den større krumning, hvor den venstre gastro-epiploiske arterie slutter sig til miltarterien. Ved hjælp af lige Stevens tenotomi saks, skelet både venstre gastro-epiploic arterie og vene. Ligate deler derefter begge separat ved hjælp af kirurgiske bånd eller klip.
- Fortsæt langs den større krumning af maven fra venstre mod højre. Læg og del de korte vaskulære grene, der stammer fra omentum, der leverer den større krumning af maven. Pas på ikke at skade den vigtigste gastroepiploiske pedicle af omentum under dette trin.
- Fortsæt mobiliseringen af det større omentum, indtil krydset mellem de højre gastro-epiploiske fartøjer og gastroduodenalarterien er stødt på. Med klip eller bånd deler ligat derefter den højre gastroepiploiske arterie og vener separat for at frigøre omentalklappen.
- Når den er frigivet, kan omentum opdeles langs midten i to halvdele, hvor hver halvdel ledsages af en respektive gastro-epiploisk arterie og vene. Dette gør det muligt at købe to omentalfrie klapper fra en dyreoperation. Kannulere individuelt gastro-epiploiske kar med en 20-22 G kanyle og fastgør derefter med 3-0 silkebånd.
- Skyl hepariniseret saltvand (15 I.U./ml) ind i den gastroepiploiske arterielle kanyle, indtil der observeres en klar venøs udstrømning.
- Tensor fascia lata klap
BEMÆRK: Protokollen er baseret på en tidligere beskrivelse af porcine tensor fascia lata flap af Haughey et al.19. Modifikation foretages for kun at isolere den fasciale del af tensor fascia lata-klappen.- Placer grisen i lateral decubitus position og barber hele øvre bagben bilateralt. Forbered og drape ved hjælp af de sædvanlige sterile procedurer.
- Marker den forreste grænse af klappen med en linje, der strækker sig fra den forreste overlegne iliac rygsøjle (ASIS) mod den laterale patella. Placeringen af pedicle er ca. 6-8 cm fra ASIS langs denne linje.
- Marker en parallel bageste linje ca. 8 cm til 10 cm fra det forreste snit langs lårbenets akse for at inkludere klappens bredde. Marker den distale kant af klappen ved den laterale patella.
- Begynd dissektionen ved den distale margen ved patellaen med et skarpt snit i huden ved hjælp af en skalpel. Uddyb hudsnittet med cautery gennem det subkutane væv, indtil fasciaen, der ligger over rectus femoris, er stødt på.
- Fortsæt hudindsnittene mod ASIS langs de markerede forreste og bageste grænser, der er beskrevet ovenfor. For at isolere fascialklappen alene skal du fjerne den overliggende hudkomponent fra det underliggende fasciale lag. Læg eller cauterize eventuelle små perforatorbeholdere til huden.
- Vend tilbage til klappens distale kant, og indskær den dybe fascia for at muliggøre mobilisering af den underliggende vastus lateralis muskel. Mobiliser fasciaen mod ASIS.
- Under mobilisering identificeres den vaskulære pedikel, der kommer ud mellem vastus lateralis og rectus femoris muskler (figur 2B). Pas på at undgå overdreven trækkraft for ikke at skade pedikelkarrene.
- Disseker det proksimale aspekt fra ASIS, mens du beskytter den vaskulære pedikel. Disseker, indtil klappen er tilstrækkeligt mobiliseret om sin pedikel.
- Spor pediklen mod de dybe lårbenskar. Skeletonize både den laterale circumflex lårbensarterie og vene, der leverer fascialklappen. Ligate deler derefter begge fartøjer proximalt, hvor de slutter sig til de dybe lårbenskar.
- Kannulere pedikelkarrene individuelt med 20 G til 24 G angiocatheters, sikret med 3-0 silkebånd. Skyl hepariniseret saltvand (15 I.U./ml) ind i klappens arterielle kanyle, indtil der observeres en klar venøs udstrømning.
- Radial underarmsklap
BEMÆRK: Protokollen nedenfor er baseret på en offentliggjort beskrivelse af den svinske radiale underarmsklapmodel af Khachatryan et al.20.- Placer grisen på operationsbordet i lateral decubitus position. Placer det afhængige forben inden for det operative felt.
