Summary
Le protocole décrit l’obtention chirurgicale et la décellularisation ultérieure des lambeaux porcins vascularisés par perfusion du détergent au dodécylsulfate de sodium à travers le système vasculaire du lambeau dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.
Abstract
Les défauts des tissus mous de grand volume entraînent des déficits fonctionnels et peuvent avoir un impact considérable sur la qualité de vie du patient. Bien que la reconstruction chirurgicale puisse être réalisée par transfert de lambeau libre autologue ou allotransplantation composite vascularisée (AVC), de telles méthodes présentent également des inconvénients. Des problèmes tels que la morbidité sur le site donneur et la disponibilité des tissus limitent le transfert de lambeau libre autologue, tandis que l’immunosuppression est une limitation importante de l’ACV. Les tissus modifiés en chirurgie reconstructive utilisant des méthodes de décellularisation / recellularisation représentent une solution possible. Les tissus décellularisés sont générés à l’aide de méthodes qui éliminent le matériel cellulaire natif tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Ces échafaudages acellulaires peuvent ensuite être recellularisés avec des cellules spécifiques au receveur.
Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement et de décellularisation utilisées pour réaliser des échafaudages acellulaires dans un modèle porcin. En outre, il fournit également une description de la conception et de la configuration du bioréacteur de perfusion. Les lambeaux comprennent l’épiploon porcin, le fascia lata tenseur et l’avant-bras radial. La décellularisation est réalisée par perfusion ex vivo de détergent à faible concentration de dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie d’un traitement enzymatique par la DNase et d’une stérilisation à l’acide peracétique dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.
Une décellularisation tissulaire réussie se caractérise par un aspect blanc-opaque des lambeaux macroscopiquement. Les lambeaux acellulaires montrent l’absence de noyaux sur la coloration histologique et une réduction significative de la teneur en ADN. Ce protocole peut être utilisé efficacement pour générer des échafaudages de tissus mous décellularisés avec une ECM préservée et une microarchitecture vasculaire. De tels échafaudages peuvent être utilisés dans des études de recellularisation ultérieures et ont le potentiel d’une traduction clinique en chirurgie reconstructive.
Introduction
Les lésions traumatiques et l’ablation de la tumeur peuvent entraîner des défauts des tissus mous importants et complexes. Ces défauts peuvent nuire à la qualité de vie du patient, entraîner une perte de fonction et entraîner une invalidité permanente. Bien que des techniques telles que le transfert de lambeau de tissu autologue aient été couramment pratiquées, les problèmes liés à la disponibilité du lambeau et à la morbidité au site donneur sont des limites majeures 1,2,3. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une alternative prometteuse qui transfère les tissus composites, par exemple les muscles, la peau, le système vasculaire, en une seule unité aux receveurs. Cependant, le VCA nécessite une immunosuppression à long terme, ce qui entraîne une toxicité médicamenteuse, des infections opportunistes et des tumeurs malignes 4,5,6.
Les échafaudages acellulaires issus de l’ingénierie tissulaire sont une solution potentielle à ces limitations7. Les échafaudages de tissus acellulaires peuvent être obtenus en utilisant des méthodes de décellularisation, qui éliminent le matériel cellulaire des tissus natifs tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Contrairement à l’utilisation de matériaux synthétiques dans l’ingénierie tissulaire, l’utilisation d’échafaudages d’origine biologique offre un substrat ECM biomimétique qui permet la biocompatibilité et le potentiel de traduction clinique8. Après la décellularisation, la recellularisation subséquente d’échafaudages avec des cellules spécifiques au receveur peut alors générer des tissus vascularisés fonctionnels avec peu ou pas d’immunogénicité 9,10,11. En développant un protocole efficace pour obtenir des tissus acellulaires à l’aide de techniques de décellularisation par perfusion, un large éventail de types de tissus peut être conçu. À son tour, s’appuyer sur cette technique permet l’application à des tissus plus complexes. À ce jour, la décellularisation par perfusion des tissus mous vascularisés a été étudiée à l’aide de tissus vascularisés simples tels qu’un lambeau fasciocutané de pleine épaisseur chez le rongeur12, le porcin 13 et le modèle humain 14, ainsi que le muscle squelettique du porc droit abdominis15. De plus, des tissus vascularisés complexes ont également été décellularisés par perfusion, comme l’ont démontré les modèles d’oreille porcine et humaine 16,17 et les modèles de greffe de visage entierhumain 18.
Ici, le protocole décrit la décellularisation des lambeaux libres vascularisés à l’aide d’échafaudages ECM dérivés biologiquement. Nous présentons la décellularisation de trois lambeaux cliniquement pertinents: 1) l’épiploon, 2) le fascia lata tenseur et 3) l’avant-bras radial, qui sont tous représentatifs des lambeaux de cheval de trait utilisés couramment en chirurgie reconstructive et n’ont pas été examinés auparavant dans des études animales dans le contexte de la décellularisation tissulaire. Ces lambeaux issus de la bioingénierie offrent une plate-forme polyvalente et facilement disponible qui a le potentiel d’applications cliniques pour une utilisation dans le domaine de la réparation et de la reconstruction de grands défauts des tissus mous.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (CCIA) du Réseau universitaire de santé et sont effectuées conformément au protocole et aux procédures du Centre de ressources animales du Réseau universitaire de santé et aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Cinq porcs Yorkshire (35-50 kg; âgés d’environ 12 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.
