Summary
Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.
Abstract
Grote volumeke delen defecten leiden tot functionele tekorten en kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt sterk beïnvloeden. Hoewel chirurgische reconstructie kan worden uitgevoerd met behulp van autologe vrije flaptransfer of gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA), hebben dergelijke methoden ook nadelen. Problemen zoals morbiditeit op de donorplaats en de beschikbaarheid van weefsel beperken autologe vrije flaptransfer, terwijl immunosuppressie een significante beperking van VCA is. Gemanipuleerde weefsels in reconstructieve chirurgie met behulp van decellularisatie / recellularisatiemethoden vertegenwoordigen een mogelijke oplossing. Gedecellulariseerde weefsels worden gegenereerd met behulp van methoden die native cellulair materiaal verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. Deze acellulaire steigers kunnen vervolgens worden gerecellulariseerd met ontvangerspecifieke cellen.
Dit protocol beschrijft de inkoop- en decellularisatiemethoden die worden gebruikt om acellulaire steigers in een varkensmodel te bereiken. Daarnaast geeft het ook een beschrijving van het ontwerp en de opstelling van de perfusiebioreactor. De flappen omvatten het varkensomentum, de tensor fascia lata en de radiale onderarm. Decellularisatie wordt uitgevoerd via ex vivo perfusie van natriumdodecylsulfaat (SDS) wasmiddel met lage concentratie, gevolgd door DNase-enzymbehandeling en perazijnzuursterilisatie in een aangepaste perfusiebioreactor.
Succesvolle weefseldecellularisatie wordt gekenmerkt door een wit-ondoorzichtig uiterlijk van flappen macroscopisch. Acellulaire flappen tonen de afwezigheid van kernen op histologische kleuring en een significante vermindering van het DNA-gehalte. Dit protocol kan efficiënt worden gebruikt om gedecellulariseerde weke delen steigers te genereren met geconserveerde ECM en vasculaire microarchitectuur. Dergelijke steigers kunnen worden gebruikt in latere recellularisatiestudies en hebben het potentieel voor klinische vertaling in reconstructieve chirurgie.
Introduction
Traumatisch letsel en tumorverwijdering kunnen leiden tot grote en complexe defecten van zacht weefsel. Deze defecten kunnen de kwaliteit van leven van de patiënt aantasten, functieverlies veroorzaken en leiden tot blijvende invaliditeit. Hoewel technieken zoals autologe weefselflapoverdracht vaak worden toegepast, zijn problemen met de beschikbaarheid van flappen en morbiditeit van de donorplaats belangrijke beperkingen 1,2,3. Gevasculariseerde composiet allotransplantatie (VCA) is een veelbelovend alternatief dat samengestelde weefsels, bijvoorbeeld spieren, huid, vasculatuur, als een enkele eenheid overdraagt aan ontvangers. VCA vereist echter langdurige immunosuppressie, wat leidt tot geneesmiddeltoxiciteit, opportunistische infecties en maligniteiten 4,5,6.
Tissue-engineered acellulaire steigers zijn een mogelijke oplossing voor deze beperkingen7. Acellulaire weefselsteigers kunnen worden verkregen met behulp van decellularisatiemethoden, die cellulair materiaal uit inheemse weefsels verwijderen met behoud van de onderliggende extracellulaire matrix (ECM) microarchitectuur. In tegenstelling tot het gebruik van synthetische materialen in tissue engineering, biedt het gebruik van biologisch afgeleide steigers een biomimetisch ECM-substraat dat biocompatibiliteit en het potentieel voor klinische vertaling mogelijk maakt8. Na decellularisatie kan de daaropvolgende recellularisatie van scaffolds met ontvangerspecifieke cellen vervolgens functionele, gevasculariseerde weefsels genereren met weinig tot geen immunogeniciteit 9,10,11. Door een effectief protocol te ontwikkelen om acellulaire weefsels te verkrijgen met behulp van perfusie-decellularisatietechnieken, kan een breed scala aan weefseltypen worden gemanipuleerd. Op zijn beurt maakt het voortbouwen op deze techniek de toepassing op complexere weefsels mogelijk. Tot op heden is perfusie-decellularisatie van gevasculariseerde zachte weefsels onderzocht met behulp van eenvoudige gevasculariseerde weefsels zoals een fasciocutane flap van volledige dikte bij knaagdier12, varkens13 en menselijke modellen14, evenals varkens rectus abdominis skeletspieren15. Bovendien zijn complexe gevasculariseerde weefsels ook perfusie gedecellulariseerd, zoals aangetoond in varkens- enmensenoormodellen 16,17 en menselijke full-face transplantaatmodellen18.
Hier beschrijft het protocol de decellularisatie van gevasculariseerde vrije flappen met behulp van biologisch afgeleide ECM-steigers. We presenteren de decellularisatie van drie klinisch relevante flappen: 1) het omentum, 2) de tensor fascia lata en 3) de radiale onderarm, die allemaal representatief zijn voor werkpaardflappen die routinematig worden gebruikt in reconstructieve chirurgie en niet eerder zijn onderzocht in dierstudies in de context van weefseldecellularisatie. Deze bio-technische flappen bieden een veelzijdig en direct beschikbaar platform dat het potentieel heeft voor klinische toepassingen voor gebruik op het gebied van reparatie en reconstructie van grote weke delendefecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dierenonderwerpen zijn goedgekeurd door het University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en worden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol en de procedures van het University Health Network Animal Resource Centre en de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. Vijf Yorkshire-varkens (35-50 kg; leeftijd ongeveer 12 weken oud) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Fabricage van perfusiebioreactoren
- Zie figuur 1 voor alle componenten die in de perfusiebioreactor worden gebruikt. Gebruik voor de fabricage van de weefselkamer in de handel verkrijgbare polypropyleen snap-lock containers met waterdichte en luchtdichte deksels met een siliconen afdichtingsvoering. Zorg ervoor dat de containers compatibel zijn met de autoclaaf.