- Marker en ca. 3 cm x 3 cm hudklapfirkant på den radiale underarm. Tegn en linje mellem midtpunktet af den proksimale klapmargen og den antecubitale fossa for at betegne det omtrentlige forløb af den radiale arteriepedikel. Bekræft arterielt kursus med palpation.
BEMÆRK: I svinemodellen er de radiale kar placeret relativt dybere end hos mennesker. Deres placering er mellem flexor carpi radialis og brachioradialis. - Skær huden ved hjælp af en skalpel ved det distale aspekt med en dybde op til antebrachial fascia. Stump dissekere med tenotomi saks, indtil den distale radiale arterie og dens to venae comitantes er stødt på. Ligate arterien og venerne med kirurgiske bånd individuelt og opdele.
- Fortsæt hudindsnittene på de radiale og ulnar margener af den markerede hudfirkant. Mobiliser klappen fra den underliggende radiale knogle med et kirurgisk blad, der går fra en radial til ulnar retning, samtidig med at hudklappen hæves proximalt mod antecubital fossa.
BEMÆRK: Oprethold et subfascialt dissektionsplan for at sikre, at den radiale arteriepedikel forbliver forbundet med det overliggende kutane lag. - Ved den proksimale margen trækkes mellemrummet mellem brachioradialis og flexor carpi radialis tilbage med en selvbevarende retraktor for at udsætte den proksimale radiale arterie og dens venae comitantes (figur 2C).
- Ved hjælp af tenotomi saks skeleteres den radiale arterie og venae comitantes proximalt ved antecubital fossa, hvor de slutter sig til henholdsvis brachialarterien og venerne. Disseker karrene fra det omgivende fibrofedtvæv for at opnå en tilstrækkelig pedikellængde på ca. 5-6 cm. Læg og del arterien og venae separat for at frigøre den radiale underarmsklap.
- Kannulere pedikelkarrene med 20 G til 24 G angiocatheters, sikret med 3-0 silkebånd. Skylles hepariniseret saltvand (15 IE / ml) ind i klaparteriel kanyle, indtil der observeres en klar venøs udstrømning.
- Efter flap-indkøb skal klapperne opbevares i koldt saltvand ved 4 °C, indtil de er klar til decellularisering. Under dyb isofluranbedøvelse aflives dyrene med en intravenøs injektion af kaliumchlorid (100 mg/kg IV). Bekræft døden ved fravær af vitale tegn.
Figur 2: Indkøb af tre svinekarulariserede klapper . (A) Omentum. Den højre (i) og venstre (ii) gastroepiploiske arterier er kanyleret i omental flap (iii). (B) Tensor fascia lata. Klappens pedikel (iv) er den stigende gren af den laterale lårbenspulsåre (v). (C) Radial underarmsklap. Indkøb af den radiale underarmsklap (vi) er baseret på den radiale arterie og vena comitantes (vii) som vaskulær pedikel (BEMÆRK: Gardiner blev udeladt til demonstrationsformål). Vægtstænger: 3 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Opsætning af decellulariseringssystemet
- Saml vævskammeret med klapper under sterile forhold i et laminært flow biosikkerhedsskab.
- Fastgør en trevejs stophane til både bioreaktorens indstrømnings- og udstrømningsporte. Fastgør et 0,2 μm filter til udluftningsporten på vævskammerlåget. Prime tilstrømningsslangen med sterilt hepariniseret saltvand for at eliminere luftbobler.
- Placer klapperne i kammeret. Brug sterile hæmostater til at forbinde klapperne til indstrømningsslangen ved hjælp af det mandlige Luer-stik. Skru den respektive arterielle kanyle for hver klap på hannen Luer og sørg for en tæt tætning.
- Skyl hepariniseret saltvand gennem stophanen for at kontrollere, at Luer-forbindelsen er uden lækager, og at klapperne kan gennemsyres med tegn på venøs udstrømning. Luk vævskammerets låg.
- Tilslut tilstrømningsslangen med en gul tre-stop pumpeslange til tilstrømningsstophanen i vævskammeret. Fastgør også en inline tryksensortransducer til tilstrømningen trevejs stophane for at muliggøre perfusionstrykovervågning.