1. Fabrication de bioréacteurs de perfusion
- Voir la figure 1 pour tous les composants utilisés dans le bioréacteur de perfusion. Pour la fabrication de la chambre à tissus, utilisez des contenants à pression en polypropylène disponibles dans le commerce avec des couvercles étanches à l’eau et à l’air contenant une doublure d’étanchéité en silicone. Assurez-vous que les conteneurs sont compatibles avec l’autoclave.
- Percez deux 1/4 dans des trous le long des côtés du récipient et enfilez un court segment de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Un tube transportera le débit entrant perfusé et l’autre est pour l’écoulement.
- Pour le tube d’entrée, fixez un connecteur Luer mâle à la partie interne qui sera utilisée pour se connecter à la canule tissulaire. Fixez un connecteur Luer femelle à l’extrémité externe du tube d’entrée qui sera utilisé pour se connecter à un robinet d’arrêt à trois voies.
- Percez un seul trou de 1/4 de pouce sur le couvercle de la chambre et enfilez un autre segment court de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Ce tube servira de bouche d’aération.
- Fabriquez le tube d’entrée et de sortie en mesurant environ 50 cm de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Raccordez une extrémité à un tube de pompe jaune à trois arrêts et l’autre extrémité à une pipette sérologique stérile de 2 mL pour transporter le perfusat des réservoirs de détergent dans la chambre du bioréacteur.
- Autoclaver tous les composants (chambre et tubes) dans un emballage stérile emballé individuellement.
Figure 1 : Fabrication du bioréacteur de perfusion. Le bioréacteur de perfusion se compose (A) d’une chambre de tissu en polypropylène en plastique (B) avec des trous latéraux percés pour accueillir des tubes de perfusion avec un couvercle étanche à l’air et à l’eau. (C) Des robinets d’arrêt sont fixés aux tubes pour permettre la fixation du tube de perfusion qui transporte les agents de décellularisation du réservoir de détergent aux déchets en un seul passage. (D) Des cassettes de pompe compatibles sont utilisées pour connecter le tube à trois arrêts à la pompe péristaltique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Préparation des solutions de décellularisation
- Préparer une solution saline normale héparinée (15 UI/mL) en diluant 1,5 mL de solution mère d’héparine à 1000 UI/mL dans 100 mL de solution saline normale.
- Préparer une solution de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,05 % p/v en ajoutant lentement 9 g de poudre de SDS à 18 L d’eau distillée-désionisée autoclavée. Utilisez une bonbonne en polypropylène (PP) de grand volume pour accueillir la solution SDS. La solution est prête à l’emploi lorsqu’elle est complètement dissoute. Conserver à température ambiante.
- Préparez la solution de travail DNase I. Tout d’abord, reconstituer la DNase I lyophilisée à une concentration mère de 10 mg/mL avec 5 mM de CaCl2 dans du dH2O stérile. Conserver la solution mère reconstituée de DNase I sous forme d’aliquotesdans un congélateur à −20 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée. Le jour de l’utilisation, diluer la DNase I avec du stock 1:100 avec Mg++ (1,29 mM) et Ca++ (1,98 mM) dans du dH2Ostérile jusqu’à une concentration finale de 0,1 mg/mL.
REMARQUE: L’activité DNase se dégrade à moins d’être stockée gelée. Seule une solution de DNase fraîche doit être utilisée pour la digestion enzymatique de l’ADN à température ambiante. - Préparer 1x solution de PBS en diluant 10x PBS stock 1:10 avec de l’eau autoclavée stérile dans un volume final de 5 L dans une bonbonne en PP. Conserver à température ambiante.
- Préparer 1% d’antibiotiques / antimycotiques (A / A) dans PBS. Diluer 100x antibiotiques/antimycotiques 1:100 avec 1x solution stérile de PBS jusqu’à un volume final de 1 L. Conserver à température ambiante.
- Préparer de l’acide peracétique (AAP) à 0,1 % (v/v)/éthanol à 4 % (v/v) (EtOH) en ajoutant 3,13 mL d’AAP + 40 mL d’éthanol à 100 % + 956 mL de dH2O stérile. Porter le volume final à 1 000 mL et conserver à température ambiante.
3. Acquisition de lambeaux porcins
Remarque : Il s’agit d’une procédure terminale. Un cochon a été utilisé pour se procurer les trois volets. Euthanasier l’animal sans cruauté après l’obtention de tous les volets.
- Soins préopératoires
- Porcs rapides au moins 12 heures avant la chirurgie. Sédater les animaux avec de la kétamine (20 mg/kg intramusculaire, IM), de l’atropine (0,04 mg/kg IM) et du midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane à 5 % à travers un masque à un débit de 22-44 mL/kg/min pour l’insertion et l’intubation du cathéter périphérique. Maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane à 0,5 % à 2 % à 22-44 mL/kg/min. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en vérifiant la stabilité hémodynamique et notez l’absence de réflexes de retrait palpébral / pédale ou de tonus musculaire de la mâchoire pour indiquer un niveau approprié d’anesthésie administrée. Administrer une perfusion intraveineuse de rémifentanil (10-20 μg/kg/h) à débit continu pendant la chirurgie de l’analgésie.