- Boor twee 1/4 in gaten langs de zijkanten van de container en rijg een kort segment van L / S-16 platina-gecoate siliconenbuizen. Eén buis draagt het instroomperfusaat en de andere is voor de uitstroom.
- Bevestig voor de instroombuis een mannelijke Luer-connector aan het interne gedeelte dat zal worden gebruikt om verbinding te maken met de weefselcanule. Bevestig een vrouwelijke Luer-connector aan het externe uiteinde van de instroombuis die zal worden gebruikt om verbinding te maken met een driewegstopkraan.
- Boor een enkel gat van 1/4 op het deksel van de kamer en rijg een ander kort segment van L / S-16 platina-gecoate siliconenbuizen. Deze buis zal dienen als de luchtrooster.
- Maak de in- en uitstroombuizen door ongeveer 50 cm L/S-16 platina-gecoate siliconenbuizen te meten. Sluit het ene uiteinde aan op een gele driestops pompbuis en het andere uiteinde op een steriele serologische pipet van 2 ml om perfusaat van de reinigingsmiddelreservoirs naar de bioreactorkamer te brengen.
- Autoclaaf alle componenten (kamer en buis) in individueel verpakte steriele verpakkingen.
Figuur 1: Fabricage van de perfusiebioreactor. De perfusiebioreactor bestaat uit (A) een kunststof polypropyleen weefselkamer (B) met zijgaten geboord om perfusiebuizen met lucht- en waterdicht deksel te huisvesten. (C) Stopkranen worden aan buizen bevestigd om de perfusiebuis mogelijk te maken die decellularisatiemiddelen uit het detergentreservoir naar afval brengt op een single-pass manier. (D) Compatibele pompcassettes worden gebruikt om de driestopslang aan te sluiten op de peristaltische pomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bereiding van decellularisatieoplossingen
- Bereid gehepariniseerde normale zoutoplossing (15 IE/ml) door 1,5 ml 1000 I.U./ml heparinebouillonoplossing te verdunnen in 100 ml normale zoutoplossing.
- Bereid 0,05% w/v natriumdodecylsulfaat (SDS)-oplossing door langzaam 9 g SDS-poeder toe te voegen aan 18 l geautoclaveerd gedestilleerd gedeïoniseerd water. Gebruik een groot volume polypropyleen (PP) carboy om de SDS-oplossing te huisvesten. De oplossing is klaar voor gebruik wanneer deze volledig is opgelost. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid DNase I werkoplossing voor. Reconstitueer eerst gelyofiliseerde DNase I tot een voorraadconcentratie van 10 mg/ml met 5 mM CaCl2 in steriel dH2O. Bewaar de gereconstitueerde DNase I-oplossing als aliquots in een vriezer van −20 °C totdat deze klaar is voor gebruik. Verdun op de dag van gebruik DNase I stock 1:100 met Mg++(1,29 mM) en Ca++(1,98 mM) in steriele dH2O tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml.
OPMERKING: DNase-activiteit zal afnemen, tenzij bevroren opgeslagen. Alleen vers werkende DNase-oplossing mag worden gebruikt voor de enzymatische vertering van DNA bij kamertemperatuur. - Bereid 1x PBS-oplossing door 10x PBS-voorraad 1:10 te verdunnen met steriel geautoclaveerd water in een 5 L eindvolume in een PP-carboy. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid 1% antibiotica/antimycotica (A/A) in PBS. Verdun 100x antibiotica/antimycotica 1:100 met steriele 1x PBS oplossing tot een eindvolume van 1 L. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid 0,1% (v/v) perazijnzuur (PAA)/4% (v/v) ethanol (EtOH) door toevoeging van 3,13 ml PAA + 40 ml 100 % ethanol + 956 ml steriele dH2O. Breng het uiteindelijke volume op 1.000 ml en bewaar het bij kamertemperatuur.
3. Aankoop van varkensflappen
OPMERKING: Dit is een terminale procedure. Eén varken werd gebruikt om alle drie de flappen te kopen. Humane euthanaseer het dier na het verkrijgen van alle flappen.
- Preoperatieve zorg
- Snelle varkens ten minste 12 uur voorafgaand aan de operatie. Verdoof de dieren met ketamine (20 mg/kg intramusculair, IM), atropine (0,04 mg/kg IM) en midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Anesthesie induceren door inhalatie van 5% isofluraan door een masker met een stroomsnelheid van 22-44 ml / kg / min voor perifere lijninbrenging en intubatie. Onderhoud anesthesie met 0,5% -2% isofluraan bij 22-44 ml / kg / min. Zorg voor een voldoende diepte van de anesthesie door de hemodynamische stabiliteit te controleren en noteer afwezige palpebrale / pedaalonttrekkingsreflexen of kaakspiertonus om een geschikt niveau van toegediende anestheticum aan te geven. Intraveneuze remifentanil (10-20 μg/kg/h) continue infusie toe tijdens de operatie voor analgesie.