- Tænd for tilstrømningspumpen. På startskærmen skal du fortsætte til den tredje fane ved hjælp af piletasten for at indstille slange-id'et til 1,85 mm. Fortsæt derefter til den anden fane for at indstille perfusionshastigheden. Inputhastighed som leveringsmåde og indstillet til 2 ml/min. Sørg for, at strømningsretningen er korrekt, som den vises på skærmen. Læg tre-stop-pumpeslangen på peristaltic-pumpen med en kompatibel kassette.
- Gentag proceduren for udstrømningsperistaltisk pumpe svarende til ovenstående. Indstil udstrømningspumpens indstilling til hastighed på 4 ml/min. Tilslut udløbsrøret med en gul tre-stop pumpeslange til vævskammerets udstrømningsstophane. Læg tre-stop-pumpeslangen på peristaltic-pumpen med en kompatibel kassette. Start flowet for begge pumper ved at trykke på tænd/sluk-knappen .
BEMÆRK: Den højere hastighed af udstrømningspumpen er en afgørende sikkerhedsforanstaltning for at forhindre overløb af vævskammeret, hvilket sikrer, at kammerudstrømningen altid overstiger tilstrømningen i løbet af decellularisering. Hele den samlede decellulariseringsopsætning er afbildet i figur 3.
Figur 3: Samlet perfusion decellulariseringssystem. (A) Skematisk af perfusionsdecellulariseringssystemet. Indstrømningsslangen fører perfusat fra vaskemiddelbeholderen ind i vævskammeret på en enkeltpassage-måde med tryksensorovervågning. Udstrømningsslangen fjerner perfusat aktivt fra vævskammeret ind i affaldsbeholderen. Sorte pile angiver retningen af perfusionsstrømmen. En peristaltisk pumpe bruges sammen med venstre pumpe til at styre tilstrømningen. Udstrømning fjernes aktivt ved hjælp af en anden peristaltisk pumpe gennem den respektive slange. Figur oprettet med BioRender.com. (B) Fotografi af perfusionsdecellulariseringssystemet samlet på bordpladen med den tilstrømningsperistaltiske pumpe (i) forbundet til vævskamrene (ii) og derefter den peristaltiske pumpe (iii). Indstrømningsperfusattrykket overvåges med en in-line tryksensor (iv), inden det kommer ind i vævskammeret. Her decelluleres tre klapper parallelt. Både vaskemiddel- og affaldsreservoirerne er under bordpladen og ikke fotograferet. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Decellularisering af svineklapper
- Udfør alle følgende trin til perfusionsdecellularisering ved stuetemperatur. For en oversigt over perfusionshastigheder og varigheder henvises til tabel 1. Begynd perfusion af hepariniseret saltvand ved 2 ml / min ved hjælp af en peristaltisk pumpe og perfuse klapperne med hepariniseret saltvand i vævskammeret i 15 minutter for at fjerne eventuelle tilbageholdte blodpropper.
- Efter afslutning af hepariniseret saltvandsperfusion aspirater resterende saltvand i vævskammeret. Fyld vævskammeret med ca. 500 ml SDS-decellulariseringsopløsning for at nedsænke klappen tilstrækkeligt.
- Overfør indstrømningsslangen til SDS-decellulariseringsopløsningen, og perfuser vævet ved 2 ml / min. Varigheden af perfusion varierer afhængigt af klappen; perfuse SDS i 2 dage for omentum, 3 dage for tensor fascia og 5 dage for radial underarm fascio-kutan klap.
- Efter afslutningen af SDS-decellulariseringen aspireres det eksisterende SDS-perfusat indeholdt i vævskammeret. Overfør indstrømningsslangen til 1x PBS-opløsning, og opsæt klapperne i 1 dag ved 2 ml/min.
- Fjern den tidligere PBS-opløsning, og overfør indstrømningsslangen til DNase-arbejdsløsningen. Omdrejningstal i 2 timer ved 2 ml/min. DNase-opløsningen fjernes fra vævskammeret, og indløbsslangen anbringes i 1x PBS-opløsning. Nedsænk vævene med 1x PBS-opløsning i kammeret og perfuse 1x PBS-opløsning i 1 dag ved 2 ml/min.