- Intuber le porc avec un tube endotrachéal approprié (7-8 mm) et connecter le tube à un ventilateur réglé à un volume courant de 8 mL/kg, PEP de 5 cm H20,FiO2 de 0,5 et fréquence respiratoire de 14.
- Insérez un cathéter d’angiocathe de 22 G dans la veine de l’oreille. Une fois l’accès intraveineux (IV) obtenu, infuser une solution saline normale chaude à 0,9 % à 5-10 mL/kg/h tout au long de la procédure pour maintenir la pression artérielle moyenne entre 60 mmHg et 90 mmHg.
- Surveillez en permanence la fréquence cardiaque, l’oxymétrie de pouls et le CO2 en fin de marée. Évaluez la pression artérielle et la température corporelle toutes les 5 minutes.
- Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie. Préparez tout le champ chirurgical avec de la povidone-iode. Drapez le champ chirurgical avec des serviettes stériles.
- Rabat omental
- Placez le porc en décubitus dorsal et effectuez une laparotomie xypho-ombilicale.
- En entrant dans l’abdomen, mobiliser la céphalade de l’estomac pour visualiser le grand épiploon. Placez soigneusement l’épiploon dans le champ opératoire et identifiez les vaisseaux gastro-épiploïques qui courent le long de la plus grande courbure de l’estomac (Figure 2A).
- Commencez par l’aspect gauche de la plus grande courbure où l’artère gastro-épiploïque gauche rejoint l’artère splénique. À l’aide de ciseaux de ténotomie Stevens droits, squelettiser à la fois l’artère gastro-épiploïque gauche et la veine. Ligate divise ensuite les deux séparément à l’aide de liens chirurgicaux ou de clips.
- Continuez le long de la plus grande courbure de l’estomac de gauche à droite. Liguer et diviser les branches vasculaires courtes provenant de l’épiploon fournissant la plus grande courbure de l’estomac. Veillez à ne pas blesser le pédicule gastro-épiploïque principal de l’épiploon au cours de cette étape.
- Poursuivre la mobilisation du grand épiploon jusqu’à la jonction des vaisseaux gastro-épiploïques droits et de l’artère gastroduodénale rencontrée. Avec des clips ou des attaches, ligaturer puis diviser l’artère gastro-épiploïque droite et les veines séparément pour libérer le lambeau omental.
- Une fois libéré, l’épiploon peut être divisé le long du milieu en deux moitiés, chaque moitié étant accompagnée d’une artère et d’une veine gastro-épiploïques respectives. Cela permet l’acquisition de deux lambeaux libres omentaux d’une exploitation animale. Canuler individuellement les vaisseaux gastro-épiploïques avec une canule de 20-22 G puis fixer avec des attaches en soie 3-0.
- Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle gastro-épiploïque jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
- Tenseur fascia lata lambeau
REMARQUE : Le protocole est basé sur une description antérieure du lambeau du fascia lata tensoriel porcin par Haughey et al.19. La modification est apportée pour isoler uniquement la partie fasciale du lambeau tenseur fascia lata.- Placez le porc en position de décubitus latéral et rasez bilatéralement tout le membre postérieur supérieur. Préparer et draper en utilisant les procédures stériles habituelles.
- Marquez la limite antérieure du lambeau avec une ligne s’étendant de l’épine iliaque supérieure antérieure (ASIS) vers la rotule latérale. L’emplacement du pédicule est à environ 6-8 cm de l’ASIS le long de cette ligne.
- Marquez une ligne postérieure parallèle à environ 8 cm à 10 cm de l’incision antérieure le long de l’axe du fémur pour inclure la largeur du lambeau. Marquez le bord distal du lambeau au niveau de la rotule latérale.
- Commencez la dissection à la marge distale à la rotule avec une incision aiguë de la peau à l’aide d’un scalpel. Approfondissez l’incision cutanée avec cautérisation à travers le tissu sous-cutané jusqu’à ce que le fascia recouvrant le fémur droit soit rencontré.
- Continuez les incisions cutanées vers le SIAS le long des limites antérieures et postérieures marquées décrites ci-dessus. Pour isoler le lambeau fascial seul, retirez le composant cutané sus-jacent de la couche fasciale sous-jacente. Liférer ou cautériser tout petit vaisseau perforateur sur la peau.
- Retournez au bord distal du lambeau et incisez le fascia profond pour permettre la mobilisation du muscle vastus lateralis sous-jacent. Mobiliser le fascia vers l’ASIS.
- Lors de la mobilisation, identifier le pédicule vasculaire émergeant entre les muscles vastus lateralis et rectus femoris (Figure 2B). Prenez soin d’éviter une traction excessive afin de ne pas blesser les vaisseaux pédiculaires.
- Disséquer l’aspect proximal de l’ASIS tout en protégeant le pédicule vasculaire. Disséquer jusqu’à ce que le volet soit suffisamment mobilisé autour de son pédicule.
- Tracez le pédicule vers les vaisseaux fémoraux profonds. Squelettiser à la fois l’artère fémorale circonflexe latérale et la veine alimentant le lambeau fascial. Ligate divise ensuite les deux vaisseaux à proximité où ils rejoignent les vaisseaux fémoraux profonds.