- Intubeer het varken met een geschikte endotracheale buis (7-8 mm) en sluit de buis aan op een ventilatorset met een getijdenvolume van 8 ml / kg, PEEP van 5 cm H20, FiO2 van 0,5 en ademhalingsfrequentie van 14.
- Breng een angiokatheter van 22 G in de oorader. Zodra intraveneuze (IV) toegang is verkregen, injecteert u gedurende de hele procedure een warme 0,9% normale zoutoplossing bij 5-10 ml / kg / h om de gemiddelde arteriële druk tussen 60 mmHg en 90 mmHg te behouden.
- Controleer continu de hartslag, pulsoximetrie enco-2 van het eindgetijden. Beoordeel de bloeddruk en lichaamstemperatuur elke 5 min.
- Breng oogzalf aan om oculaire droogheid te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Bereid het hele chirurgische veld voor met povidon-jodium. Drapeer het chirurgische veld met steriele handdoeken.
- Omental flap
- Plaats het varken in rugligging en voer een xypho-navelstreng laparotomie uit.
- Bij het betreden van de buik, mobiliseer de maagcephalad om het grotere omentum te visualiseren. Plaats het omentum voorzichtig in het operatieveld en identificeer de gastro-epiploïsche vaten die langs de grotere kromming van de maag lopen (figuur 2A).
- Begin bij het linker aspect van de grotere kromming waar de linker gastro-epiploïsche slagader zich aansluit bij de miltslagader. Gebruik een rechte Stevens-tenotomieschaar, skelet zowel de linker gastro-epiploïsche slagader als de ader. Ligate verdeel vervolgens beide afzonderlijk met behulp van chirurgische banden of clips.
- Ga verder langs de grotere kromming van de maag van links naar rechts. Lirk en verdeel de korte vaattakken die voortkomen uit het omentum dat de grotere kromming van de maag levert. Zorg ervoor dat u de belangrijkste gastro-epiploïsche pedikel van het omentum tijdens deze stap niet verwondt.
- Ga door met de mobilisatie van het grotere omentum totdat de kruising van de rechter gastro-epiploïsche vaten en de gastroduodenale slagader wordt aangetroffen. Verdeel met clips of banden vervolgens de juiste gastro-epiploïsche slagader en aderen afzonderlijk om de omentale flap te bevrijden.
- Eenmaal bevrijd, kan het omentum langs het midden in twee helften worden verdeeld, waarbij elke helft vergezeld gaat van een respectieve gastro-epiploïsche slagader en ader. Dit maakt de aanschaf van twee omentale vrije flappen van één dierbewerking mogelijk. Individueel cannuleer de gastro-epiploïsche vaten met een canule van 20-22 G en bevestig ze vervolgens met 3-0 zijden banden.
- Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 I.U./ml) in de gastro-epiploïsche arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
- Tensor fascia lata flap
OPMERKING: Het protocol is gebaseerd op een eerdere beschrijving van de varkenstensor fascia lata flap door Haughey et al.19. Er wordt een wijziging aangebracht om alleen het fasciale gedeelte van de tensor fascia lata flap te isoleren.- Plaats het varken in de laterale decubituspositie en scheer de hele bovenste achterklep bilateraal. Bereid en drapeer met behulp van de gebruikelijke steriele procedures.
- Markeer de voorste grens van de flap met een lijn die zich uitstrekt van de anterieure superieure iliacale wervelkolom (ASIS) naar de laterale patella. De locatie van de pedikel is ongeveer 6-8 cm van de ASIS langs deze lijn.
- Markeer een parallelle achterste lijn op ongeveer 8 cm tot 10 cm van de voorste incisie langs de as van het dijbeen om de breedte van de flap op te nemen. Markeer de distale rand van de flap bij de laterale patella.
- Begin de dissectie aan de distale rand bij de patella met een scherpe incisie van de huid met behulp van een scalpel. Verdiep de huidincisie met cautery door het onderhuidse weefsel totdat de fascia boven de rectus femoris wordt aangetroffen.
- Ga door met de huidincisies in de richting van de ASIS langs de gemarkeerde voorste en achterste grenzen zoals hierboven beschreven. Om alleen de fasciale flap te isoleren, verwijdert u de bovenliggende huidcomponent uit de onderliggende fasciale laag. Ligate of cauteriseer kleine perforatorvaten op de huid.
- Keer terug naar de distale rand van de flap en snijd de diepe fascia in om mobilisatie van de onderliggende vastus lateralis-spier mogelijk te maken. Mobiliseer de fascia naar de ASIS.
- Identificeer tijdens de mobilisatie de vasculaire pedikel die ontstaat tussen de spieren vastus lateralis en rectus femoris (figuur 2B). Zorg ervoor dat u overmatige tractie vermijdt om de pedikelvaten niet te verwonden.
- Dissecteer het proximale aspect van de ASIS terwijl u de vasculaire pedikel beschermt. Ontleed totdat de flap voldoende gemobiliseerd is over zijn steel.
- Volg de pedikel naar de diepe femorale vaten. Skeletiseer zowel de laterale circumflexe femorale slagader als de ader die de fasciale flap levert. Ligate verdeel vervolgens beide vaten proximaal waar ze zich bij de diepe femorale vaten voegen.