- Steriliser klapperne med PAA/EtOH-opløsning. Indstrømningsslangen overføres til PAA/EtOH i dH 2O-opløsning, og vævene nedsænkes i samme opløsning. Perfuse PAA/EtOH ved 2 ml/min i 3 timer. Når PAA / EtOH-steriliseringen er afsluttet, skal du frakoble slangen fra trevejs stophanerne.
- Klapperne fjernes ved hjælp af aseptisk teknik, og de sterile instrumenter anbringes i PBS indeholdende 1 % antibiotika/antimykotika (A/A). Dyk klapperne med PBS + 1% A/A i 15 minutter i to separate vaske for at neutralisere restsyren helt. Klapperne opbevares i PBS + 1 % A/A ved 4 °C, indtil de er klar til recellularisering.
- Kontroller stilladsets sterilitet ved at udføre en vatpindskultur på agarplader og undersøg for mikrobiel vækst. Podelæg agarplader med vatpinde taget fra hver klapoverflade. Dyrkning af agarpladerne ved 37 °C i op til 2 uger. Sterilitet demonstreres ved fraværet af mikrobiel kolonivækst.
Tabel 1: Oversigt over perfusions-decellulariseringsprotokolparametre. Klik her for at downloade denne tabel.
6. Evaluering af decellularisering
- Ved hjælp af en stansebiopsi anskaffes prøver 3 mm til 10 mm i tykkelse fra klapperne.
- Til histologi fastgøres biopsier i histologiske kassetter i normal bufferet formalin i 24 timer ved stuetemperatur.
- Vask biopsikassetterne i vand eller PBS i 15 minutter, og læg dem derefter i 70% ethanol, indtil de er klar til vævsbehandling. Behandl kassetterne i en vævsprocessor i henhold til standardprotokoller.
- Integrer biopsierne i paraffin, så voksen kan størkne i 10-15 minutter på en kold plade. Sektion paraffin blokke på en mikrotom til 5 μm tykkelse. Plet diasene med hæmatoxylin og eosin (H&E) i henhold til standardprotokoller. Billede vævet glider med lysmikroskopi.
- Til kvantificering af DNA-indhold opnås tørvægten af vævsbiopsierne efter vævstørring natten over i en ovn ved 60 °C. Prøverne fordøjes i en buffer til papainekstraktion ved 65 °C natten over. De fordøjede prøver centrifugeres ved 10.000 x g , og supernatanten overføres til et frisk mikrocentrifugerør. Assay DNA-indholdet med et kommercielt DNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol til decellularisering af vaskulariserede svineklapper er afhængig af perfusion af et ionbaseret vaskemiddel, SDS, gennem klapvaskulaturen i en tilpasset perfusionsbioreaktor. Før decellularisering blev tre vaskulariserede klapper i en svinemodel indkøbt og kanyleret i henhold til deres vigtigste forsyningsbeholdere. Klapperne blev straks skyllet efter indkøb for at opretholde en patent, perfusable vaskulatur for at muliggøre en vellykket decellularisering. Ved hjælp af lufttætte snap-lågbeholdere blev en tilpasset bioreaktor designet til at muliggøre klapperfusion i et lukket miljø. Perfusion af klapper i bioreaktoren blev opnået på en enkelt-pass måde ved hjælp af to peristaltiske pumper forbundet med vævskammeret. Perfusionstrykket blev overvåget med en in-line tryksensor.
Under decellularisering var varigheden af SDS-eksponering afhængig af den type væv, der blev behandlet. Med den beskrevne perfusionsdecellulariseringsteknik blev omentum, tensor fascia og radiale underarmsklapper decellulariseret med 0,05% SDS i henholdsvis 2 dage, 3 dage og 5 dage. Vellykket sterilisering efter decellularisering blev demonstreret ved fravær af mikrobiel kolonivækst efter podning af klapperne og dyrkning af vatpindene på agarplader i 14 dage. Perfusionstryk blev overvåget ved en strømningshastighed på 2 ml/min og varierede mellem 20-60 mmHg i alle faser af decellularisering for alle tre klapper. Efter afslutningen af decellulariseringen blev klapperne skyllet under manuel kontrol og demonstrerede tegn på udstrømning fra en venøs kanyle, der blev efterladt til fri dræning (supplerende video 1, supplerende video 2, supplerende video 3).