- Canuler les vaisseaux pédiculaires individuellement avec des angiocathéters de 20 G à 24 G, fixés par des attaches en soie 3-0. Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle du lambeau jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
- Rabat radial de l’avant-bras
REMARQUE : Le protocole ci-dessous est basé sur une description publiée du modèle de lambeau radial de l’avant-bras porcin par Khachatryan et al.20.- Placez le porc sur la table d’opération en position de décubitus latéral. Placez le membre antérieur dépendant dans le champ opératoire.
- Marquez un lambeau d’environ 3 cm x 3 cm carré sur l’avant-bras radial. Tracez une ligne entre le point médian de la marge du lambeau proximal et la fosse antécubitale pour indiquer l’évolution approximative du pédicule de l’artère radiale. Confirmez le parcours artériel avec palpation.
NOTE: Dans le modèle porcin, les vaisseaux radiaux sont situés relativement plus profondément que chez l’homme. Leur emplacement est entre le piston carpi radialis et brachioradialis. - Inciser la peau à l’aide d’un scalpel à l’aspect distal avec une profondeur jusqu’au fascia antébrachial. Disséquer émoussé avec des ciseaux de ténotomie jusqu’à ce que l’artère radiale distale et ses deux veines comitantes soient rencontrées. Litruez l’artère et les veines avec des liens chirurgicaux individuellement et divisez.
- Continuez les incisions cutanées sur les marges radiales et ulnaires du carré cutané marqué. Mobiliser le lambeau de l’os radial sous-jacent avec une lame chirurgicale allant d’une direction radiale à une direction cubitale tout en soulevant le lambeau cutané proximale vers la fosse antécubitale.
REMARQUE : Maintenir un plan de dissection sous-fascial afin de s’assurer que le pédicule de l’artère radiale reste associé à la couche cutanée sus-jacente. - À la marge proximale, rétracter l’espace entre le brachioradial et le fléchisseur carpi radial à l’aide d’un rétracteur auto-retenant pour exposer l’artère radiale proximale et ses veines comitantes (Figure 2C).
- À l’aide de ciseaux de ténotomie, squelettiser l’artère radiale et les veines comitantes proximale à proximité de la fosse antécubitale où elles rejoignent respectivement l’artère brachiale et les veines. Disséquer les vaisseaux des tissus fibrogras environnants pour obtenir une longueur de pédicule suffisante d’environ 5-6 cm. Litérer et diviser l’artère et les veines séparément pour libérer le lambeau radial de l’avant-bras.
- Canuler les vaisseaux pédiculaires avec des angiocathéters de 20 G à 24 G, fixés avec des attaches en soie 3-0. Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle du lambeau jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
- Après l’obtention des volets, conserver les lambeaux dans une solution saline froide à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la décellularisation. Sous anesthésie profonde à l’isoflurane, euthanasier les animaux par injection intraveineuse de chlorure de potassium (100 mg/kg IV). Confirmer le décès par l’absence de signes vitaux.
Figure 2 : Acquisition de trois volets vascularisés porcins. (A) Aploon. Les artères gastro-épiploïques droite (i) et gauche (ii) sont canulées dans le lambeau omental (iii). (B) Tenseur fascia lata. Le pédicule du lambeau (iv) est la branche ascendante de l’artère circonflexe fémorale latérale (v). (C) Rabat radial de l’avant-bras. L’obtention du lambeau radial de l’avant-bras (vi) est basée sur l’artère radiale et la veine comitantes (vii) comme pédicule vasculaire (NOTE: Les champs ont été omis à des fins de démonstration). Barres d’échelle: 3 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Mise en place du système de décellularisation
- Assembler la chambre tissulaire avec des lambeaux dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité à flux laminaire.
- Fixez un robinet d’arrêt à trois voies aux orifices d’entrée et de sortie du bioréacteur. Fixez un filtre de 0,2 μm à l’orifice d’aération du couvercle de la chambre à tissu. Amorcez le tube d’entrée avec une solution saline héparinée stérile pour éliminer les bulles d’air.
- Placez les volets dans la chambre. À l’aide d’hémostatiques stériles, connectez les volets au tube d’entrée à l’aide du connecteur Luer mâle. Vissez la canule artérielle respective de chaque volet sur le Luer mâle et assurez-vous d’une étanchéité étanche.
- Rincer la solution saline héparinée à travers le robinet d’arrêt pour vérifier que le raccord Luer est exempt de fuites et que les volets peuvent être perfusés avec des signes d’écoulement veineux. Fermez le couvercle de la chambre de tissu.
- Connectez le tube d’entrée avec un tube de pompe jaune à trois arrêts au robinet d’arrêt d’entrée de la chambre à tissus. Fixez également un transducteur de capteur de pression en ligne au robinet d’arrêt à trois voies d’entrée pour permettre la surveillance de la pression de perfusion.
- Allumez la pompe péristaltique d’entrée. Sur l’écran initial, passez à la troisième languette à l’aide de la touche fléchée pour régler l’ID du tube sur 1,85 mm. Ensuite, passez au deuxième onglet pour définir le taux de perfusion. Débit d’entrée comme mode de livraison et réglé sur 2 mL/min. Assurez-vous que la direction de l’écoulement est correcte telle qu’affichée à l’écran. Chargez le tube de pompe à trois arrêts sur la pompe péristaltique à l’aide d’une cassette compatible.