- Cannuleer de pedikelvaten individueel met 20 G tot 24 G angiokatheters, beveiligd met 3-0 zijden banden. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 I.U./ml) in de flap arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
- Radiale onderarmklep
OPMERKING: Het onderstaande protocol is gebaseerd op een gepubliceerde beschrijving van het radiale onderarmflapmodel van varkens door Khachatryan et al.20.- Plaats het varken op de operatietafel in de laterale decubituspositie. Plaats de afhankelijke voorpoot binnen het operatieveld.
- Markeer een huidflap van ongeveer 3 cm x 3 cm op de radiale onderarm. Teken een lijn tussen het middelpunt van de proximale flapmarge en de antecubitale fossa om het geschatte verloop van de radiale slagader pedikel aan te geven. Bevestig het arteriële beloop met palpatie.
OPMERKING: In het varkensmodel bevinden de radiale vaten zich relatief dieper dan bij mensen. Hun locatie is tussen de flexor carpi radialis en brachioradialis. - Snijd de huid in met behulp van een scalpel op het distale aspect met een diepte tot aan de antebrachiale fascia. Stompe dissectie met tenotomieschaar totdat de distale radiale slagader en de twee venae comitantes worden aangetroffen. Ligaat de slagader en aderen met chirurgische banden afzonderlijk en verdeel.
- Ga door met de huidincisies op de radiale en ulnaire randen van het gemarkeerde huidplein. Mobiliseer de flap van het onderliggende radiale bot met een chirurgisch mes dat van een radiale naar ulnaire richting gaat, terwijl ook de huidflap proximaal naar de antecubitale fossa wordt verhoogd.
OPMERKING: Onderhoud een subfasciaal dissectievlak om ervoor te zorgen dat de radiale slagader pedikel geassocieerd blijft met de bovenliggende huidlaag. - Trek in de proximale marge de ruimte tussen de brachioradialis en flexor carpi radialis in met een zelfklevend retractor om de proximale radiale slagader en de venae-comitantes bloot te leggen (figuur 2C).
- Gebruik een tenotomieschaar, skelet de radiale slagader en venae comitantes proximaal bij de antecubitale fossa waar ze respectievelijk de brachiale slagader en aderen verbinden. Ontleed de vaten van de omliggende fibrofatty weefsels om een voldoende pedikellengte van ongeveer 5-6 cm te bereiken. Ligaat en verdeel de slagader en venae afzonderlijk om de radiale onderarmklep vrij te maken.
- Cannuleer de pedikelvaten met 20 G tot 24 G angiokatheters, beveiligd met 3-0 zijden banden. Spoel gehepariniseerde zoutoplossing (15 IE/ml) in de flap arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen.
- Houd na het verkrijgen van de flappen de kleppen in koude zoutoplossing bij 4 °C totdat ze klaar zijn voor decellularisatie. Onder diepe isofluraan anesthesie, euthanaseer de dieren met een intraveneuze injectie van kaliumchloride (100 mg / kg IV). Bevestig de dood door de afwezigheid van vitale functies.
Figuur 2: Verkrijging van drie gevasculariseerde flappen van varkens. (A) Omentum. De rechter (i) en linker (ii) gastro-epiploïsche slagaders zijn gecannuleerd in de omentale flap (iii). (B) Tensor fascia lata. De pedikel van de flap (iv) is de opgaande tak van de laterale femorale circumflexe slagader (v). (C) Radiale onderarmklep. De verkrijging van de radiale onderarmflap (vi) is gebaseerd op de radiale slagader en de vena comitantes (vii) als de vasculaire pedikel (OPMERKING: Gordijnen werden weggelaten voor demonstratiedoeleinden). Schaalbalken: 3 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Opzetten van het decellularisatiesysteem
- Monteer de weefselkamer met flappen onder steriele omstandigheden in een laminaire flow bioveiligheidskast.
- Bevestig een driewegstopkraan aan zowel de instroom- als de uitstroompoorten van de bioreactor. Bevestig een filter van 0,2 μm aan de ventilatiepoort op het deksel van de tissuekamer. Prime de instroombuis met steriele gehepariniseerde zoutoplossing om luchtbellen te elimineren.
- Plaats de flappen in de kamer. Sluit met behulp van steriele hemostaten de flappen aan op de instroombuis met behulp van de mannelijke Luer-connector. Schroef de respectievelijke arteriële canule van elke flap op de mannelijke Luer en zorg voor een strakke afdichting.
- Spoel gehepariniseerde zoutoplossing door de stopkraan om te controleren of de Luer-verbinding zonder lekken is en of de kleppen kunnen worden doordrenkt met bewijs van veneuze uitstroom. Sluit het deksel van de tissuekamer.
- Verbind de instroombuis met een gele driestops pompslang met de instroomstop van de weefselkamer. Bevestig ook een inline druksensortransducer aan de instroom driewegstopkraan om perfusiedrukbewaking mogelijk te maken.
- Schakel de peristaltische instroompomp in. Ga op het beginscherm naar het derde tabblad met behulp van de pijltoets om de buis-ID in te stellen op 1,85 mm. Ga vervolgens naar het tweede tabblad om de perfusiesnelheid in te stellen. Invoersnelheid als leveringswijze en ingesteld op 2 ml/min. Zorg ervoor dat de stroomrichting correct is zoals weergegeven op het scherm. Laad de driestops pompslang naar de peristaltische pomp met een compatibele cassette.