I alt 15 klapper blev decellulariseret med fem replikater for hver af de tre vævstyper. Ved undersøgelse syntes den grove morfologi af indfødte væv lyserødfarvet (figur 4A, E, I), mens decellulariserede væv var karakteristisk hvide / uigennemsigtige i udseende (figur 4C, G, K). Histologisk undersøgelse af indfødte væv med H&E viser tilstedeværelsen af blå kerner (figur 4B, F, J). I decellulariserede klapper viste H&E-farvning et tab af cellulært materiale med fravær af blå nuklear farvning (figur 4D, H, L), hvilket indikerer et cellulært vævsstillads. Yderligere kvantificering af DNA-indholdet i de fem replikater viste et statistisk signifikant fald i DNA i de acellulære stilladser sammenlignet med indfødte væv ved en studerendes t-test for hver klap (figur 5). I omentum faldt DNA fra 460 ng/mg ± 124 ng/mg tørvæv i den oprindelige klap til 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg tørvæv i den decellulariserede klap (n = 5, p < 0,05). I tensor fascia lata faldt DNA fra 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg til 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg mellem henholdsvis native og decellulariserede klapper (n = 5, p < 0,05). Den radiale underarmsklap viste et DNA-fald fra 1180 ng/mg ± 241 ng/mg i den native klap til 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg i den decellulariserede klap (n = 5, p < 0,05).
Figur 4: Decellularisering af tre svineklapper. Grov undersøgelse af (A) native omentum, (E) tensor fascia lata og (I) radiale underarmsflapper viser klappernes lyserøde udseende umiddelbart efter indkøb. Den histologiske farvning af indfødte væv viser klar hæmatoxylinfarvning af cellulære kerner med H&E (B, F, J). Efter decellularisering fremstår (C) omentum, (G) tensor fascia lata og (K) radial underarm groft hvid og uigennemsigtig. Histologisk viser de tre decellulariserede klapper et fravær af nuklear farvning med H&E (D, H, L). Vægtstænger: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af DNA-indhold i acellulære stilladser. Værdier normaliseres til mg tør stilladsmasse. Friske vævsprøver fra indfødte, ikke-decellulariserede væv (n = 5) og decellulariserede væv (n = 5) blev tørret og vejet før fordøjelsen natten over i papain inden kvantificering. Statistisk test brugt Studerendes t-tests med et signifikans (**) niveau defineret som en p-værdi < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1. Tidsforløbsundersøgelse af progressionen af perfusion-decellularisering af omentum ved anvendelse af 0,05% natriumdodecylsulfat over 5 dage ved bruttoundersøgelse (skalastænger = 3 cm) og H&E-histologi (skalastænger = 200 μm). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2. Tidsforløbsundersøgelse af progressionen af perfusion-decellularisering af tensor fascia lata under anvendelse af 0,05% natriumdodecylsulfat over 5 dage ved bruttoundersøgelse (skalastænger = 3 cm) og H&E-histologi (skalabjælker = 200 μm). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3. Tidsforløbsundersøgelse af progressionen af perfusion-decellularisering af radial underarmsklap ved anvendelse af 0,05% natriumdodecylsulfat over 5 dage ved bruttoundersøgelse (skalastænger = 3 cm) og H&E-histologi (skalastænger = 200 μm). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video 1. Repræsentativ manuel perfusion af den decellulariserede omentumklap via arteriel kanyle (lyserød), der viser udstrømning fra den frit drænende venøse kanyle (gul). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2. Repræsentativ manuel perfusion af den decellulariserede tensor fascia lata-klap via arteriel kanyle (lyserød), der demonstrerer udstrømning fra den frit drænende venøse kanyle (blå). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 3. Repræsentativ manuel perfusion af den decellulariserede radiale underarmsklap via arteriel kanyle (blå), der viser udstrømning fra den frit drænende venøse kanyle (gul). Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreslåede protokol bruger perfusion af SDS med lav koncentration til at decellularisere en række svineafledte klapper. Med denne procedure kan acellulært omentum, tensor fascia lata og radiale underarmsklapper med succes decellulariseres ved hjælp af en protokol, der favoriserer SDS med lav koncentration. Foreløbige optimeringseksperimenter har fastslået, at SDS i en lav koncentration (0,05%) mellem 2 dage og 5 dage er i stand til at fjerne cellulært materiale til omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklap, når det analyseres med histologiske teknikker (supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3). Denne metode tilbyder en ligetil tilgang, der opnår decellularisering inden for en kort tidsramme og til en rimelig pris. Efter vores erfaring tager decellularisering og sterilisering af svineklapper mellem 2-5 dage, med længere varighed decellularisering nødvendig for væv med større densitet (f.eks. Underarmshud efter 5 dage vs. omentum efter 2 dage). Desuden blev den lave koncentration af SDS, der anvendes i denne protokol, valgt ud fra begrundelsen om, at en lav koncentration af SDS ved 0,05% falder under den kritiske micellære koncentration af SDS (ca. 0,2%21) og dermed gør det muligt for det overfladeaktive stof effektivt at opløse cellemembraner, mens vigtige bioaktive ECM-komponenter forbliver intakte. Brugen af SDS med lav koncentration i denne protokol står i kontrast til brugen af relativt højere koncentrationer af SDS (f.eks. 1%) til perfusion-decellularisering af vaskulariserede fascio-kutane klapper som rapporteret af tidligere forfattere13,22. Høje koncentrationer af SDS, selvom de er effektive til decellularisering, kommer på bekostning af skadelige virkninger på ECM-stilladset, såsom GAG og vækstfaktorudtømning samt denaturering af proteiner som kollagen og vimentin23,24. Faktisk vil fremtidigt arbejde med perfusion-decellularisering af svin vaskulariserede klapper drage fordel af yderligere karakteriseringsundersøgelser for at undersøge virkningerne af decellulariseringsmidlet på ECM på strukturelle og molekylære niveauer og deres konsekvenser for downstream recellularisering25,26,27 . Assays for ECM-komponenter såsom kollagen, elastin eller GAG-indhold kan bruges til kvantitativt at vurdere ændringer i ECM efter decellularisering. Desuden er mekanisk styrketest en nyttig modalitet til at studere ændringer i de biomekaniske egenskaber efter decellularisering. Endelig vil vurdering af vaskulariteten ved hjælp af teknikker som angiografi eller mikroCT-scanning også bidrage til at karakterisere den vaskulære arkitektur på et systemisk niveau som en forudsætning for at generere perfusable vaskulariserede klapper28.
Flere tekniske overvejelser bør bemærkes med denne protokol. For det første bør der udvises stor forsigtighed under håndtering af klapper og samling af bioreaktorer for at forhindre utilsigtet dekannation, da reannulation i en ex vivo-indstilling er forholdsvis vanskeligere. For det andet er opnåelse af en intakt klap med en perfusabel og intakt vaskulær pedicle under flapindkøb afgørende for en vellykket decellularisering. Der skal under indkøbet sørges for, at distale lækagepunkter i stilladset enten klippes eller håndbindes. Dette vil medvirke til at reducere lækage, hvilket kan forårsage ufuldstændig perfusion af opløsninger gennem klapvaskulaturen. En indledende periode med perfusion med hepariniseret saltvand efter udtagning forhindrer tilbageholdelse af blodpropper og verificerer en perfusabel vaskulatur, som det fremgår af venøs perfusatudstrømning. Decellulariseret væv kan også skylles igen efter afslutning af decellularisering for at kontrollere eventuelle potentielle intravaskulære forhindringer (f.eks. Fra celleaffald / luftemboli), der kan udelukke klapperfusabilitet. Efter vores erfaring viste decellulariserede klapper ingen intravaskulær resistens over for sprøjteskylning efter denne protokol, mens venøs udstrømning igen kunne observeres fra den decellulariserede klap efter skylning (supplerende video 1, supplerende video 2, supplerende video 3). Dette var tegn på en patentarteriel til venøs vaskulær sløjfe med forbindelseskapillærer, der kan perfunderes .