- Répétez la procédure pour la pompe péristaltique à débit sortant comme ci-dessus. Réglez le réglage de la pompe de sortie sur une vitesse de 4 mL/min. Connectez le tube de sortie avec un tube de pompe jaune à trois arrêts au robinet d’arrêt de sortie de la chambre à tissu. Chargez le tube de pompe à trois arrêts sur la pompe péristaltique à l’aide d’une cassette compatible. Démarrez le débit des deux pompes en appuyant sur le bouton d’alimentation .
REMARQUE: Le débit plus élevé de la pompe de sortie est une mesure de sécurité cruciale pour éviter le débordement de la chambre de tissu, en veillant à ce que le débit sortant de la chambre dépasse toujours le débit entrant au cours de la décellularisation. L’ensemble de la configuration de décellularisation assemblée est illustré à la figure 3.
Figure 3 : Système assemblé de décellularisation par perfusion. (A) Schéma du système de décellularisation de perfusion. Le tube d’entrée transporte le perfusat du réservoir de détergent dans la chambre à tissu en un seul passage avec surveillance du capteur de pression. Le tube de sortie élimine activement le perfusat de la chambre à tissus dans le conteneur à déchets. Les flèches noires indiquent la direction de l’écoulement de perfusion. Une pompe péristaltique est utilisée avec la pompe gauche pour contrôler l’apport entrant. L’écoulement est activement éliminé à l’aide d’une deuxième pompe péristaltique à travers le tube respectif. Figure créée avec BioRender.com. (B) Photographie du système de décellularisation de perfusion assemblé sur la paillasse avec la pompe péristaltique d’entrée (i) reliée aux chambres tissulaires (ii) puis la pompe péristaltique de sortie (iii). La pression de perfusat d’entrée est surveillée avec un capteur de pression en ligne (iv) avant d’entrer dans la chambre à tissus. Ici, trois volets sont décellularisés en parallèle. Les réservoirs de détergent et de déchets sont sous la paillasse et ne sont pas photographiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Décellularisation des lambeaux porcins
- Effectuez toutes les étapes suivantes pour la décellularisation de la perfusion à température ambiante. Pour un résumé des taux et des durées de perfusion, voir le tableau 1. Commencer la perfusion de solution saline héparinée à 2 mL/min à l’aide d’une pompe péristaltique et perfuser les lambeaux avec une solution saline héparinée dans la chambre tissulaire pendant 15 minutes pour éliminer les caillots sanguins retenus.
- À la fin de la perfusion saline héparinisée, aspirer la solution saline résiduelle dans la chambre à tissus. Remplir la chambre tissulaire avec environ 500 mL de solution de décellularisation SDS pour submerger suffisamment le lambeau.
- Transférer le tube d’entrée dans la solution de décellularisation SDS et perfuser le tissu à 2 mL/min. La durée de la perfusion varie en fonction du lambeau ; perfuser SDS pendant 2 jours pour l’épiploon, 3 jours pour le fascia tenseur et 5 jours pour le lambeau fascio-cutané radial de l’avant-bras.
- Une fois la décellularisation de la FDS terminée, aspirer le perfusat SDS existant contenu dans la chambre tissulaire. Transférer le tube d’entrée dans 1x solution PBS et perfuser les volets pendant 1 jour à 2 mL/min.
- Retirez la solution PBS précédente et transférez le tube d’entrée dans la solution de travail DNase. Perfuser pendant 2 h à 2 mL/min. Retirez la solution de DNase de la chambre tissulaire et placez le tube d’entrée dans 1x solution PBS. Immerger les tissus avec 1x solution de PBS dans la chambre et perfuser 1x solution de PBS pendant 1 jour à 2 mL/min.
- Stérilisez les lambeaux avec une solution PAA/EtOH. Transférer le tube d’entrée dans le PAA/EtOH dans une solution dH2Oet immerger les tissus dans la même solution. Perfuse PAA/EtOH à 2 mL/min pendant 3 h. Une fois la stérilisation PAA/EtOH terminée, débranchez le tube des robinets d’arrêt à trois voies.
- Retirer les lambeaux en utilisant une technique aseptique et placer les instruments stériles dans du PBS contenant 1% d’antibiotiques/antimycotiques (A/A). Immerger les lambeaux avec PBS + 1% A/A pendant 15 min dans deux lavages séparés pour neutraliser complètement l’acide résiduel. Gardez les lambeaux dans PBS + 1% A/A à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la recellularisation.
- Vérifier la stérilité des échafaudages en effectuant une culture par écouvillonnage sur des plaques de gélose et examiner la croissance microbienne. Inoculer les plaques de gélose avec des écouvillons prélevés sur chaque surface de rabat. Culture des plaques de gélose à 37 °C jusqu’à 2 semaines. La stérilité est démontrée par l’absence de croissance de colonies microbiennes.
Tableau 1 : Résumé des paramètres du protocole de perfusion-décellularisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
6. Évaluation de la décellularisation
- À l’aide d’une biopsie à l’emporte-pièce, prélever des échantillons de 3 mm à 10 mm d’épaisseur à partir des volets.
- Pour l’histologie, fixer les biopsies dans des cassettes histologiques dans du formol tamponné normal pendant 24 h à température ambiante.