- Herhaal de procedure voor de peristaltische pomp met uitstroom, vergelijkbaar met hierboven. Stel de instelling van de uitstroompomp in op 4 ml/min. Verbind de uitstroombuis met een gele driestops pompslang met de uitstroomstop van de weefselkamer. Laad de driestops pompslang naar de peristaltische pomp met een compatibele cassette. Start de stroom voor beide pompen door op de aan /uit-knop te drukken.
OPMERKING: De hogere snelheid van de uitstroompomp is een cruciale veiligheidsmaatregel om overloop van de weefselkamer te voorkomen, zodat de uitstroom van de kamer altijd groter is dan de instroom tijdens de decellularisatie. De volledige geassembleerde decellularisatie-opstelling is weergegeven in figuur 3.
Figuur 3: Geassembleerd perfusie-decellularisatiesysteem. (A) Schematische weergave van het perfusiedecellularisatiesysteem. De instroombuis voert perfusaat van het reinigingsmiddelreservoir in de weefselkamer op een single-pass manier met druksensorbewaking. De uitstroombuis verwijdert perfusaat actief uit de weefselkamer in de afvalcontainer. Zwarte pijlen geven de richting van de perfusiestroom aan. Een peristaltische pomp wordt gebruikt met de linkerpomp om de instroom te regelen. De uitstroom wordt actief verwijderd met behulp van een tweede peristaltische pomp door de respectieve buizen. Figuur gemaakt met BioRender.com. (B) Foto van het perfusie-decellularisatiesysteem dat op de benchtop is geassembleerd met de instroomperistaltische pomp (i) aangesloten op de weefselkamers (ii) en vervolgens de uitstroom peristaltische pomp (iii). De instroomperfusaatdruk wordt bewaakt met een in-line druksensor (iv) voordat de weefselkamer wordt betreden. Hier worden drie flappen parallel gedecellulariseerd. Zowel de wasmiddel- als de afvalreservoirs bevinden zich onder de bovenkant en zijn niet gefotografeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Decellularisatie van varkensflappen
- Voer alle volgende stappen uit voor perfusie-decellularisatie bij kamertemperatuur. Voor een overzicht van de perfusiepercentages en -duur, zie tabel 1. Begin met de perfusie van heparinized zoutoplossing bij 2 ml / min met behulp van een peristaltische pomp en perfuseer de flappen met heparinized zoutoplossing in de weefselkamer gedurende 15 minuten om eventuele achtergebleven bloedstolsels te verwijderen.
- Na voltooiing van heparinized zoutoplossing perfusie, aspirateer resterende zoutoplossing in de weefselkamer. Vul de weefselkamer met ongeveer 500 ml SDS-decellularisatieoplossing om de flap voldoende onder te dompelen.
- Breng de instroomslang over naar de SDS-decellularisatieoplossing en perfuseer het weefsel met 2 ml / min. De duur van de perfusie varieert afhankelijk van de flap; perfuseer SDS gedurende 2 dagen voor omentum, 3 dagen voor tensor fascia en 5 dagen voor radiale onderarm fascio-cutane flap.
- Na voltooiing van de SDS-decellularisatie, aspirateer het bestaande SDS-perfusaat in de weefselkamer. Breng de instroomslang over in 1x PBS-oplossing en laat de flappen gedurende 1 dag op 2 ml / min perfuseren.
- Verwijder de vorige PBS-oplossing en breng de instroombuis over in de DNase-werkoplossing. Perfuseer gedurende 2 uur bij 2 ml/min. Verwijder de DNase-oplossing uit de weefselkamer en plaats de instroomslang in 1x PBS-oplossing. Dompel de weefsels onder met 1x PBS-oplossing in de kamer en perfuseer 1x PBS-oplossing gedurende 1 dag op 2 ml / min.
- Steriliseer de flappen met PAA/EtOH oplossing. Breng de instroomslang over in PAA/EtOH in dH2O-oplossing en dompel de weefsels onder in dezelfde oplossing. Perfuseer PAA/EtOH op 2 ml/min gedurende 3 uur. Zodra de PAA/EtOH-sterilisatie is voltooid, koppelt u de slang los van de driewegstoppunten.
- Verwijder de flappen met behulp van een aseptische techniek en plaats de steriele instrumenten in PBS met 1% antibiotica/antimycotica (A/A). Dompel de flappen met PBS + 1% A/A gedurende 15 minuten onder in twee afzonderlijke wasbeurten om restzuur volledig te neutraliseren. Houd de flappen in PBS + 1% A/A op 4 °C totdat ze klaar zijn voor recellularisatie.
- Controleer de steriliteit van de steigers door een wattenstaafje op agarplaten uit te voeren en onderzoek op microbiële groei. Ent agarplaten in met wattenstaafjes van elk flapoppervlak. Kweek de agarplaten op 37 °C gedurende maximaal 2 weken. Steriliteit wordt aangetoond door de afwezigheid van microbiële koloniegroei.
Tabel 1: Samenvatting van de protocolparameters voor perfusie-decellularisatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
6. Evaluatie van decellularisatie
- Met behulp van een ponsbiopsie, verkrijg monsters van 3 mm tot 10 mm dik uit de flappen.
- Voor histologie, fixeer biopsieën in histologische cassettes in normaal gebufferd formaline gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
- Was de biopsiecassettes gedurende 15 minuten in water of PBS en plaats ze vervolgens in 70% ethanol totdat ze klaar zijn voor weefselverwerking. Verwerk de cassettes in een tissue processor volgens standaard protocollen.