En anden overvejelse foretages vedrørende perfusionsparametrene under decellularisering. I denne protokol blev der valgt en perfusion med konstant strømningshastighed med en målstrømningshastighed på 2 ml / min, hvilket var inden for området for de driftsstrømningshastigheder, der blev brugt i tidligere offentliggjorte decellulariseringsundersøgelser af svineklapvæv13,29. Desuden inkorporerer vores decellulariseringssystem en realtids in-line trykovervågningskapacitet for at overvåge potentielle udsving i intravaskulær modstand i løbet af perfusion; denne metode kan hjælpe med at undgå høje perfusionstryk som følge af mulig intravaskulær okklusion, der kan beskadige den mikrovaskulære ECM.
Endelig er sterilisering af det resulterende stillads en anden vigtig teknisk overvejelse. Vi indarbejdede en steriliseringsfase som det sidste trin i decellulariseringsprotokollen for at imødegå tilfældig miljøforurening, der kan opstå under decellularisering. Flap sterilitet er især vigtig, så klapper kan bruges i fremtiden til recellularisering. Perfusion af 0,1% pereddikesyre / 4% EtOH som sterilant er tidligere blevet rapporteret af grupper til sterilisering af acellulære stilladser30,31 og viste sig også at være effektiv med denne protokol. Sterilitet blev verificeret ved at undersøge klappindskulturer på agarplader og bemærke manglende vækst efter 14 dages inkubation.
Den tilpassede perfusionsbioreaktor designet til eksperimenterne er relativt omkostningseffektiv såvel som enkel og hurtig at samle. Desuden er alle komponenterne i denne perfusionsbioreaktor autoklaverbare og tilpasningsdygtige til recellulariseringsarbejde, samtidig med at klappernes sterilitet opretholdes. Det tilpassede bioreaktorkredsløb kan let ændres for at tillade perfusion med åbent kredsløb, der kan cirkulere cellekulturmedier gennem et recellulariseret stillads efter cellesåningseksperimenter. Ikke desto mindre er et par begrænsninger af bioreaktorsystemet værd at nævne. For det første forringer brugen af to kommercielle pumper, selv om det er nødvendigt for at forhindre utilsigtet overløb af systemet, især når der anvendes store mængder perfusat, de ellers lave omkostninger ved perfusionsopsætningen. Derudover kan den lave gennemstrømning af det nuværende perfusionsbioreaktorsystem give logistiske udfordringer, når der skal køres adskillige eksperimentelle replikater parallelt; Forholdsvis højere gennemløbssystemer udviklet til svinenyredecellularisering32 kan en dag tilpasses til svineklapdecellularisering for at afhjælpe disse logistiske udfordringer. Endelig, mens den udviklede bioreaktor er enkel at opsætte, er der stadig behov for menneskelig overvågning og manuel betjening regelmæssigt og ofte for at sikre, at der ikke opstår funktionsfejl i systemet. Ændringer af bioreaktoren, der inkorporerer automatiseringsfunktioner, der både kan overvåge og justere bioreaktorens ydeevne med minimal eller ingen menneskelig indgriben, kan forfølges for at fremme perfusion-decellulariseringsbioreaktorteknologi i fremtiden33,34.
Hovedanvendelsen af decellulariserede klapper er at tillade efterfølgende recellularisering af disse acellulære stilladser med cellepopulationer, der kan regenerere vaskulaturen. Mens meget fremtidig forskning er nødvendig for at bestemme de passende celletal, populationer, såningsstrategier og bioreaktorbetingelser for at regenerere funktionelt og levedygtigt vaskulariseret væv, repræsenterer denne protokol det oprindelige grundlæggende arbejde mod dette mål. Fremtidige metoder til recellularisering vil hjælpe med at etablere strategier til at konstruere blødt vævsflapper med et intakt perfusabelt vaskulært netværk og bidrage til potentielt at regenerere mere komplekse sammensatte væv, såsom ekstremitet og ansigts allografter. Disse stilladser kan en dag omgå donorstedets sygelighed og immunsuppression for patienter, der gennemgår storstilet bløddelsrekonstruktion, og derved forbedre deres kliniske resultater og livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