- Lavez les cassettes de biopsie dans de l’eau ou du PBS pendant 15 minutes, puis placez-les dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le traitement des tissus. Traiter les cassettes dans un processeur de tissus selon les protocoles standard.
- Incorporer les biopsies dans de la paraffine, en laissant la cire se solidifier pendant 10-15 minutes sur une plaque froide. Section de blocs de paraffine sur un microtome à 5 μm d’épaisseur. Colorer les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) selon les protocoles standard. Imagez les lames tissulaires avec la microscopie optique.
- Pour la quantification de la teneur en ADN, obtenir le poids sec des biopsies tissulaires après séchage des tissus pendant une nuit dans une étuve à 60 °C. Digérer les échantillons dans un tampon d’extraction de papaïne à 65 °C pendant une nuit. Centrifuger les échantillons digérés à 10 000 x g et transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge frais. Doser la teneur en ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial conformément aux instructions du fabricant.
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Representative Results
Ce protocole de décellularisation des lambeaux porcins vascularisés repose sur la perfusion d’un détergent à base ionique, SDS, à travers le système vasculaire du volet dans un bioréacteur de perfusion personnalisé. Avant la décellularisation, trois lambeaux vascularisés dans un modèle porcin ont été achetés et canulés en fonction de leurs principaux vaisseaux d’alimentation. Les volets ont été immédiatement rincés après l’approvisionnement afin de maintenir un système vasculaire perfusable breveté pour permettre une décellularisation réussie. À l’aide de contenants hermétiques à couvercle à pression, un bioréacteur personnalisé a été conçu pour permettre la perfusion des volets dans un environnement clos. La perfusion des volets à l’intérieur du bioréacteur a été réalisée en un seul passage à l’aide de deux pompes péristaltiques reliées à la chambre à tissu. La pression de perfusion a été surveillée à l’aide d’un capteur de pression en ligne.
Pendant la décellularisation, la durée de l’exposition aux FDS dépendait du type de tissu traité. Avec la technique de décellularisation par perfusion décrite, l’épiploon, le fascia tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras ont été décellularisés avec 0,05% de SDS pendant 2 jours, 3 jours et 5 jours, respectivement. Une stérilisation réussie après la décellularisation a été démontrée par l’absence de croissance de colonies microbiennes après l’écouvillonnage des lambeaux et la culture des écouvillons sur des plaques de gélose pendant 14 jours. Les pressions de perfusion ont été surveillées à un débit de 2 mL/min et variaient entre 20 et 60 mmHg pendant toutes les étapes de la décellularisation pour les trois volets. À la fin de la décellularisation, les lambeaux ont été rincés sous contrôle manuel et ont montré des signes d’écoulement d’une canule veineuse laissée à un drainage libre (vidéo supplémentaire 1, vidéo supplémentaire 2, vidéo supplémentaire 3).
Au total, 15 lambeaux ont été décellularisés, avec cinq répétitions pour chacun des trois types de tissus. À l’examen, la morphologie grossière des tissus natifs semblait de couleur rose (figure 4A, E, I), tandis que les tissus décellularisés étaient caractéristiquement blancs / opaques (figure 4C, G, K). L’examen histologique des tissus natifs avec H&E montre la présence de noyaux bleus (Figure 4B,F,J). Dans les lambeaux décellularisés, la coloration H&E a montré une perte de matériel cellulaire avec l’absence de coloration nucléaire bleue (Figure 4D, H, L), indiquant un échafaudage de tissu acellulaire. Une quantification supplémentaire de la teneur en ADN dans les cinq réplicats a montré une diminution statistiquement significative de l’ADN dans les échafaudages acellulaires par rapport aux tissus natifs par un test t de Student pour chaque lambeau (Figure 5). Dans l’épiploon, l’ADN est passé de 460 ng/mg ± 124 ng/mg de tissu sec dans le lambeau natif à 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg de tissu sec dans le lambeau décellularisé (n = 5, p < 0,05). Dans le fascia lata tensoriel, l’ADN a diminué de 297 ng / mg ± 68,2 ng / mg à 58,3 ng / mg ± 13,5 ng / mg entre les lambeaux natifs et décellularisés, respectivement (n = 5, p < 0,05). Le lambeau radial de l’avant-bras a montré une diminution de l’ADN de 1180 ng / mg ± 241 ng / mg dans le lambeau natif à 162 ng / mg ± 34,9 ng / mg dans le lambeau décellularisé (n = 5, p < 0,05).