- Integreer de biopten in paraffine, zodat de was gedurende 10-15 minuten op een koude plaat stolt. Sectieparaffineblokken op een microtoom tot een dikte van 5 μm. Beits de dia's met hematoxyline en eosine (H&E) volgens standaardprotocollen. Beeld de weefseldia's af met lichtmicroscopie.
- Voor de kwantificering van het DNA-gehalte moet het drooggewicht van de weefselbiopten worden verkregen na een nachtdroging van het weefsel in een oven bij 60 °C. Verwerk de monsters in een papaïne-extractiebuffer bij 65 °C 's nachts. Centrifugeer de verteerde monsters bij 10.000 x g en breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis. Test het DNA-gehalte met een commerciële DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol voor het decellulariseren van gevasculariseerde varkensflappen is afhankelijk van de perfusie van een ionische wasmiddel, SDS, door de flap vasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor. Voorafgaand aan de decellularisatie werden drie gevasculariseerde flappen in een varkensmodel verkregen en gecannuleerd volgens hun belangrijkste aanvoervaten. De flappen werden onmiddellijk na aankoop gespoeld om een gepatenteerde, doorlaatbare vasculatuur te behouden om succesvolle decellularisatie mogelijk te maken. Met behulp van luchtdichte snap-dekselcontainers werd een aangepaste bioreactor ontworpen om flapperfusie in een afgesloten omgeving mogelijk te maken. Perfusie van flappen in de bioreactor werd bereikt op een single-pass manier met behulp van twee peristaltische pompen verbonden met de weefselkamer. De perfusiedruk werd bewaakt met een in-line druksensor.
Tijdens decellularisatie was de duur van de blootstelling aan SDS afhankelijk van het type weefsel dat werd verwerkt. Met de beschreven perfusie-decellularisatietechniek werden het omentum, de tensor fascia en de radiale onderarmflappen gedecellulariseerd met 0,05% SDS gedurende respectievelijk 2 dagen, 3 dagen en 5 dagen. Succesvolle sterilisatie na decellularisatie werd aangetoond door de afwezigheid van microbiële koloniegroei na het afvegen van de flappen en het kweken van de swabs op agarplaten gedurende 14 dagen. Perfusiedrukken werden gecontroleerd met een debiet van 2 ml / min en varieerden tussen 20-60 mmHg tijdens alle stadia van decellularisatie voor alle drie de flappen. Na afloop van de decellularisatie werden de flappen onder handmatige controle gespoeld en bewijs aangetoond van uitstroom uit een veneuze canule die was achtergelaten om vrije drainage te maken (aanvullende video 1, aanvullende video 2, aanvullende video 3).
In totaal werden 15 flappen gedecellulariseerd, met vijf replicaties voor elk van de drie weefseltypen. Bij onderzoek leek de grove morfologie van inheemse weefsels roze gekleurd (figuur 4A, E, I), terwijl gedecellulariseerde weefsels kenmerkend wit / ondoorzichtig van uiterlijk waren (figuur 4C, G, K). Histologisch onderzoek van inheemse weefsels met H&E toont de aanwezigheid van blauwe kernen (figuur 4B, F, J). In gedecellulariseerde flappen vertoonde H &E-kleuring een verlies van cellulair materiaal met de afwezigheid van blauwe nucleaire kleuring (figuur 4D, H, L), wat wijst op een acellulair weefselsteiger. Aanvullende kwantificering van het DNA-gehalte in de vijf replicaties toonde een statistisch significante afname van DNA in de acellulaire steigers in vergelijking met inheemse weefsels door de t-test van een student voor elke flap (figuur 5). In het omentum daalde het DNA van 460 ng/mg ± 124 ng/mg droog weefsel in de inheemse flap tot 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg droog weefsel in de gedecellulariseerde flap (n = 5, p < 0,05). In de tensor fascia lata daalde het DNA van 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg tot 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg tussen respectievelijk inheemse en gedecellulariseerde flappen (n = 5, p < 0,05). De radiale onderarmklep vertoonde een DNA-afname van 1180 ng/mg ± 241 ng/mg in de inheemse flap tot 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg in de gedecellulariseerde flap (n = 5, p < 0,05).