Figure 4 : Décellularisation de trois volets porcins. L’examen grossier (A) de l’épiploon natif, du fascia lata tenseur (E) et (I) des lambeaux radiaux de l’avant-bras montre l’aspect rose des volets immédiatement après l’obtention. La coloration histologique des tissus natifs démontre une coloration claire de l’hématoxyline des noyaux cellulaires avec H & E (B, F, J). Après décellularisation, l’épiploon (C), le fascia lata tenseur (G) et l’avant-bras radial (K) apparaissent grossièrement blancs et opaques. Histologiquement, les trois volets décellularisés montrent une absence de coloration nucléaire avec H&E (D, H, L). Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Quantification de la teneur en ADN dans les échafaudages acellulaires. Les valeurs sont normalisées en mg de masse sèche de l’échafaudage. Des échantillons de tissus frais provenant de tissus indigènes non décellularisés (n = 5) et de tissus décellularisés (n = 5) ont été séchés et pesés avant la digestion nocturne dans la papaïne avant la quantification. Les tests statistiques ont utilisé les tests t de Student avec un niveau de signification (**) défini comme une valeur de p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1. Examen chronologique de la progression de la perfusion-décellularisation de l’épiploon à l’aide de 0,05% de dodécylsulfate de sodium sur 5 jours par examen brut (barres d’échelle = 3 cm) et histologie H & E (barres d’échelle = 200 μm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Examen chronologique de la progression de la perfusion-décellularisation du fascia lata tenseur en utilisant 0,05% de dodécylsulfate de sodium sur 5 jours par examen brut (barres d’échelle = 3 cm) et histologie H&E (barres d’échelle = 200 μm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3. Examen chronologique de la progression de la perfusion-décellularisation du lambeau radial de l’avant-bras à l’aide de dodécylsulfate de sodium à 0,05 % sur 5 jours par examen brut (barres d’échelle = 3 cm) et histologie H & E (barres d’échelle = 200 μm). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 1. Perfusion manuelle représentative du lambeau d’épiploon décellularisé via la canule artérielle (rose) démontrant l’écoulement de la canule veineuse à drainage libre (jaune). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2. Perfusion manuelle représentative du lambeau tenseur tenseur décellularisé fascia lata via la canule artérielle (rose) démontrant l’écoulement de la canule veineuse à drainage libre (bleu). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 3. Perfusion manuelle représentative du lambeau radial décellularisé de l’avant-bras via la canule artérielle (bleu) démontrant l’écoulement de la canule veineuse à drainage libre (jaune). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le protocole proposé utilise la perfusion de SDS à faible concentration pour décellulariser une gamme de lambeaux d’origine porcine. Avec cette procédure, l’épiploon acellulaire, le fascia lata tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras peuvent être décellularisés avec succès en utilisant un protocole qui favorise les SDS à faible concentration. Des expériences d’optimisation préliminaires ont déterminé que la SDS à une faible concentration (0,05%) entre 2 jours et 5 jours est capable d’éliminer le matériel cellulaire de l’épiploon, du fascia lata tenseur et du lambeau radial de l’avant-bras lorsqu’il est analysé avec des techniques histologiques (Figure supplémentaire 1, Figure supplémentaire 2, Figure supplémentaire 3). Cette méthode offre une approche simple qui permet de décellulariser dans un court laps de temps et à un coût raisonnable. D’après notre expérience, la décellularisation et la stérilisation des lambeaux porcins prennent entre 2 et 5 jours, avec une décellularisation de plus longue durée nécessaire pour les tissus ayant une plus grande densité (par exemple, peau de l’avant-bras à 5 jours vs épiploon à 2 jours). De plus, la faible concentration de FDS utilisée dans ce protocole a été choisie en partant du principe qu’une faible concentration de FDS à 0,05 % est inférieure à la concentration micellaire critique de SDS (environ 0,2 %21) et, par conséquent, permet au surfactant de solubiliser efficacement les membranes cellulaires tout en laissant intacts d’importants composants bioactifs de la MEC. L’utilisation de SDS à faible concentration dans ce protocole contraste avec l’utilisation de concentrations relativement plus élevées de SDS (p. ex. 1 %) pour la perfusion-décellularisation des lambeaux fascio-cutanés vascularisés, comme indiqué par les auteurs précédents13,22. Des concentrations élevées de SDS, bien qu’efficaces pour la décellularisation, se font au prix d’effets néfastes sur l’échafaudage ECM, tels que l’épuisement du GAG et du facteur de croissance, ainsi que la dénaturation de protéines telles que le collagène et la vimentine23,24. En effet, les travaux futurs sur la perfusion-décellularisation des lambeaux vascularisés porcins bénéficieront d’études de caractérisation supplémentaires pour examiner les effets de l’agent de décellularisation sur la MEC aux niveaux structurel et moléculaire et leurs implications pour la recellularisation en aval25,26,27 . Les tests pour les composants ECM tels que le collagène, l’élastine ou la teneur en GAG peuvent être utilisés pour évaluer quantitativement les changements de l’ECM après la décellularisation. En outre, les tests de résistance mécanique sont une modalité utile pour étudier les modifications des propriétés biomécaniques après décellularisation. Enfin, l’évaluation de la vascularité à l’aide de techniques telles que l’angiographie ou la microtomodensitométrie aidera également à caractériser l’architecture vasculaire au niveau systémique comme une condition préalable à la génération de lambeaux vascularisés perfusables28.
Plusieurs considérations techniques doivent être notées avec ce protocole. Tout d’abord, il convient de prendre des précautions extrêmes lors de la manipulation des volets et de l’assemblage du bioréacteur pour éviter une décanulation accidentelle, car la réinitialisation dans un environnement ex vivo est comparativement plus difficile. Deuxièmement, lors de l’obtention du lambeau, l’obtention d’un lambeau intact avec un pédicule vasculaire perfusable et intact est essentielle à une décellularisation réussie. Lors de l’approvisionnement, il faut veiller à ce que les points de fuite distaux dans l’échafaudage soient coupés ou attachés à la main. Cela aidera à réduire les fuites, qui peuvent provoquer une perfusion incomplète des solutions à travers le système vasculaire du volet. Une période initiale de perfusion avec une solution saline héparinée après l’obtention empêche la rétention de caillots sanguins et vérifie un système vasculaire perfusable comme en témoigne l’écoulement veineux du perfusat. Les tissus décellularisés peuvent également être rincés à nouveau à la fin de la décellularisation pour vérifier toute obstruction intravasculaire potentielle (par exemple, des débris cellulaires / embolie d’air) qui pourrait empêcher la perfusabilité du lambeau. D’après notre expérience, les lambeaux décellularisés n’ont montré aucune résistance intravasculaire au rinçage de la seringue suivant ce protocole, tandis que l’écoulement veineux a de nouveau pu être observé à partir du lambeau décellularisé après le rinçage (vidéo supplémentaire 1, vidéo supplémentaire 2, vidéo supplémentaire 3). Cela indiquait une boucle vasculaire artériel à veineuse patente avec des capillaires de connexion qui peuvent être perfusés.
Une autre considération est faite concernant les paramètres de perfusion lors de la décellularisation. Dans ce protocole, une perfusion à débit constant a été choisie avec un débit cible de 2 mL/min, ce qui se situait dans la plage des débits opératoires utilisés dans les études de décellularisation publiées précédemment sur les tissus des lambeaux porcins13,29. De plus, notre système de décellularisation intègre une capacité de surveillance de la pression en ligne en temps réel afin de surveiller les fluctuations potentielles de la résistance intravasculaire au cours de la perfusion; cette méthode peut aider à éviter les pressions de perfusion élevées résultant d’une éventuelle occlusion intravasculaire qui pourrait endommager l’ECM microvasculaire.
Enfin, la stérilisation de l’échafaudage résultant est une autre considération technique importante. Nous avons incorporé une phase de stérilisation comme dernière étape du protocole de décellularisation pour traiter la contamination environnementale accidentelle qui peut survenir pendant la décellularisation. La stérilité des lambeaux est particulièrement importante pour que les lambeaux puissent être utilisés à l’avenir pour la recellularisation. La perfusion de 0,1% d’acide peracétique/4% d’EtOH en tant que stérilisant a déjà été rapportée par des groupes pour stériliser des échafaudages acellulaires30,31 et s’est également révélée efficace avec ce protocole. La stérilité a été vérifiée en examinant les cultures d’écouvillonnages à lambeau sur des plaques de gélose et en notant une croissance absente après 14 jours d’incubation.
Le bioréacteur de perfusion personnalisé conçu pour les expériences est relativement rentable, simple et rapide à assembler. De plus, tous les composants de ce bioréacteur de perfusion sont autoclavables et adaptables aux travaux de recellularisation tout en maintenant la stérilité des volets. Le circuit personnalisé du bioréacteur peut être facilement modifié pour permettre une perfusion en circuit ouvert qui peut faire circuler des milieux de culture cellulaire à travers un échafaudage recellularisé après des expériences d’ensemencement cellulaire. Néanmoins, quelques limites du système de bioréacteur méritent d’être mentionnées. Premièrement, l’utilisation de deux pompes commerciales, bien que nécessaire pour prévenir le débordement accidentel du système, en particulier lorsque de grands volumes de perfusat sont utilisés, nuit au coût par ailleurs faible de l’installation de perfusion. De plus, le faible débit du système actuel de bioréacteur à perfusion peut présenter des défis logistiques lorsqu’il est nécessaire d’exécuter de nombreuses répétitions expérimentales en parallèle; Les systèmes à débit comparativement plus élevé développés pour la décellularisation des reins porcins32 pourraient un jour être adaptés à la décellularisation des lambeaux porcins afin d’atténuer ces défis logistiques. Enfin, bien que le bioréacteur développé soit simple à mettre en place, la supervision humaine et le fonctionnement manuel sont toujours nécessaires régulièrement et fréquemment pour s’assurer qu’aucun dysfonctionnement du système ne se produit. Des modifications au bioréacteur intégrant des capacités d’automatisation permettant à la fois de surveiller et de réajuster les performances du bioréacteur avec une intervention humaine minimale ou nulle peuvent être poursuivies afin de faire progresser la technologie des bioréacteurs de perfusion-décellularisation à l’avenir33,34.
La principale application des lambeaux décellularisés est de permettre la recellularisation ultérieure de ces échafaudages acellulaires avec des populations cellulaires qui peuvent régénérer le système vasculaire. Bien que de nombreuses recherches futures soient nécessaires pour déterminer le nombre de cellules, les populations, les stratégies d’ensemencement et les conditions du bioréacteur appropriés pour régénérer les tissus vascularisés fonctionnels et viables, ce protocole représente le travail fondamental initial vers cet objectif. Les futures méthodes de recellularisation aideront à établir des stratégies pour concevoir des lambeaux de tissus mous avec un réseau vasculaire perfusable intact et contribueront à la régénération potentielle de tissus composites plus complexes, tels que les allogreffes des extrémités et du visage. Ces échafaudages peuvent un jour contourner la morbidité et l’immunosuppression du site donneur pour les patients subissant une reconstruction à grande échelle des tissus mous, améliorant ainsi leurs résultats cliniques et leur qualité de vie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Aucun
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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