Figuur 4: Decellularisatie van drie varkensflappen. Grof onderzoek van het (A) inheemse omentum, (E) tensor fascia lata en (I) radiale onderarmflappen toont het roze uiterlijk van de flappen onmiddellijk na aankoop aan. De histologische kleuring van inheemse weefsels toont duidelijke hematoxylinekleuring van cellulaire kernen met H &E (B, F, J). Na decellularisatie lijken het (C) omentum, (G) tensor fascia lata en (K) radiale onderarm grof wit en ondoorzichtig. Histologisch vertonen de drie gedecellulariseerde flappen een afwezigheid van nucleaire kleuring met H &E (D, H, L). Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van dna-gehalte in acellulaire steigers. Waarden worden genormaliseerd tot mg droge steigermassa. Verse weefselmonsters van inheemse, niet-gedecellulariseerde weefsels (n = 5) en gedecellulariseerde weefsels (n = 5) werden gedroogd en gewogen vóór de nachtelijke vertering in papaïne voorafgaand aan kwantificering. Statistische tests gebruikten de t-tests van studenten met een significant (**) niveau gedefinieerd als een p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1. Tijdsverlooponderzoek van de progressie van perfusie-decellularisatie van omentum met behulp van 0,05% natriumdodecylsulfaat gedurende 5 dagen door middel van grof onderzoek (schaalstaven = 3 cm) en H &E-histologie (schaalstaven = 200 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2. Tijdsverlooponderzoek van de progressie van perfusie-decellularisatie van tensor fascia lata met behulp van 0,05% natriumdodecylsulfaat gedurende 5 dagen door grof onderzoek (schaalstaven = 3 cm) en H &E-histologie (schaalstaven = 200 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3. Tijdsverlooponderzoek van de progressie van perfusie-decellularisatie van radiale onderarmflap met behulp van 0,05% natriumdodecylsulfaat gedurende 5 dagen door middel van grof onderzoek (schaalstaven = 3 cm) en H &E-histologie (schaalstaven = 200 μm). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1. Representatieve handmatige perfusie van de gedecellulariseerde omentumflap via de arteriële canule (roze) die uitstroom uit de vrij drainerende veneuze canule (geel) aantoont. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2. Representatieve handmatige perfusie van de gedecellulariseerde tensor fascia lata flap via de arteriële canule (roze) die uitstroom aantoont van de vrij drainerende veneuze canule (blauw). Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 3. Representatieve handmatige perfusie van de gedecellulariseerde radiale onderarmklep via de arteriële canule (blauw) die uitstroom aantoont uit de vrij drainerende veneuze canule (geel). Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voorgestelde protocol maakt gebruik van de perfusie van SDS met lage concentratie om een reeks van varkens afgeleide flappen te decellulariseren. Met deze procedure kunnen acellulair omentum, tensor fascia lata en radiale onderarmflappen met succes worden gedecellulariseerd met behulp van een protocol dat SDS met lage concentratie bevordert. Voorlopige optimalisatie-experimenten hebben vastgesteld dat SDS bij een lage concentratie (0,05%) tussen 2 dagen tot 5 dagen in staat is om cellulair materiaal voor het omentum, de tensor fascia lata en de radiale onderarmklep te verwijderen wanneer geanalyseerd met histologische technieken (aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 3). Deze methode biedt een eenvoudige aanpak die decellularisatie binnen een kort tijdsbestek en tegen een redelijke prijs bereikt. In onze ervaring duurt de decellularisatie en sterilisatie van varkensflappen tussen 2-5 dagen, met langere duur decellularisatie nodig voor weefsels met een grotere dichtheid (bijv. Onderarmhuid na 5 dagen versus omentum na 2 dagen). Bovendien werd de lage concentratie SDS die in dit protocol wordt gebruikt, geselecteerd op basis van de redenering dat een lage concentratie SDS bij 0,05% onder de kritische micellaire concentratie van SDS valt (ongeveer bij 0,2% 21) en dus de oppervlakteactieve stof in staat stelt om celmembranen effectief op te lossen terwijl belangrijke bioactieve ECM-componenten intact blijven. Het gebruik van SDS met een lage concentratie in dit protocol staat in contrast met het gebruik van relatief hogere concentraties SDS (bijv. 1%) voor perfusie-decellularisatie van gevasculariseerde fascio-cutane flappen zoals gerapporteerd door eerdere auteurs 13,22. Hoge concentraties SDS, hoewel effectief bij decellularisatie, gaan ten koste van schadelijke effecten op de ECM-steiger, zoals GAG en uitputting van groeifactoren, evenals de denaturatie van eiwitten zoals collageen en vimentine23,24. Toekomstig werk in de perfusie-decellularisatie van gevasculariseerde flaps van varkens zal inderdaad baat hebben bij aanvullende karakteriseringsstudies om de effecten van het decellularisatiemiddel op de ECM op structureel en moleculair niveau en hun implicaties voor downstream recellularisatie te onderzoeken 25,26,27 . Assays voor ECM-componenten zoals collageen, elastine of GAG-gehalte kunnen worden gebruikt om veranderingen in de ECM na decellularisatie kwantitatief te beoordelen. Bovendien is het testen van de mechanische sterkte een nuttige modaliteit om veranderingen in de biomechanische eigenschappen na decellularisatie te bestuderen. Ten slotte zal de beoordeling van de vasculariteit met behulp van technieken zoals angiografie of microCT-scanning ook helpen om de vasculaire architectuur op systemisch niveau te karakteriseren als een vereiste voor het genereren van perfuseerbare gevasculariseerde flappen28.
Bij dit protocol moeten verschillende technische overwegingen worden opgemerkt. Ten eerste moet uiterste voorzichtigheid worden betracht tijdens het hanteren van kleppen en de assemblage van bioreactoren om accidentele decannulatie te voorkomen, aangezien recannulatie in een ex vivo-omgeving relatief moeilijker is. Ten tweede, tijdens flap-inkoop, is het verkrijgen van een intacte flap met een perfuseerbare en intacte vasculaire pedikel van cruciaal belang voor succesvolle decellularisatie. Er moet tijdens de aanschaf voor worden gezorgd dat distale lekpunten in de steiger worden geknipt of met de hand worden vastgebonden. Dit zal helpen bij het verminderen van lekkage, die onvolledige perfusie van oplossingen door de flap vasculatuur kan veroorzaken. Een eerste periode van perfusie met heparinized zoutoplossing na verkrijging voorkomt het vasthouden van bloedstolsels en verifieert een perfuseerbare vasculatuur zoals blijkt uit de uitstroom van veneus perfusaat. Gedecelluliseerde weefsels kunnen ook opnieuw worden gespoeld na voltooiing van de decellularisatie om te controleren op mogelijke intravasculaire obstructies (bijvoorbeeld van celresten / luchtembolieën) die flapperfuseerbaarheid kunnen uitsluiten. In onze ervaring vertoonden gedecellulariseerde flappen geen intravasculaire weerstand tegen spuitspoeling volgens dit protocol, terwijl veneuze uitstroom opnieuw kon worden waargenomen vanuit de gedecellulariseerde flap na het spoelen (Aanvullende Video 1, Aanvullende Video 2, Aanvullende Video 3). Dit was indicatief voor een gepatenteerde arteriële tot veneuze vasculaire lus met verbindende haarvaten die kunnen worden doordrenkt.
Een andere overweging wordt gemaakt met betrekking tot de perfusieparameters tijdens decellularisatie. In dit protocol werd een perfusie met een constant debiet gekozen met een streefdebiet van 2 ml/min, wat binnen het bereik lag van de operationele stroomsnelheden die werden gebruikt in eerder gepubliceerde decellularisatiestudies van varkensflapweefsels13,29. Bovendien bevat ons decellularisatiesysteem een real-time in-line drukbewakingsmogelijkheid om potentiële fluctuaties in intravasculaire weerstand in de loop van perfusie te volgen; deze methode kan helpen bij het voorkomen van hoge perfusiedrukken als gevolg van mogelijke intravasculaire occlusie die de microvasculaire ECU kan beschadigen.
Ten slotte is sterilisatie van de resulterende steiger een andere belangrijke technische overweging. We hebben een sterilisatiefase opgenomen als de laatste stap van het decellularisatieprotocol om incidentele milieuverontreiniging aan te pakken die kan optreden tijdens decellularisatie. Flap steriliteit is vooral belangrijk, zodat flappen in de toekomst kunnen worden gebruikt voor recellularisatie. De perfusie van 0,1% perazijnzuur/4% EtOH als sterilisatiemiddel is eerder gemeld door groepen voor het steriliseren van acellulaire steigers30,31 en bleek ook effectief te zijn met dit protocol. Steriliteit werd geverifieerd door flap swab-culturen op agarplaten te onderzoeken en afwezige groei na 14 dagen incubatie op te merken.
De aangepaste perfusiebioreactor die is ontworpen voor de experimenten is relatief kosteneffectief, eenvoudig en snel te monteren. Bovendien zijn alle componenten van deze perfusiebioreactor autoclaveerbaar en aanpasbaar voor recellularisatiewerk met behoud van de steriliteit van de flappen. Het aangepaste bioreactorcircuit kan eenvoudig worden aangepast om open circuitperfusie mogelijk te maken die celkweekmedia kan laten circuleren door een gerecelluliseerde steiger na celzaaiexperimenten. Toch zijn enkele beperkingen van het bioreactorsysteem het vermelden waard. Ten eerste doet het gebruik van twee commerciële pompen, hoewel noodzakelijk om onbedoelde overloop van het systeem te voorkomen, vooral wanneer grote volumes perfusaat worden gebruikt, afbreuk aan de anders lage kosten van de perfusieopstelling. Bovendien kan de lage doorvoer van het huidige perfusiebioreactorsysteem logistieke uitdagingen opleveren wanneer tal van experimentele replicaties parallel moeten worden uitgevoerd; relatief hogere doorvoersystemen die zijn ontwikkeld voor nierdecellularisatievan varkens 32 kunnen op een dag worden aangepast voor decellularisatie van varkensflapen om deze logistieke uitdagingen te verlichten. Ten slotte, hoewel de ontwikkelde bioreactor eenvoudig in te stellen is, zijn menselijk toezicht en handmatige bediening nog steeds regelmatig en vaak nodig om ervoor te zorgen dat er geen storing van het systeem optreedt. Aanpassingen aan de bioreactor met automatiseringsmogelijkheden die zowel de prestaties van de bioreactor kunnen bewaken als aanpassen met minimale of geen menselijke tussenkomst, kunnen worden nagestreefd om de perfusie-decellularisatiebioreactortechnologie in de toekomst te bevorderen33,34.
De belangrijkste toepassing van gedecellulariseerde flappen is om de daaropvolgende recellularisatie van deze acellulaire scaffolds mogelijk te maken met celpopulaties die de vasculatuur kunnen regenereren. Hoewel veel toekomstig onderzoek nodig is om de juiste celaantallen, populaties, zaaistrategieën en bioreactorcondities te bepalen om functioneel en levensvatbaar gevasculariseerd weefsel te regenereren, vertegenwoordigt dit protocol het eerste fundamentele werk in de richting van dit doel. Toekomstige methoden van recellularisatie zullen helpen bij het vaststellen van strategieën om zachte weefselflappen te ontwikkelen met een intact perfuseerbaar vasculair netwerk en bijdragen aan het mogelijk regenereren van complexere samengestelde weefsels, zoals extremiteit en gezichts allografts. Deze scaffolds kunnen op een dag de morbiditeit en immunosuppressie van de donorplaats omzeilen voor patiënten die grootschalige reconstructie van zacht weefsel ondergaan, waardoor hun klinische resultaten en kwaliteit van leven worden verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
